九香蟲i型溶菌酶基因的克隆與細(xì)菌誘導(dǎo)表達(dá)分析

黃海 杜娟 李尚偉 龔濤 齊小浪

摘要

溶菌酶是一組進(jìn)化上保守的酶，在昆蟲中主要分為c型和i型兩類。為明確i型溶菌酶在九香蟲Coridius chinensis體內(nèi)的表達(dá)模式與功能，我們對九香蟲的兩個i型溶菌酶基因CcLysi1和CcLysi2進(jìn)行了克隆，這兩個基因的編碼區(qū)分別為504 bp和432 bp，分別編碼167和143個氨基酸。序列分析顯示，CcLysi1和CcLysi2缺乏與催化活性相關(guān)的谷氨酸（E）和絲氨酸（S）。同源性和聚類分析顯示，CcLysi1和CcLysi2與斯氏珀蝽Plautia stali的i型溶菌酶相似性最高，分別為80.36%和48.95%。采用實時熒光定量PCR（RTqPCR）解析CcLysi1和CcLysi2基因的時空表達(dá)譜，結(jié)果表明它們在九香蟲不同發(fā)育階段都有表達(dá)，CcLysi1在成蟲中表達(dá)水平最高，而CcLysi2在5齡若蟲中表達(dá)水平最高;它們在所檢測的成蟲不同組織中都有表達(dá)，都在脂肪體中表達(dá)水平最高。九香蟲被注射細(xì)菌后24 h，CcLysi1和CcLysi2的表達(dá)顯著上調(diào);九香蟲被飼喂細(xì)菌后，這兩種基因的表達(dá)水平?jīng)]有顯著變化。九香蟲的這兩種i型溶菌酶基因的表達(dá)受到自身免疫機制的調(diào)控，可以被誘導(dǎo)而參與免疫應(yīng)答，但不具有參與消化的功能。該研究為進(jìn)一步明確九香蟲i型溶菌酶基因的功能奠定基礎(chǔ)。

??關(guān)鍵詞

九香蟲;i型溶菌酶;時空表達(dá);先天免疫;細(xì)菌誘導(dǎo)

中圖分類號：Q967

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

DOI：10.16688/j.zwbh.2020669

Cloning and induced expression analysis of the itype lysozyme genes in Coridius chinensis

HUANG Hai，DU Juan，LI Shangwei*，GONG Tao，QI Xiaolang

（Guizhou Provincial Key Laboratory for Agricultural Pest Management in Mountainous Regions，

Institute of Entomology， Guizhou University， Guiyang， Guizhou550025， China）

Abstract

Lysozymes are a group of evolutionarily conserved enzymes and can be divided into ctype and itype in insects. In order to clarify the expression pattern and function of the itype lysozyme in Coridius chinensis， we cloned two itype lysozyme genes CcLysi1 and CcLysi2. The coding regions of these two genes were 504 bp and 432 bp， encoding 167 and 143 amino acids， respectively. Sequence analysis showed that CcLysi1 and CcLysi2 lacked glutamic acid （E） and serine （S） related to catalytic activity. Homology and cluster analyses showed that CcLysi1 and CcLysi2

shared the similarity of 80.36% and 48.95%， respectively， with the itype lysozyme from Plautia stali. The spatiotemporal expression profiles of CcLysi1 and CcLysi2 were analyzed by using realtime quantitative PCR （RTqPCR）. The results indicated that these two genes were expressed at various developmental stages of C. chinensis， with the highest expression levels for CcLysi1 in the adults and for CcLysi2 in the fifthinstar nymphs; they were expressed in different tissues of adults and had the highest expression level in the fat bodies. The expression levels of CcLysi1 and CcLysi2 were significantly upregulated within 24 h post bacterial injection， but there were no significant changes in the expression levels of these two genes post bacterial feeding. The expression of these two itype lysozyme genes in C.chinensis was regulated by its own immune mechanism and could be induced to participate in immune response， but they were not involved in digestion. This study laid a foundation for further elucidating the functions of the itype lysozyme genes in C.chinensis.

