茉莉花香氣相關(guān)基因JsTPS啟動(dòng)子的克隆與活性分析

林俊杰 李小婷 陳雪津 崔萌 吉玉婷 葉乃興 陳桂信

摘 ?要：以茉莉（Jasminum sambac）的花苞為材料，采用染色體步移技術(shù)，分離出JsTPS基因的5端調(diào)控序列，對(duì)該啟動(dòng)子序列進(jìn)行順式作用元件預(yù)測。根據(jù)茉莉花TPS基因啟動(dòng)子的順式作用元件分布，擴(kuò)增出5個(gè)不同片段長度的啟動(dòng)子，分別命名為JsTPS-1（494 bp）、JsTPS-2（689 bp）、JsTPS-3（1016 bp）、JsTPS-4（1466 bp）和JsTPS-5（2040 bp），應(yīng)用GATEWAY技術(shù)，構(gòu)建5個(gè)不同長度融合GUS基因的植物表達(dá)載體，用農(nóng)桿菌GV3101侵染煙草葉片，對(duì)轉(zhuǎn)化后的煙草葉片進(jìn)行GUS染色。檢測不同片段長度啟動(dòng)子活性，找出該啟動(dòng)子的關(guān)鍵活性區(qū)域，對(duì)其功能進(jìn)行初步分析，序列分析結(jié)果表明：克隆得到的JsTPS啟動(dòng)子序列長度為2040 bp，該序列包含TATA-box、G-box、CAAT-box等啟動(dòng)子核心元件、光響應(yīng)元件（ACE、ATCT-motif、Box 4、3-AF1 binding site、G-Box、Sp1和GT1-motif）和激素響應(yīng)元件[茉莉酸甲酯響應(yīng)元件（TGACG-motif、CGTCA-motif）、ABRE脫落酸響應(yīng)元件、生長素響應(yīng)元件（TGA-box、TGA-element）、水楊酸響應(yīng)元件（TCA-element）、赤霉素響應(yīng)元件（GARE-motif）]等，說明該基因的表達(dá)可能受到光照、激素（ABA、生長素、茉莉酸、茉莉酸甲酯和水楊酸）的誘導(dǎo)。GUS染色結(jié)果表明：其JsTPS-1啟動(dòng)子幾乎不染色，JsTPS-2染色相對(duì)較弱，而JsTPS-3的染色程度高于JsTPS-4、JsTPS-5，且是5個(gè)不同缺失片段中染色最深的片段;GUS酶活性檢測結(jié)果顯示，不同缺失片段長度酶活性與染色結(jié)果一致，JsTPS-1的GUS酶活性最低，隨著啟動(dòng)子片段加長，GUS酶活性增強(qiáng)，在片段長度為JsTPS-3時(shí)酶活性最強(qiáng)，在JsTPS-4、JsTPS-5片段長度，GUS酶活下降。JsTPS啟動(dòng)子至少包括–788～0 bp這段區(qū)域才能驅(qū)動(dòng)JsTPS起始轉(zhuǎn)錄，相比較其他片段，發(fā)現(xiàn)在–1016～0 bp區(qū)域時(shí)啟動(dòng)子的活性表現(xiàn)最強(qiáng)。推測可能在–1016～–689 bp中含有水楊酸響應(yīng)（TCA-element）、光響應(yīng)（3-AF1 binding site）等元件增強(qiáng)啟動(dòng)子的活性，而在–1466～–1016 bp中含有赤霉素負(fù)調(diào)控響應(yīng)元件減弱JsTPS啟動(dòng)子的活性。本研究為進(jìn)一步開展調(diào)控茉莉花香氣釋放研究提供理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：茉莉花;萜類合成酶;啟動(dòng)子;順式作用元件;啟動(dòng)子活性

中圖分類號(hào)：S685.16 ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Cloning and Activity Analysis of JsTPS Promoter of Jasminum sambac Aroma Related Gene

LIN Junjie， LI Xiaoting， CHEN Xuejin， CUI Meng， JI Yuting， YE Naixing*， CHEN Guixin*

College of Horticulture， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian 350002， China

