木爾坦棉花曲葉病毒RPA快速檢測方法的建立

湯亞飛 李正剛 佘小漫 于琳 藍國兵 何自福

摘要

木爾坦棉花曲葉病毒Cotton leaf curl Multan virus （CLCuMuV）引起的病害是世界棉花生產(chǎn)上的毀滅性災(zāi)害，也是我國進境植物檢疫性有害生物之一。因此，建立快速檢測技術(shù)對CLCuMuV的檢疫和防控具有重要意義。本研究根據(jù)CLCuMuV外殼蛋白（CP）基因序列設(shè)計引物，建立了該病毒的重組酶聚合酶等溫擴增（recombinase polymerase amplification，RPA）檢測方法，并評價了該方法的靈敏度和特異性，進一步測定了對田間疑似病樣的檢測準(zhǔn)確性。結(jié)果表明，建立的RPA檢測方法僅能從感染CLCuMuV的樣品中擴增出目的條帶，而感染同屬的其他5種病毒的樣品中未擴增出目的條帶。該方法檢測靈敏度是常規(guī)PCR的10倍，且對田間疑似病樣的檢出結(jié)果與PCR試驗結(jié)果一致。因此，本研究所建立的CLCuMuV RPA快速檢測方法具有特異、靈敏、準(zhǔn)確、操作簡便、無需特殊設(shè)備等優(yōu)點，這些為CLCuMuV的快速檢測提供了一種新技術(shù)。

??關(guān)鍵詞

木爾坦棉花曲葉病毒;RPA;快速檢測

中圖分類號：

S436.418

文獻標(biāo)識碼：A

DOI：10.16688/j.zwbh.2020677

Establishment of RPA for rapid detection of Cotton leaf curl Multan virus

TANG Yafei，LI Zhenggang，SHE Xiaoman，YU Lin，LAN Guobing，HE Zifu*

（Research Institute of Plant Protection， Guangdong Academy of Agricultural Sciences; Guangdong

Provincial Key Laboratory of High Technology for Plant Protection， Guangzhou510640， China）

Abstract

Cotton leaf curl Multan virus （CLCuMuV） causes destructive diseases in cotton crops worldwide， which is a quarantine organism subjected to phytosanitary regulations in China. The rapid detection technique is very important for the quarantine and control of CLCuMuV. In this study， a recombinase polymerase amplification （RPA） detection method was established based on the coat protein （CP） gene sequence of CLCuMuV. The sensitivity and specificity of this method were evaluated. The accuracy of this method was determined by detecting the suspected samples in fields. The results showed that the established RPA detection method amplified the target fragment only from CLCuMuVinfected samples， and no fragment was amplified from the samples infected by other five viruses belonging to the same genus with CLCuMuV. The sensitivity of the established RPA detection method was 10fold higher than that of the conventional PCR. The RPA detection results of suspected diseased samples in fields were consistent with the PCR results. Therefore， the rapid CLCuMuV RPA detection method was established in this study， characterized by high specificity， sensitivity， accuracy， easiness to operate， and no requirement for special equipment. It provides a new technique for rapid detection of CLCuMuV.

Key words

Cotton leaf curl Multan virus;RPA;rapid detection

木爾坦棉花曲葉病毒Cotton leaf curl Multan virus（CLCuMuV）屬雙生病毒科Geminiviridae菜豆金色花葉病毒屬Begomovirus成員[1]，由煙粉虱Bemisia tabaci以持久方式傳播，可嫁接傳播，但不能通過機械摩擦和種子帶毒傳播。CLCuMuV最先發(fā)現(xiàn)于巴基斯坦木爾坦地區(qū)，是20世紀(jì)90年代引起巴基斯坦棉花曲葉病大流行的主要病原[2- 4]。2006年，我國首次在廣東的朱槿Hibiscus rosasinensis上檢測到CLCuMuV[5]。目前，該病毒已擴散到廣西[6 -7]、海南[8]、云南[9]、福建[10]、江蘇[11]、新疆等地，侵染朱槿[5，7，10- 11]、紅麻H.cannabinus[8]、黃秋葵Abelmoschus esculentus[12]、陸地棉Gossypium hirsutum[6，13]、垂花懸鈴花Malvaviscus penduliflorus[14]、玫瑰茄H.sabdariffa[15]等多種錦葵科Malvaceae植物。