Key words

Coridius chinensis;itype lysozyme;spatiotemporal expression;innate immunity;bacterial induction

九香蟲Coridius chinensis隸屬于半翅目Hemiptera兜蝽科Dinidoridae，廣泛分布于我國南方地區(qū)，包括云南、四川、貴州、廣西等地，主要以葫蘆科植物的汁液為食，春夏季節(jié)常棲息在南瓜等農(nóng)作物的莖葉上吸食漿液，造成植株生長緩慢，為害嚴(yán)重時，可造成植株枯死。 同時，九香蟲也是一種極具開發(fā)潛力的昆蟲資源，其蟲體內(nèi)富含蛋白質(zhì)、多肽、脂肪酸、維生素以及微量元素等[1- 2]，具有很高的食用和藥用價值[3]。研究表明，九香蟲提取物具有抗菌和抗癌活性[4]，研究發(fā)現(xiàn)這些活性主要源于提取物中的一些活性多肽，例如防御素和溶菌酶等[5-8]。此外，九香蟲野生資源數(shù)量有限，在自然條件下，九香蟲一年僅發(fā)生一代，加之人們對其進(jìn)行的破壞性采集及環(huán)境污染，野生蟲源逐年減少，人工繁殖九香蟲是解決其供不應(yīng)求的重要途徑[9]。相較于自然環(huán)境中的九香蟲，目前完全人工飼養(yǎng)的九香蟲子代常出現(xiàn)畸形、免疫力低下以及細(xì)菌感染等嚴(yán)重問題，給九香蟲的飼養(yǎng)和繁殖帶來巨大挑戰(zhàn)。因此，提高其子代自身的免疫防御功能和抗病能力也是目前養(yǎng)殖的關(guān)鍵，加強對九香蟲免疫系統(tǒng)和免疫防御反應(yīng)機理的研究勢在必行。

昆蟲在長期的生物進(jìn)化過程中形成了獨特的免疫系統(tǒng)，僅靠先天免疫就能迅速有效地完成對細(xì)菌、病毒或藥物的免疫[10-11]。昆蟲先天免疫主要由體液免疫和細(xì)胞免疫組成。體液免疫包括產(chǎn)生抗菌肽、活性氧或氮的中間產(chǎn)物，以及調(diào)節(jié)血淋巴凝固或黑色素化的復(fù)雜酶級聯(lián)反應(yīng)[12 -15]。細(xì)胞免疫是指由血細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，包括吞噬、結(jié)瘤和包埋[16 -17]。作為體液免疫機制的重要組成部分，抗菌肽（antimicrobial peptides， AMPs）是宿主防御的第一個屏障，能殺死細(xì)菌、真菌、病毒和原生動物等微生物或減緩它們的生長[18- 19]。在各種抗菌活性物質(zhì)中，溶菌酶是最常見的，存在于許多生物中，如細(xì)菌、噬菌體、真菌、植物和動物。