Abstract： Jasmine （Jasminum sambac） bud was used as the material， and the chromosome walking technology was used to isolate the 5 end regulatory sequence of JsTPS， and predict the promoter cis-acting element for this sequence. According to the cis-acting element distribution of the TPS gene promoter in jasmines， 5 promoters with different fragment lengths were amplified， named JsTPS-1 （494 bp） and JsTPS-2 （689 bp） ， JsTPS-3 （1016 bp）， JsTPS-4 （1466 bp） and JsTPS-5 （2040 bp）， then 5 plant expression vectors with different fragment lengths fused with GUS gene by GATEWAY technology were constructed. Tobacco leaves were infected with GV3101 Agrobacterium to perform Gus staining. Sequence analysis showed that the sequence length of the cloned JsTPS promoter was 2040 bp. It contained the core elements of the promoter such as TATA-box， G-box， CAAT-box and light response elements （ACE，ATCT-motif， Box 4， 3-AF1 binding site， G-Box， Sp1 and GT1-motif）， hormone-related response elements such as methyl jasmonate response Element （TGACG-motif， CGTCA-motif）， ABRE abscisic acid response element， auxin response element （TGA-box， TGA-element）， salicylic acid response element （TCA-element）， gibberellin response element （GARE-motif）， etc.， which indicating that the expression of this gene may be induced by light and hormones （ABA， auxin， jasmonic acid， methyl jasmonate and salicylic acid）. The results of GUS staining showed that the JsTPS-1 promoter hardly stained， and the staining of JsTPS-2 was relatively weak. The staining degree of JsTPS-3 was higher than that of JsTPS-4 and JsTPS-5， and it was stained in five deepest deletion fragments. According to the GUS enzyme activity test results， the enzyme activity results of different missing fragment lengthswere consistent with the staining results. The GUS enzyme activity of JsTPS-1 was the lowest. As the promoter fragment lengthened， the GUS enzyme activity increased. When the fragment length was JsTPS-3， the activity was the strongest. The JsTPS promoter must include at least –788 bp to 0 bp to drive initiate transcription. Compared with other fragments， it is found that the promoter activity is the strongest in the region of –1016 bp to 0 bp. It is speculated that –1016 bp to –689 bp may contain salicylic acid response （TCA-element）， light response （3-AF1 binding site） and other elements to enhance promoter activity， while –1466 bp to –1016 bp contains gibberellin negative regulatory response elements to weaken the activity of the JsTPS promoter. The study would provide a theoretical basis for further research on regulating aroma release of jasmine.

Keywords： Jasminum sambac; terpene synthase; promoter; cis-acting elemen; promoter activity

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2022.01.006

茉莉花[Jasminum sambac （L.） Ait.]是木犀科素馨屬的花卉，原產(chǎn)印度，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。茉莉用途廣泛，是一種重要的香料作物，花朵可用于窨制花茶、制作香水和提取精油等。茉莉花萃取香氣的方法有很多，比如PRAGADHEESH等[1]和李麗華等[2]通過固相微萃?。⊿PME）等方法可萃取茉莉花香氣成分，而在茉莉花當(dāng)中芳香化合物[3-4]成分中主要有萜烯類化合物、酯類、酸類、醇類和酮類及其他化合物等，其中成分含量最高的是酯類，其次是萜烯類化合物，而α-法尼烯則是萜烯類化合物中含量最多的一類。根據(jù)報(bào)道，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)兩條合成途徑合成萜烯類化合物，其中一條為甲羥戊酸途徑（MEV），生成三萜和倍半萜類化合物如α-法尼烯等;另一條為甲基赤蘚醇磷酸（methylerythritol phosphate， MEP）途徑，合成多種單萜和雙萜化合物[5]。