棉花是重要的纖維作物，在我國國民經(jīng)濟和社會發(fā)展中占有重要的地位。我國是世界上最大的棉花生產(chǎn)國和消費國。棉花曲葉病是世界棉花生產(chǎn)上最具毀滅性的病毒病害。雖然目前我國長江流域、黃河流域和西北內(nèi)陸三大棉區(qū)尚未發(fā)生棉花曲葉病，但能引起該病害的病原CLCuMuV已在我國多地危害多種錦葵科作物，尤為重要的是，華南地區(qū)已出現(xiàn)由該病毒侵染引起的棉花曲葉病[6，13]，再加上其傳播介體煙粉虱在我國各地普遍發(fā)生，CLCuMuV極有可能導(dǎo)致棉花曲葉病在我國暴發(fā)和流行。我國在首次檢測到CLCuMuV后，立即將其列入中國進境植物檢疫性有害生物名錄，確定為一種檢疫性病害，依法對其實施檢疫。任何植物病毒病診斷、防治和預(yù)測預(yù)報都需快速、靈敏和特異的檢測方法。因此，建立快速準(zhǔn)確CLCuMuV檢測技術(shù)是阻止該病毒傳播與擴散的前提，即對預(yù)警該病毒侵染引致棉花曲葉病在我國棉區(qū)暴發(fā)和流行有重要意義。

重組酶聚合酶擴增技術(shù)（recombinase polymerase amplification，RPA）是Piepenburg等研發(fā)出的一種等溫核酸擴增技術(shù)[16]。該技術(shù)原理是：在恒溫（25～43℃）條件下，重組酶（recombinase）與引物核苷酸結(jié)合形成聚合體，并促使引物與模板DNA序列進行配對;在堿基序列互補配對時，單鏈DNA結(jié)合蛋白（single strand binding protein）促使模板DNA打開雙鏈;進一步在DNA聚合酶（DNA polymerase）的作用下形成新的DNA互補鏈，完成擴增反應(yīng)。該技術(shù)具有簡便快捷，且不需要專門的儀器設(shè)備的優(yōu)點，被認(rèn)為是目前最具有應(yīng)用潛力的恒溫擴增技術(shù)。樊曉旭等[17]綜述了RPA技術(shù)在醫(yī)學(xué)病原物快速診斷中的應(yīng)用，周瑩等[18]綜述了近幾年RPA技術(shù)在植物病原物檢測上的應(yīng)用。但目前尚未有RPA技術(shù)在棉花曲葉病毒檢測方面的報道。本研究建立了不需專門儀器設(shè)備、操作簡便快捷的CLCuMuV的RPA檢測技術(shù)，為該病毒的檢疫和快速檢測提供一種新技術(shù)，從而為預(yù)防CLCuMuV在我國棉花產(chǎn)區(qū)傳播擴散、大流行提供技術(shù)支持。

1材料與方法

1.1材料

供試感染CLCuMuV的病樣采自廣東廣州的朱槿、感染臺灣番茄曲葉病毒Tomato leaf curl Taiwan virus（ToLCTV）的病樣采自廣東廣州的番茄、感染番茄黃化曲葉病毒Tomato yellow leaf curl virus（TYLCV）的病樣采自海南三亞的番茄、感染泰國番茄黃化曲葉病毒Tomato yellow leaf curl Thailand virus（TYLCTHV）的病樣采自廣東汕頭的番茄、感染中國南瓜曲葉病毒Squash leaf curl China virus（SLCCNV）的病樣是采自廣東河源的南瓜病樣、感染黃花稔曲葉病毒Sida leaf curl virus（SiLCuV）的病樣采自海南東方的番茄; 健康樣品為采自本實驗室網(wǎng)室繁殖的朱槿植株;待測7份田間朱槿病樣分別采自廣東省廣州（2份）、茂名（2份）、 湛江（2份）、清遠(yuǎn)（1份）。

TwistAmp Basic RPA試劑盒購自英國TwistDx公司，植物DNA提取試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，Premix TaqTM和DNA片段純化試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2方法

1.2.1引物設(shè)計

通過比對CLCuMuV中國分離物的外殼蛋白基因核苷酸序列找出保守區(qū)域，結(jié)合RPA的引物要求設(shè)計引物對CLCVF/CLCVR;同時設(shè)計用于PCR檢測ToLCTV、TYLCV、TYLCTHV、SLCCNV、SiLCuV的特異引物，引物詳情見表1。所有引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2.2總DNA的提取