溶菌酶在結(jié)構(gòu)、催化和免疫學(xué)特性上存在差異。傳統(tǒng)上溶菌酶分為3大類型：雞型溶菌酶（c型）、鵝型溶菌酶（g型）和無脊椎動物型溶菌酶（i型）[20- 21]。溶菌酶通常具有水解酶活性，能水解細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖聚合物中N乙酰胞壁酸和N乙酰氨基葡萄糖之間的β1，4糖苷鍵[22- 23]。因此，溶菌酶對于不斷接觸環(huán)境中微生物的無脊椎動物尤為重要，可以幫助它們抵御細(xì)菌病原體的入侵[24- 26]。i型溶菌酶最初是在海星和海洋雙殼類動物中發(fā)現(xiàn)的，在昆蟲中普遍存在[27]。家蠅Musca domestica和海洋雙殼類動物消化器官中溶菌酶的發(fā)現(xiàn)還表明了溶菌酶具有參與消化的功能，這類溶菌酶在腸道中高表達(dá)[28-30]。此外，據(jù)報道i型溶菌酶還具有異肽酶和幾丁質(zhì)酶活性[31-32]。從醫(yī)用水蛭Hirudo medicinalis唾液中分離出的一種i型溶菌酶最初被描述為一種失穩(wěn)酶（destabilase），因為它能夠溶解交聯(lián)纖維蛋白[33]，該酶后來被證明既具有溶菌酶活性又具有異肽酶活性[34]。 作為一組進(jìn)化上保守的酶，許多在昆蟲中編碼c型和i型溶菌酶的基因在基因組和轉(zhuǎn)錄組分析中被鑒定出來。目前，研究者已研究了昆蟲c型溶菌酶在蛋白質(zhì)水平上的功能特征，而對于昆蟲i型溶菌酶只在DNA或mRNA水平上研究了其特征[35]。昆蟲i型溶菌酶可能在進(jìn)化過程中失去了溶菌酶原有的一些特性，而獲得了新的、尚未確定的功能。

本課題組在前期九香蟲轉(zhuǎn)錄組測序中共發(fā)現(xiàn)了12種抗菌活性多肽， 包括4種昆蟲防御素，1種富含甘氨酸的抗菌肽，1種富含脯氨酸的抗菌肽以及6種溶菌酶。本研究在防御素和c型溶菌酶的研究基礎(chǔ)上選擇2個i型溶菌酶基因CcLysi1和CcLysi2，研究它們與其他物種的i型溶菌酶之間的進(jìn)化關(guān)系，并進(jìn)行了細(xì)菌感染誘導(dǎo)下靶基因表達(dá)的分析，初步探索兩種i型溶菌酶在九香蟲生長發(fā)育以及先天免疫中的功能。這項研究旨在完善九香蟲溶菌酶在免疫防御機制中的作用，為昆蟲中廣泛存在的i型溶菌酶的研究提供了一定的理論依據(jù)與數(shù)據(jù)支撐。

1材料與方法

1.1昆蟲與供試菌

九香蟲 Coridius chinensis采自貴陽市花溪區(qū)，在人工氣候箱中用南瓜葉飼養(yǎng)。飼養(yǎng)溫度（28±1）℃，相對濕度80%，光照周期L∥D=14 h∥10 h。 克隆載體pMD18T和大腸桿菌Escherichia coli感受態(tài)細(xì)胞TOP10購自生工生物工程（上海）股份有限公司，保存于 80℃冰箱，大腸桿菌 E.coli（ATCC 25922）和藤黃微球菌Micrococcus luteus（CMCC 28001）均保存于貴州大學(xué)昆蟲研究所分子生物學(xué)實驗室。

1.2RNA提取與基因克隆

采用HP Total RNA Kit（Omega BioTek， GA， USA）提取九香蟲不同發(fā)育時期（卵，1～5齡若蟲，雌蟲和雄蟲）以及成蟲各個組織（頭、脂肪體、血淋巴、中腸、肌肉、體壁、精巢和卵巢）的RNA，其中九香蟲血淋巴提取使用雙管離心法[36]。 用NanoDrop 2000超微量分光光度計（Thermo Fisher Scientific， MA， USA）測定RNA濃度，并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的質(zhì)量。采用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（Thermo Fisher Scientific， MA， USA）將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，將合成的cDNA濃度稀釋到300～500 ng/μL，? 20℃保存。根據(jù)轉(zhuǎn)錄組序列信息用Primer Premier 6.0設(shè)計PCR引物（表1），并由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。用2× PCR Master Mix進(jìn)行PCR，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min;95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸40 s， 35個循環(huán);72℃延伸10 min。對PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用膠回收試劑盒回收產(chǎn)物連接到pMD18T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞TOP10，送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.3生物信息學(xué)分析