萜類合成酶（TPS）是MEV途徑的末端酶類，它們都能夠催化FPP和GPP生成萜烯類化合物，在TPS家族中包括了7個(gè)亞家族，其中含有一個(gè)α-法尼烯合成途徑的分支[6-7]。由于TPS基因家族的多樣性，并且TPS基因是倍半萜和三萜等特類化合物合成最下游的基因，導(dǎo)致了萜類芳香物質(zhì)的豐富多樣性，在植物芳香物質(zhì)的合成中起到了重要作用[8]。在植物香氣調(diào)控研究中，已經(jīng)在佛手[9]、臘梅[10]、百合[11]、桂花[12-13]、茶樹[14]中分離出TPS家族基因并對(duì)該類基因調(diào)控芳香性物質(zhì)進(jìn)行了較深入的研究。萜類合成酶不僅在香氣物質(zhì)合成起到了關(guān)鍵作用，這些萜類合成酶通過基因調(diào)控參與合成并釋放萜類物質(zhì)來抵抗外界的脅迫以及病蟲害等，研究中發(fā)現(xiàn)，在植物中TPS基因?qū)ν饨缑{迫具有調(diào)控作用[15]。前人對(duì)茉莉花香氣成分有了大量的研究分析，但對(duì)于這些調(diào)控基因的功能進(jìn)行深入驗(yàn)證的研究比較少。TPS是合成倍半萜α-法尼烯最下游的關(guān)鍵酶類，目前只有關(guān)于其基因的分析報(bào)道，對(duì)啟動(dòng)子方面還未有研究，茉莉花的產(chǎn)香機(jī)制還未有透徹的研究。研究TPS基因啟動(dòng)子在茉莉花香氣中的作用為改良茉莉品質(zhì)及遺傳提供理論基礎(chǔ)。

本研究以雙瓣茉莉?yàn)椴牧希捎萌旧w步移技術(shù)，分離出JsTPS基因的5端上游調(diào)控序列，對(duì)該序列進(jìn)行啟動(dòng)子進(jìn)行順式作用元件預(yù)測，應(yīng)用Gateway技術(shù)，構(gòu)建5個(gè)不同片段長度的5端調(diào)控序列融合GUS基因的植物表達(dá)載體，用農(nóng)桿菌GV3101侵染煙草葉片，建立瞬時(shí)表達(dá)體系，對(duì)轉(zhuǎn)化的煙草葉片進(jìn)行GUS染色，檢測不同片段長度5端調(diào)控序列的活性，找出該啟動(dòng)子的關(guān)鍵活性區(qū)域。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

1.1.1 ?試驗(yàn)材料 ?以福建農(nóng)林大學(xué)茉莉花種植資源圃的茉莉花為材料。采摘盛花時(shí)期的茉莉花朵用液氮速凍，研磨成粉末狀，–80℃保存?zhèn)溆谩ateway載體pDNOR207、pMDC163和本氏煙草種子由本課題組提供。

1.1.2 ?試劑 ?多糖多酚植物基因組DNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（北京天根）、Genome Walking Kit（TaKaRa）、Mach1-T1、pBM16A-T（北京博邁德）、農(nóng)桿菌GV3101（北京全式金）、GUS染色試劑盒（北京中科瑞泰）。

1.2 ?方法

1.2.1 ?茉莉花JsTPS基因啟動(dòng)子的擴(kuò)增 ?根據(jù)JsTPS基因序列，設(shè)計(jì)3條特異性引物（表1），分別命名為JsTPS-SP1、JsTPS-SP2、JsTPS-SP3。以基因組DNA為模板，參照Genome Walking kit試劑盒染色體步移步驟，連續(xù)3輪PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物連接pBM16A-T載體并轉(zhuǎn)化Mach1-T1感受肽，菌液驗(yàn)證正確后送至上海尚亞生物技術(shù)有限公司測序，將獲得的啟動(dòng)子序列用PlantCARE軟件進(jìn)行順式作用元件預(yù)測。

1.2.2 ?JsTPS基因啟動(dòng)子缺失片段載體構(gòu)建 ?根據(jù)JsTPS啟動(dòng)子順式作用元件預(yù)測結(jié)果，按順式作用元件位置設(shè)計(jì)5個(gè)不同長度的啟動(dòng)子5端缺失片段，分別在5端ATG上游494、689、1016、1466、2040 bp處設(shè)計(jì)特異性引物作為上游引物，分別命名為qJsTPS-F1、qJsTPS-F2、qJsTPS-F3、qJsTPS-F4、qJsTPS-F5，以qJsTPS-R為下游引物（表2），并在引物前加上能與載體特

異性結(jié)合的attB接頭引物。將擴(kuò)增后的產(chǎn)物在BP酶的作用下構(gòu)建到入門載體pDONR207上，結(jié)果正確的再通過LR酶構(gòu)建到表達(dá)載體pMDC163上，將檢測正確的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101。