取適量的供試植物葉片，用植物DNA提取試劑盒提取總DNA。具體操作按照試劑盒說明書進行。DNA沉淀溶解于50 μL TE緩沖液，保存于 20℃冰箱，備用。

1.2.3RPA反應(yīng)體系及最佳反應(yīng)時間

以CLCuMuV陽性植株總DNA為模板，利用引物CLCVF/CLCVR進行RPA擴增。按照TwistAmp Basic RPA試劑盒的說明配制RPA反應(yīng)體系，向試劑盒中裝有凍干酶粉的0.2 mL反應(yīng)管中加入Rehydration Buffer 29.5 μL、10 μmol/L引物CLCVF和CLCVR各2 μL、模板DNA 2 μL、280 mmol/L醋酸鎂2.5 μL、無RNase水12 μL，反應(yīng)總體系為50 μL。在40℃恒溫金屬浴中分別反應(yīng)20、30、40、50、60 min;反應(yīng)結(jié)束后，用DNA片段純化試劑盒對RPA產(chǎn)物進行純化回收，取純化后的RPA產(chǎn)物10 μL進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察結(jié)果，根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果確定最佳反應(yīng)時間。

1.2.4普通PCR

以CLCuMuV、ToLCTV、TYLCV、TYLCTHV、SLCCNV、 SiLCuV陽性植株總DNA為模板，分別利用表1中檢測相應(yīng)病毒的特異引物進行PCR擴增。模板DNA 2 μL、rTaqTM Premix 25 μL、10 μmol/L 上、下游引物各2 μL、滅菌水19 μL，反應(yīng)總體系為50 μL。反應(yīng)條件為：94℃ 預(yù)變性4 min;94℃變性45 s，在表1中每種病毒的退火溫度下反 應(yīng)45 s，72℃延伸 45 s，35個循環(huán);72℃延伸10 min 。取PCR產(chǎn)物10 μL進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察結(jié)果。

1.2.5靈敏度試驗

以CLCuMuV陽性植物總DNA 100、10 1、10 2、10 3、10 4、10 5稀釋液為模板，分別進行RPA和普通PCR檢測，比較二者的檢測靈敏度。RPA反應(yīng)體系同1.2.3，于40℃恒溫金屬浴中溫浴40 min;普通PCR擴增反應(yīng)體系和反應(yīng)程序同1.2.4。

1.2.6特異性評價

分別以CLCuMuV、ToLCTV、TYLCV、TYLCTHV、 SLCCNV、SiLCuV特異引物PCR檢測為陽性的植物總DNA為模板進行RPA擴增，對所建立的RPA檢測方法特異性進行評價，RPA反應(yīng)體系同1.2.3，然后在恒溫金屬浴40℃條件下溫浴40 min。

1.2.7樣品檢測

從廣東省廣州、茂名、湛江、清遠(yuǎn)采集疑似感染CLCuMuV的朱槿病樣7份，提取總DNA，用本研究建立的RPA方法檢測，并用普通PCR擴增驗證。

2結(jié)果與分析

2.1RPA最佳反應(yīng)時間

以CLCuMuV陽性植株總DNA為模板，利用引物CLCVF/CLCVR進行RPA擴增。電泳結(jié)果（圖1）表明，40℃溫浴20 min時就可以獲得目的條帶，溫浴40 min獲得的目的條帶最亮，隨著時間延長條帶亮度無明顯變化。根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果，確定40 min為最佳反應(yīng)時間。

2.2靈敏度檢測結(jié)果

以稀釋度分別為100、10 1、10 2、10 3、10 4、10 5 的CLCuMuV陽性植株總DNA為模板，分別進行RPA和普通PCR檢測。電泳

結(jié)果（圖2）顯示，RPA在模板稀釋倍數(shù)為10 3時能擴增出目的條帶，普通PCR在模板稀釋倍數(shù)為10 2時能擴增出目的條帶，因此，本研究所建立的RPA檢測方法是普通PCR檢測方法的10倍。

2.3特異性評價結(jié)果

分別以ToLCTV、TYLCV、TYLCTHV、SLCCNV、 SiLCuV檢測為陽性（圖3）的植物病樣總DNA和CLCuMuV陽性植株總DNA為模板進行RPA擴增，對所建立的RPA檢測方法特異性進行評價。電泳結(jié)果（圖4）顯示，所建立的RPA檢測方法只能從含有CLCuMuV的總DNA中擴增出目的條帶，不能從其他幾種病毒總DNA中擴增出任何條帶。由此可見，所建立的RPA檢測技術(shù)具有較好的特異性，可有效檢測CLCuMuV。