用NCBI的開放閱讀框（Open reading frame， ORF）搜尋數(shù)據(jù)庫（https：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）預(yù)測CcLysi1和CcLysi2（GenBank登錄號見表2）的ORF。在ExPASy ProtParam tool（https：∥web.expasy.org/protparam/）平臺預(yù)測兩種溶菌酶的分子量和等電點，并用SignalP 5.0 Server （https：∥services.healthtech.dtu.dk/service.php？SignalP5.0）分析信號肽及前肽。亞細(xì)胞定位使用TargetP 2.0（https：∥services.healthtech.dtu.dk/service.php？TargetP2.0）。用NCBI的BLAST進(jìn)行同源性比較（https：∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi），并用MEGAX軟件中的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，重復(fù)運行1 000次。用于序列比對和構(gòu)建進(jìn)化樹的溶菌酶來源物種和GenBank登錄號見表2。

1.4時空表達(dá)譜

采用實時熒光定量PCR（RTqPCR）在CFX96? Touch RealTime PCR儀（BioRad， CA， USA）上檢測CcLysi1和CcLysi2基因在九香蟲不同發(fā)育階段和成蟲 不同組織中的表達(dá)水平。利用

Primer Premier 6.0 設(shè)計溶菌酶基因CcLysi1和CcLysi2 的特異性引物（表1），引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

RTqPCR反應(yīng)按照2× SYBR Select Master Mix（Thermo Fisher Scientific，? MA， USA）說明書進(jìn)行，反應(yīng)體系為20 μL：1 μL cDNA，10 μmol/L上、 下游引物各1 μL，10 μL 2× SYBR Select Master Mix， 7 μL無RNA酶的無菌去離子水。反應(yīng)程序：50℃ 2 min;95℃預(yù)變性2 min; 95℃變性15 s，61℃退火15 s，72℃延伸1 min，40個循環(huán)，每個樣本重復(fù)3次，以九香蟲βactin基因（GenBank登錄號：MK370101）作內(nèi)參對照。

1.5細(xì)菌注射

大腸桿菌和藤黃微球菌在自然環(huán)境中廣泛分布，是動物經(jīng)常接觸到的細(xì)菌，通常在動物出現(xiàn)損傷時會引起傷口感染。溶菌酶等抗菌物質(zhì)是昆蟲應(yīng)對細(xì)菌感染的第一道屏障，抑制細(xì)菌感染是它們最主要的功能。因此，注射細(xì)菌通?？烧T導(dǎo)這類抗菌物質(zhì)的產(chǎn)生。將藤黃微球菌和大腸桿菌分別接種于20 mL LB培養(yǎng)基中，于37℃恒溫培養(yǎng)箱，200 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600=0.5，10 000 g離心5 min，收集菌體用PBS洗滌，并將兩種細(xì)菌混合后懸浮于PBS中調(diào)節(jié)OD600=0.01（5×106cfu/mL）。隨機選取100頭健康的九香蟲成蟲，每頭腹腔注射1 μL菌液，為排除PBS緩沖液和機械損傷的影響， 用同樣的方法注射無菌的1 μL PBS作為陰性對照。注射后的九香蟲飼養(yǎng)在人工氣候箱中，溫度（28±1）℃，相對濕度80%，光照周期L∥D=14 h∥10 h，分別在無菌條件下收集10頭注射細(xì)菌后6、8、12、24、36、48、60 h和72 h時的九香蟲，用液氮速凍。RNA提取和cDNA合成方法同上。采用RTqPCR分析注射細(xì)菌后CcLysi1和CcLysi2的表達(dá)量，并與九香蟲c型溶菌酶CcLys2進(jìn)行比較分析（GenBank登錄號：MN816376）。