1.2.3 ?農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化本氏煙草與GUS染色分析 ?將構(gòu)建成功的5個(gè)不同片段pMDC163-JsTPS表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌GV3101中，PCR菌液驗(yàn)證后擴(kuò)大培養(yǎng)，OD600值為0.8左右，將培養(yǎng)基更換為重懸緩沖液[10 mmol/L MES-KOH（pH 5.6、10 mmol/L MgCl2、150 μmol/L乙酰丁香酮]，調(diào)整OD600值為0.8左右，室溫靜置3～5 h后，將其注射到生長4周左右的本氏煙草葉片中，暗培養(yǎng)1 d正常培養(yǎng)1 d后備用。

取侵染后的煙草葉片進(jìn)行GUS染色，將煙草葉片剪成若干個(gè)邊長為0.5 cm的方塊浸沒在GUS染液中，37℃避光培養(yǎng)12 h左右，之后將材料轉(zhuǎn)入95%無水乙醇中脫色2～3次，至陰性對(duì)照材料為白色，且出現(xiàn)的藍(lán)色底物不再褪色，在激光共聚焦顯微鏡FV1200下對(duì)注射的葉片進(jìn)行鏡檢。

根據(jù)Bradford蛋白濃度測定試劑盒的說明書進(jìn)行煙草葉片的總蛋白提取及濃度測定。根據(jù)GUS基因定量檢測試劑盒的方法和熒光分光光度計(jì)檢測GUS基因的活性。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?JsTPS啟動(dòng)子的分離與順式作用元件分析

以茉莉花DNA為模板，通過染色體步移技術(shù)和測序確定獲得1條2040 bp的啟動(dòng)子序列（圖1）。將啟動(dòng)子序列導(dǎo)入PlantCARE網(wǎng)站后，對(duì)其順式作用元件進(jìn)行預(yù)測，部分元件結(jié)果顯示（圖2、表3）：該序列含有關(guān)鍵啟動(dòng)子核心元件如TATA-box、G-box、CAAT-box等;其中還主要包含了一些激素和環(huán)境相關(guān)的響應(yīng)元件，如：光響應(yīng)元件（ACE、ATCT-motif、Box 4、3-AF1 binding site、G-Box、Sp1、GT1-motif）、茉莉酸甲酯響應(yīng)元件（TGACG-motif、CGTCA-motif）、脫落酸響應(yīng)元件（ABRE）、生長素響應(yīng)元件（TGA-box、TGA-element）、水楊酸響應(yīng)元件（TCA-element）、赤霉素響應(yīng)元件（GARE-motif）、無氧誘導(dǎo)所必需的順式作用調(diào)節(jié)元件ARE、能與MYB結(jié)合的位點(diǎn)CCAAT-box等。根據(jù)這些功能元件，可初步推測JsTPS啟動(dòng)子在茉莉花的生長發(fā)育過程中，主要受環(huán)境和激素的調(diào)控。

2.2 ?JsTPS啟動(dòng)子缺失片段的擴(kuò)增

根據(jù)JsTPS啟動(dòng)子順式作用預(yù)測結(jié)果，設(shè)計(jì)5個(gè)不同缺失啟動(dòng)子片段，本研究根據(jù)JsTPS啟動(dòng)子的順式作用元件分析預(yù)測結(jié)果，通過構(gòu)建5個(gè)不同缺失程度的啟動(dòng)子片段，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增（圖3），分別命名為：JsTPS-1（494 bp）、JsTPS-2（689 bp）、JsTPS-3（1016 bp）、JsTPS-4（1466 bp）和JsTPS-5（2040 bp）。JsTPS-1保留了部分響應(yīng)元件如GARE-motif赤霉素響應(yīng)元件、Box 4光響應(yīng)元件、CGTCA-motif和TGACG-motif茉莉酸甲酯響應(yīng)元件、ABRE脫落酸響應(yīng)元件、TGA- element生長素反應(yīng)元件等;JsTPS-2中多了2個(gè)跟光有關(guān)的調(diào)控元件（BOX-4和G-box）、1個(gè)TGA-box生長素調(diào)節(jié)元件;JsTPS-3中增加了水楊酸參與調(diào)控的響應(yīng)元件（TCA-element）、光響應(yīng)元件（3-AF1 binding site）等;啟動(dòng)子片段JsTPS-4中增加了光反應(yīng)元件（ACE、ATCT- motif）、赤霉素響應(yīng)元件（TATC-box）;在JsTPS-5中增加了脫落酸響應(yīng)元件（ABRE）和光相關(guān)調(diào)控元件（GT1-motif）。