2.4田間樣品的檢測結(jié)果

從廣東省廣州、茂名、湛江、清遠(yuǎn)采集疑似感染CLCuMuV的朱槿病樣7份，用所建立的RPA擴增系統(tǒng)進行檢測，電泳結(jié)果顯示（圖5），7份疑似病樣均為陽性，進一步應(yīng)用PCR加以驗證，其檢測結(jié)果與RPA結(jié)果的一致率為100%，表明，所建立的RPA檢測方法能夠?qū)崿F(xiàn)田間病樣中CLCuMuV的快速、準(zhǔn)確檢測與診斷。

3討論

本研究建立了木爾坦棉花曲葉病毒快速RPA檢測方法。與普通PCR檢測方法相比，RPA擴增過程中不需要熱循環(huán)，可在恒溫水浴鍋或烘箱中進行，不依賴昂貴而專業(yè)的儀器設(shè)備;反應(yīng)速度快，在適合溫度條件下最短20 min就可以完成擴增反應(yīng);RPA檢測靈敏度是普通PCR的10倍;RPA檢測技術(shù)對引物要求比常規(guī)PCR嚴(yán)格，引物一般由30～35個核苷酸組成，而常規(guī)PCR引物長度通常為20～25個核苷酸。本研究根據(jù)CLCuMuV中國分離物的外殼蛋白基因核苷酸序列設(shè)計引物，檢測與CLCuMuV同屬的其他5種病毒，結(jié)果均為陰性，特異性較好。因此，本研究建立了簡便、快速、靈敏和特異的CLCuMuV檢測方法。

RPA技術(shù)不僅具有快速、靈敏、特異等優(yōu)點，而且可以在恒溫條件下完成擴增，適用于實驗室外的現(xiàn)場診斷，是目前最具有應(yīng)用潛力的恒溫擴增技術(shù)。自2006年首次報道以來，RPA技術(shù)已取得快速發(fā)展，尤其隨著商業(yè)化產(chǎn)品的出現(xiàn)，該技術(shù)在醫(yī)學(xué)、食品、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域得到了更為廣泛的應(yīng)用。近幾年RPA技術(shù)也逐漸被應(yīng)用于植物病毒的檢測。目前已報道建立了番茄斑萎病毒Tomato spotted wilt virus（TSWV）[19]、番茄褪綠病毒Tomato chlorosis virus（ToCV）[20]、番茄黃化曲葉病毒（TYLCV）[21]、南方菜豆花葉病毒Southern bean mosaic virus（SBMV）[22]﹑櫻桃病毒A Cherry virus A（CVA）[23]﹑玉米褪綠斑駁病毒Maize chlorotic mottle virus （MCMV）[24]、菜豆莢斑駁病毒Bean pod mottle virus（BPMV）[25]、大豆花葉病毒Soybean mosaic virus（SMV）[26]、葡萄卷葉伴隨病毒3號Grapevine leaf rollassociated virus 3（GLRaV3）[27]、李矮縮病毒Prune dwarf virus（PDV）[28]等多種植物病毒的RPA檢測方法，但未見有CLCuMuV RPA檢測報道。

CLCuMuV是有可能引起我國棉花曲葉病暴發(fā)和流行的病毒，是我國進境植物檢疫性有害生物，可隨帶毒苗木進行遠(yuǎn)距離傳播。針對性加強病毒寄主苗木的檢疫是防止CLCuMuV在我國棉花產(chǎn)區(qū)發(fā)生的關(guān)鍵。目前，用于檢測CLCuMuV的技術(shù)主要有常規(guī)PCR、實時熒光PCR[29 30]、納米磁珠熒光PCR[31]。這些技術(shù)都需要專業(yè)儀器設(shè)備，只能適用于實驗室快速檢測。本研究建立的CLCuMuV RPA技術(shù)不需要專業(yè)儀器設(shè)備，適合基層單位和口岸現(xiàn)場以及田間檢測使用，為我國棉花曲葉病的田間診斷、預(yù)測預(yù)報和相關(guān)寄主苗木帶毒快速檢測提供了一種更為便捷的技術(shù)手段，具有廣泛的應(yīng)用前景，對我國棉花曲葉病的綜合防控具有重要意義。

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收稿日期：2020 -12 -17修訂日期：2020 -12- 29

基金項目：

國家自然科學(xué)基金（31871937）;廣東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)共性關(guān)鍵技術(shù)研發(fā)創(chuàng)新團隊建設(shè)項目（2020KJ134）;廣州市科技計劃（201904010173）;廣東省科技創(chuàng)新戰(zhàn)略專項資金（高水平農(nóng)科院建設(shè)）（R2019PYJX005）

* 通信作者

Email：hezf@gdppri.com