1.6細(xì)菌飼喂

在250 mL LB培養(yǎng)液中接種藤黃微球菌，于37℃搖床，200 r/min振蕩過夜培養(yǎng)至OD600=4，然后10 000 g離心5 min，收集菌體用PBS洗滌，再懸浮于PBS中調(diào)節(jié)至OD600=2。將采摘的新鮮南瓜莖葉剪碎與藤黃微球菌懸液（OD600=2）混合，放入15 mm×25 mm的透明塑料盒子中。將隨機選取的40頭饑餓12 h的健康九香蟲成蟲轉(zhuǎn)入該塑料盒子，用尼龍網(wǎng)封口以保證空氣流通并將其放入人工氣候箱中繼續(xù)培養(yǎng)，以未混菌的南瓜莖葉飼養(yǎng)的九香蟲為對照。分別收集喂養(yǎng)6、12 h和24 h的九香蟲成蟲中腸，用液氮速凍?？俁NA提取、cDNA合成和RTqPCR步驟同上。

1.7數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

用2 ΔΔCt法計算不同發(fā)育階段、不同組織及細(xì) 菌誘導(dǎo)后CcLysi1和CcLysi2的表達(dá)水平。RTqPCR表達(dá)量相關(guān)數(shù)據(jù)用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，采用單因素方差分析（ANOVA）和鄧肯氏新復(fù)極差法進(jìn)行多重檢驗，P<0.05為差異顯著。

2結(jié)果與分析

2.1序列驗證與特征分析

CcLysi1和CcLysi2基因經(jīng)PCR擴增后，電泳顯示在約570 bp和460 bp位置各出現(xiàn)明亮的擴增帶，與預(yù)期擴增片段大小一致（圖1），測序結(jié)果與來自轉(zhuǎn)錄組的序列相同。兩種溶菌酶基因在NCBI數(shù)據(jù)庫中的BLAST結(jié)果表明，它們屬于無脊椎動物型（i型）溶菌酶基因。CcLysi1基因的開放閱讀框為504 bp，編碼167個氨基酸，預(yù)測分子量為18.04 kDa，理論等電點為5.28（圖2a）。CcLysi2基因的開放閱讀框長度為432 bp，編碼143個氨基酸，預(yù)測分子量為15.74 kDa，理論等電點為5.12（圖2b）。亞細(xì)胞定位預(yù)測顯示，這兩種九香蟲i型溶菌酶均為分泌蛋白，都有一個N端信號肽，信號肽長度分別為21個氨基酸（G21↓Q22，CcLysi1）和24個氨基酸（G24↓L25，CcLysi2）。 結(jié)構(gòu)域分析顯示兩種溶菌酶均具有典型的i型溶菌酶結(jié)構(gòu)域LYZ_i， 且CcLysi1和CcLysi2在糖結(jié)合位點上的氨基酸高度一致（圖2）。

2.2序列比對與系統(tǒng)發(fā)育分析

將來自九香蟲的4種溶菌酶的成熟蛋白氨基酸序列與其他12個物種的i型溶菌酶氨基酸序列進(jìn)行比對，這12個物種包括4種軟體動物（美洲牡蠣Crassostrea virginica，菲律賓簾蛤Ruditapes philippinarum和文蛤Meretrix lusoria），2種環(huán)節(jié)動物（安德愛勝蚓Eisenia andrei和醫(yī)用水蛭H.medicinalis），6種節(jié)肢動物（果蠅Drosophila serrata，異色瓢蟲Harmonia axyridis，岡比亞按蚊Anopheles gambiae，斑節(jié)對蝦Penaeus monodon和克氏原鰲蝦Procambarus clarkii）。多序列比對顯示了i型溶菌酶催化必需的谷氨酸殘基E和天冬氨酸殘基D，以及完全保守的8個半胱氨酸殘基C基序。與c型溶菌酶一樣，谷氨酸殘基E和天冬氨酸殘基D也被認(rèn)為對i型溶菌酶的催化活性至關(guān)重要[37 38]。有趣的是，來自九香蟲的4種溶菌酶以及其他節(jié)肢動物的i型溶菌酶至少缺乏這兩種氨基酸殘基中的一個，而環(huán)節(jié)動物和軟體動物的i型溶菌酶都具有這兩種保守的催化殘基（圖3）。此外，一般認(rèn)為i型溶菌酶還具有異肽酶活性，并且這種異肽酶活性被認(rèn)為涉及絲氨酸蛋白酶機制，需要絲氨酸殘基S62和組氨酸殘基H92[39 40]。然而，在節(jié)肢動物中絲氨酸殘基S并不保守，除異色瓢蟲外，九香蟲的4種溶菌酶以及其他節(jié)肢動物的i型溶菌酶對應(yīng)位點均沒有發(fā)現(xiàn)有絲氨酸殘基S的存在（圖3）。