2.3 ?JsTPS啟動(dòng)子缺失片段載體的構(gòu)建

利用Gateway技術(shù)，將擴(kuò)增產(chǎn)物5個(gè)缺失目的片段通過BP反應(yīng)構(gòu)建到入門載體pDONR207上，在通過LR反應(yīng)重組置換到pMDC163植物表達(dá)載體上，菌液驗(yàn)證結(jié)果如圖4顯示，成功構(gòu)建5個(gè)不同缺失片段的植物表達(dá)載體。將其結(jié)果分別命名為pMDC163-JsTPS-1、pMDC163-JsTPS-2、pMDC163-JsTPS-3、pMDC163-JsTPS-4、pMDC163- JsTPS-5。

2.4 ?農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化煙草與GUS染色分析

將構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，并注射煙草，為了研究侵染煙草后該基因啟動(dòng)子不同缺失片段在表達(dá)上的差異，對(duì)其進(jìn)行GUS染色，結(jié)果如圖所示（圖5）：在不同啟動(dòng)子缺失片段的瞬時(shí)表達(dá)中，煙草葉片呈現(xiàn)不同程度的染色情況。在含有pMDC163-JsTPS-1的煙草葉片中，3個(gè)生物重復(fù)只有1個(gè)葉片有非常微弱的淺藍(lán)色斑點(diǎn)，其他葉片則沒有發(fā)現(xiàn)染色情況;含pMDC163- JsTPS-2的葉片中，在顯微鏡中能觀察到稀疏分散的藍(lán)色斑點(diǎn)，且斑點(diǎn)多數(shù)分布在葉脈周圍。而侵染進(jìn)pMDC163-JsTPS-3基因的煙草葉片用肉眼可直觀地觀察到葉片完全染色，且呈深藍(lán)色;而在含有pMDC163-JsTPS-4和pMDC163-JsTPS-5的煙草葉片GUS染色結(jié)果顯示，可以觀察到均勻的藍(lán)色，但染色程度沒有pMDC163-JsTPS-3的深，只有在葉脈周圍分布深藍(lán)色斑點(diǎn)。

在GUS酶活性測定中（圖6）JsTPS-1的GUS酶活最低，隨著啟動(dòng)子片段加長，GUS酶活性增強(qiáng)，在片段長度為JsTPS-3時(shí)酶活性最強(qiáng)，在JsTPS-4、JsTPS-5時(shí)，GUS酶活下降。結(jié)合順式作用元件預(yù)測結(jié)果，TATA-box集中在–788～0 bp區(qū)域內(nèi)，而JsTPS-1啟動(dòng)子片段長度僅483 bp且該啟動(dòng)子沒有出現(xiàn)轉(zhuǎn)錄活性，JsTPS-2啟動(dòng)子只出現(xiàn)微弱的啟動(dòng)活性，說明TATA-box是JsTPS起始轉(zhuǎn)錄的必須元件，在JsTPS啟動(dòng)子中至少要包括–788～0 bp這段區(qū)域才能驅(qū)動(dòng)JsTPS起始轉(zhuǎn)錄。JsTPS-3啟動(dòng)子（1016 bp）啟動(dòng)子活性最強(qiáng)，說明在–1016～–689 bp中可能含有增強(qiáng)啟動(dòng)子活性的關(guān)鍵元件，能啟動(dòng)GUS基因高度表達(dá)，并且與其他片段的啟動(dòng)子有明顯差異。隨著片段變長，JsTPS-4、JsTPS-5啟動(dòng)子的活性出現(xiàn)下調(diào)現(xiàn)象，說明在–1466～–1016 bp中含有負(fù)調(diào)控元件減弱JsTPS啟動(dòng)子活性。根據(jù)順式作用元件預(yù)測結(jié)果，水楊酸響應(yīng)元件（TCA- element）、光響應(yīng)元件（3-AF1 binding site）可能具有增強(qiáng)JsTPS的啟動(dòng)子活性的功能。

3 討論

啟動(dòng)子包含了許多能夠響應(yīng)基因表達(dá)的關(guān)鍵調(diào)控元件，啟動(dòng)子的順式作用元件預(yù)測對(duì)研究基因在植物體內(nèi)調(diào)控表達(dá)具有重要作用。為進(jìn)一步探究啟動(dòng)子的功能、活性，通常構(gòu)建啟動(dòng)子缺失片段植物表達(dá)載體，通過在植物上瞬時(shí)表達(dá)或者穩(wěn)定遺傳表達(dá)，研究該基因啟動(dòng)子的組織特異性和啟動(dòng)子活性區(qū)域。本試驗(yàn)通過克隆獲得茉莉花JsTPS啟動(dòng)子序列，并預(yù)測其順式作用元件，通過瞬時(shí)表達(dá)找出啟動(dòng)子的活性區(qū)域，對(duì)其功能進(jìn)一步分析鑒定。

通過克隆獲得JsTPS 5端上游調(diào)控序列，順式作用元件預(yù)測結(jié)果表明，該基因啟動(dòng)子序列含有關(guān)鍵啟動(dòng)子核心元件如TATA-box、CAAT-box、G-Box等，還包含了與激素、光相關(guān)的響應(yīng)元件，說明該基因可能受光照條件和激素的影響。在對(duì)青蒿[16]的TPS啟動(dòng)子研究中發(fā)現(xiàn)，該植物TPS基因啟動(dòng)子受茉莉酸和脫落酸的調(diào)控。在其他植物中如鐵皮石斛[17]、百合[11]等多數(shù)都含有晝夜規(guī)律調(diào)控的元件，但未在茉莉花JsTPS啟動(dòng)子中預(yù)測到該功能元件，并且JsTPS中也還未預(yù)測到跟逆境脅迫相關(guān)的順式作用元件。研究發(fā)現(xiàn)，激素響應(yīng)的元件可以間接參與調(diào)控植物的脅迫反應(yīng)， MARIANGELA等[18]通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，沉默TPS基因的植物顯示出與對(duì)照組有不同組成的揮發(fā)物釋放，從而減少蚜蟲吸引力。許多單萜類物質(zhì)具有抗氧化性也說明了TPS基因可能間斷地參與了植物生長歷程中抗逆脅迫的調(diào)控。因此JsTPS可能參與調(diào)控茉莉花基因抗逆性和香氣物質(zhì)產(chǎn)生，是否受各類激素的調(diào)控，還需要進(jìn)一步對(duì)JsTPS基因進(jìn)行功能驗(yàn)證。

本研究運(yùn)用JsTPS啟動(dòng)子順式作用元件的預(yù)測分布情況，構(gòu)建出了5個(gè)不同長度啟動(dòng)子融合植物表達(dá)載體，再轉(zhuǎn)化煙草葉片，讓外源基因JsTPS瞬時(shí)表達(dá)在植物葉片上。GUS染色和活性檢測結(jié)果顯示，插入最短片段的啟動(dòng)子幾乎沒有出現(xiàn)染色的情況，說明–493～0 bp啟動(dòng)子片段活性低，之后隨著JsTPS啟動(dòng)子長度的增長，啟動(dòng)子活性增強(qiáng)。根據(jù)預(yù)測的TATA-box元件位置在–782～0 bp之間，研究發(fā)現(xiàn)該元件對(duì)基因的起始轉(zhuǎn)錄起到重要作用，可能由于片段JsTPS-1和JsTPS-2沒有包含該核心啟動(dòng)元件所以顯示出微弱的染色情況，但隨著長度越長，轉(zhuǎn)錄表達(dá)的活性就越來越高。插入外源基因JsTPS-3的植株染色結(jié)果表示，肉眼可直觀觀察到該片段啟動(dòng)子GUS染色顏色比前2個(gè)片段顏色深，而TATA-box元件都定位在JsTPS-3內(nèi)，所以判斷TATA-box是JsTPS基因起始轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵元件之一。結(jié)合JsTPS啟動(dòng)子的GUS基因酶活性檢測結(jié)果，與GUS染色的結(jié)果一致，在不同片段長度的啟動(dòng)子中JsTPS-3的酶活表達(dá)最高，染色最深，所以判斷JsTPS-3具有強(qiáng)啟動(dòng)子活性的區(qū)域或元件。而在pMDC163- JsTPS-4和pMDC163-JsTPS-5的GUS染色和酶活性檢測中發(fā)現(xiàn)，這2個(gè)區(qū)域的啟動(dòng)子活性沒有pMDC163-JsTPS-3啟動(dòng)子活性高，pMDC163- JsTPS-4和全長片段的啟動(dòng)子GUS活性表達(dá)量基本一樣。在刺梨[19]的GGP啟動(dòng)子研究中發(fā)現(xiàn)全長片段比缺失片段的啟動(dòng)子活性強(qiáng)，推測–1949～ 2089 bp是具有增強(qiáng)啟動(dòng)活性的區(qū)域，第二個(gè)缺失片段長度的啟動(dòng)子表達(dá)量出現(xiàn)下調(diào)的現(xiàn)象，說明在該區(qū)域出現(xiàn)減弱啟動(dòng)子活性的負(fù)調(diào)控區(qū)域或元件。該研究結(jié)果與本研究相似，依此推斷在pMDC163-JsTPS-3到pMDC163-sTPS-4之間的區(qū)域，即–1016～–1466 bp片段內(nèi)含有負(fù)調(diào)控作用的元件。在構(gòu)建啟動(dòng)子缺失片段載體時(shí)候JsTPS-3比前2個(gè)片段增加了水楊酸參與調(diào)控的響應(yīng)元件（TCA-element）、光響應(yīng)元件（3-AF1 binding site），該啟動(dòng)子的啟動(dòng)活性明顯高于前2個(gè)片缺失片段，所以本研究推斷水楊酸響應(yīng)元件和3-AF1光響應(yīng)元件可能增強(qiáng)啟動(dòng)子高表達(dá)。隨著片段變長，JsTPS-4、JsTPS-5啟動(dòng)子的活性出現(xiàn)下調(diào)現(xiàn)象，JsTPS-4增加了一個(gè)TATC-ox赤霉素響應(yīng)元件，沒有啟動(dòng)活性的JsTPS-1也包含了一個(gè)TATC-box赤霉素響應(yīng)元件，說明TATC-box赤霉素響應(yīng)元件可能抑制JsTPS啟動(dòng)子活性。