以九香蟲c型溶菌酶CcLys2和家蠶B.mori的c型溶菌酶BmLZ為外群，用鄰接法構(gòu)建基于成熟蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果顯示來自節(jié)肢動物的溶菌酶聚為一支，在另一支中，除了斑節(jié)對蝦溶菌酶PmLyzi1外，還包括環(huán)節(jié)動物、軟體動物以及棘皮動物的i型溶菌酶（圖4）。與其他無脊椎動物i型溶菌酶相比，用于系統(tǒng)發(fā)育分析的所有節(jié)肢動物i型溶菌酶幾乎都缺失了與胞壁質(zhì)酶活性相關(guān)的特 征催化殘基;在NCBI蛋白數(shù)據(jù)中對i型溶菌酶的檢索表明，i型溶菌酶中這種推測的催化殘基的缺失在昆蟲中普遍存在。來自九香蟲的4種溶菌酶與斯氏珀蝽Plautia stali和茶翅蝽Halyomorpha halys的溶菌酶聚為一個亞群，這表明它們具有較近的親緣關(guān)系;而九香蟲的這4種i型溶菌酶在系統(tǒng)發(fā)育樹上的差異，則表明九香蟲i型溶菌酶至少有3種不同的亞型。

2.3時空表達(dá)譜

九香蟲溶菌酶基因CcLysi1和CcLysi2的時空表達(dá)模式見圖5和圖6，CcLysi1和CcLysi2在九香蟲不同發(fā)育時期的表達(dá)水平有顯著差異。CcLysi1在成蟲期的表達(dá)量最高且雌、雄蟲之間無顯著差異，在5齡若蟲中的表達(dá)量次之。CcLysi1在成蟲中的表達(dá)量約為在卵中的5倍，5齡若蟲中的3倍（圖5a）。CcLysi2在5齡若蟲中的表達(dá)量最高，在4齡若蟲中的表達(dá)量次之，在成蟲中的表達(dá)量較低。CcLysi2在5齡若蟲中的表達(dá)量約為卵中的3倍以及成蟲中的4倍（圖5b）。在檢測的成蟲不同組織中，CcLysi1和CcLysi2具有相似的組織分布模式，兩種i型溶菌酶均在脂肪體有最高的表達(dá)量;在其余組織中，CcLysi1主要在血淋巴、精巢和卵巢中表達(dá)（圖6a），而CcLysi2在血淋巴和中腸中有較高的表達(dá)量（圖6b）。

2.4細(xì)菌注射后溶菌酶基因的表達(dá)模式

九香蟲被注射細(xì)菌后3種溶菌酶基因的表達(dá)模式見圖7，與未注射細(xì)菌的對照組（CK）相比，雖然CcLysi2 在36 h出現(xiàn)波動，但總體上CcLysi1和CcLysi2以及c型溶菌酶CcLys2的表達(dá)水平均顯著上調(diào)，表達(dá)模式基本一致。CcLysi1和CcLysi2的表達(dá)量在24 h內(nèi)升高并達(dá)到最大值，CcLys2則是在60 h內(nèi)持續(xù)保持高豐度并達(dá)到最大值;而在注射PBS的樣本中CcLysi1和CcLysi2的表達(dá)水平基本保持不變或變化很小（圖7d），說明注射PBS不能誘導(dǎo)這兩種溶菌酶的表達(dá)。這些結(jié)果表明CcLysi1和CcLysi2與九香蟲的免疫密切相關(guān)。