在崔萌等[20]的研究中發(fā)現(xiàn)，JsGDS啟動(dòng)子不同的片段長度、元件缺失或增加都可能導(dǎo)致其在植物不同組織中的表達(dá)活性，導(dǎo)致功能性不同。在白樺[21]JMJ18啟動(dòng)子活性檢測中發(fā)現(xiàn)，在瞬時(shí)轉(zhuǎn)化表達(dá)的組培苗中不同部位都具有GUS染色情況，證明該基因在植物各組織內(nèi)都能表達(dá)并發(fā)揮功能。因此需要對(duì)JsTPS啟動(dòng)子進(jìn)行組織表達(dá)活性試驗(yàn)，更近一步探究啟動(dòng)子在茉莉花中的功能。目前研究啟動(dòng)子組織特異性的方法除了通過穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化到煙草、擬南芥等模式植物中，有的通過原體組培苗上瞬時(shí)表達(dá)就可以進(jìn)行研究，這種方法相比前者周期更短，能夠快速鑒定啟動(dòng)子的功能活性以及組織特異性。

綜上所述，本研究克隆獲得的JsTPS 5端上游調(diào)控序列，順式作用元件預(yù)測發(fā)現(xiàn)JsTPS基因啟動(dòng)子含有與多種激素、光相關(guān)的響應(yīng)元件。GUS染色結(jié)果與酶活性檢測表明，JsTPS啟動(dòng)子至少包括–788～0 bp這段區(qū)域才能驅(qū)動(dòng)JsTPS起始轉(zhuǎn)錄，相比較其他片段，發(fā)現(xiàn)在–1016～0 bp區(qū)域時(shí)啟動(dòng)子的活性表現(xiàn)最強(qiáng)。推測可能在–1016～–689 bp區(qū)域內(nèi)的水楊酸響應(yīng)（TCA-element）、光響應(yīng)（3-AF1 binding site）等元件增強(qiáng)啟動(dòng)子的活性，而在–1466～～1016 bp區(qū)域中含有赤霉素負(fù)調(diào)控響應(yīng)元件從而減弱JsTPS啟動(dòng)子的活性。本實(shí)驗(yàn)探究了JsTPS啟動(dòng)子的基礎(chǔ)功能，但對(duì)JsTPS基因啟動(dòng)子的一些元件是否發(fā)揮作用還未進(jìn)一步確定，所以還需要對(duì)植物進(jìn)行不同處理來研究激素在JsTPS啟動(dòng)子中的調(diào)控作用，以及這些響應(yīng)元件在JsTPS啟動(dòng)子的功能。

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