2.5細(xì)菌飼喂后溶菌酶基因的表達(dá)模式

與注射細(xì)菌后的表達(dá)模式不同，被飼喂細(xì)菌的九香蟲與用南瓜莖葉正常飼喂的九香蟲（CK）相比，僅發(fā)現(xiàn)c型溶菌酶CcLys2表達(dá)水平在飼喂6 h后有顯著上調(diào)，而兩種i型溶菌酶基因的表達(dá)豐度在24 h內(nèi)與對照組相比變化幅度較小，并未上調(diào)（圖8），這說明CcLysi1和CcLysi2在中腸中不能被飼喂細(xì)菌的方式所誘導(dǎo)，并不參與九香蟲腸道的消化作用。

3結(jié)論與討論

溶菌酶作為一種重要的天然免疫因子，廣泛分布于脊椎動物和無脊椎動物[41]。本文報道了來自九香蟲的兩種無脊椎動物型（i型）溶菌酶CcLysi1和CcLysi2，該研究可為其他昆蟲i型溶菌酶同源物的功能注釋提供參考。

先前的研究通過定點誘變方法證實E18和D30在i型溶菌酶TJL催化活性中的重要性，它們被認(rèn)為是c型溶菌酶HEWL中催化殘基E35和D52的等價物[37-? 38， 42]。然而，在節(jié)肢動物中i型溶菌酶缺乏這兩種催化殘基的情況并不罕見，尤其是在昆蟲的i型溶菌酶中。有研究提出昆蟲中c型溶菌酶的功能冗余導(dǎo)致i型溶菌酶失去活性，從而獲得新的功能[43]，在蘋掌舟蛾P(guān)halera flavescens中發(fā)現(xiàn)的N乙酰氨基乳糖特異性凝集素被認(rèn)為是從昆蟲i型溶菌酶進(jìn)化而來[44]。后續(xù)的研究也證明i型溶菌酶具有多種功能，如異肽酶活性、幾丁質(zhì)酶活性和非酶抗菌活性等[45-46]。在本研究中，序列分析顯示來自九香蟲的2種i型溶菌酶均沒有與胞壁質(zhì)酶活性相關(guān)的谷氨酸殘基E以及異肽酶活性所需的絲氨酸殘基S，僅CcLysi2在對應(yīng)活性位點上有天冬氨酸殘基D，因此我們推測CcLysi1和CcLysi2可能既沒有胞壁質(zhì)酶活性也沒有異肽酶活性。在異色瓢蟲中發(fā)現(xiàn)的5種i型溶菌酶也存在類似的情況，它們均缺乏與胞壁質(zhì)酶或異肽酶活性相關(guān)的催化殘基，而在后續(xù)的研究中被證實沒有相關(guān)的酶活性[35]。

無脊椎動物型（i型）溶菌酶在生物體內(nèi)具有多種功能。在克氏原螯蝦和斑節(jié)對蝦中，i型溶菌酶沒有胞壁質(zhì)酶活性，但仍具有非酶抗菌活性和異肽酶活性[46-47]，其抗菌活性似乎與胞壁質(zhì)酶之間并沒有必然聯(lián)系。在蚊子中，i型溶菌酶被認(rèn)為在吸血或免疫中起作用[43]。在軟體動物中，i型溶菌酶還被認(rèn)為具有幫助消化的作用，類似于反芻動物胃中的c型溶菌酶[20， 48-49]。在醫(yī)用水蛭中，i型溶菌酶具有異肽酶活性，有分解血凝塊中纖維蛋白的功能[40]。但在目前的研究中，一般認(rèn)為昆蟲i型溶菌酶缺乏胞壁質(zhì)酶活性相關(guān)的結(jié)構(gòu)域，而其是否具有異肽酶活性尚不清楚[50]，僅研究了它們在DNA或mRNA水平上的特征。為了更好地了解i型溶菌酶在九香蟲中的作用，我們對CcLysi1和CcLysi2的表達(dá)水平進(jìn)行了檢測。CcLysi1和CcLysi2具有相似的組織分布模式，可以在脂肪體、血淋巴以及精巢和卵巢中檢測到。脂肪體和血淋巴在昆蟲的天然免疫系統(tǒng)中非常重要，通常昆蟲抗菌肽在脂肪體中表達(dá)后分泌到血淋巴[51-52]。因此，CcLysi1和CcLysi2可能作為抗菌蛋白參與免疫過程，至于檢測到CcLysi1在精巢和卵巢有一定表達(dá)水平，則暗示了其可能與九香蟲生長發(fā)育有某種聯(lián)系。在人類精子頂體中發(fā)現(xiàn)的溶菌酶樣蛋白SLLP1就被認(rèn)為在精卵結(jié)合中發(fā)揮作用[53]。

有研究表明，異色瓢蟲的一種i型溶菌酶以及岡比亞按蚊的兩種i型溶菌酶并不能被免疫激發(fā)所誘導(dǎo)[35]。然而，在我們的研究中，九香蟲的兩種i型溶菌酶不僅可以被誘導(dǎo)，而且與來自九香蟲的c型溶菌酶CcLys2有著相似的表達(dá)模式。九香蟲被注射細(xì)菌后，CcLysi1和CcLysi2在數(shù)小時內(nèi)持續(xù)上調(diào)，一般昆蟲在感染細(xì)菌后約6～12 h抗菌肽就會出現(xiàn)在被感染昆蟲的血淋巴中[54]，而在注射PBS的樣本中并未檢測到CcLysi1和CcLysi2的表達(dá)水平的顯著變化，這表明它們與九香蟲的免疫密切相關(guān)。九香蟲喂食混有細(xì)菌的南瓜莖葉后兩種基因的表達(dá)并未出現(xiàn)上調(diào)，則說明CcLysi1和CcLysi2并不在腸腔分泌，雖然有研究表明i 型溶菌酶可能有助消化的作用，但在本研究中沒有證據(jù)表明兩種九香蟲i型溶菌酶有這樣的功能，僅c型溶菌酶CcLys2可能存在這種功能?，F(xiàn)有的研究表明，i型溶菌酶在不同物種之間具有不同的活性和功能，即使在同一個物種中，不同的i型溶菌酶功能也可能有所不同。在九香蟲的不同發(fā)育階段，CcLysi1與CcLysi2表達(dá)模式不同，受到九香蟲自身發(fā)育的調(diào)控。CcLysi1在雌雄成蟲中高表達(dá)，且在精巢和卵巢中表達(dá)水平較高，這表明該基因可能與九香蟲的生長發(fā)育相關(guān)，而CcLysi2在若蟲期的表達(dá)水平高于成蟲，推測i型溶菌酶可能具有與昆蟲蛻皮相關(guān)的幾丁質(zhì)酶活性。

本研究從九香蟲的轉(zhuǎn)錄組中篩選并克隆了兩個無脊椎動物型溶菌酶基因CcLysi1和CcLysi2，對這兩種基因的mRNA表達(dá)模式進(jìn)行了解析。研究結(jié)果表明，兩種溶菌酶在進(jìn)化上屬于典型的昆蟲i型溶菌酶，受到九香蟲自身發(fā)育的調(diào)控，與九香蟲被細(xì)菌感染后的免疫應(yīng)答密切相關(guān)。該研究有助于進(jìn)一步研究i型溶菌酶在九香蟲生長發(fā)育和免疫防御中的作用，從而為九香蟲資源的開發(fā)提供理論支撐。鑒于i型溶菌酶功能的多樣性及昆蟲i型溶菌酶在蛋白水平功能上的不確定性，下一步我們考慮用RNA干擾或基因編輯（CRISPRCas9）技術(shù)對其功能做進(jìn)一步研究。

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收稿日期：2020-12-15修訂日期：2021-02-24

基金項目：

國家自然科學(xué)基金（31560610）

* 通信作者

E-mail：swlii@163.com