仙茅苷調(diào)控miR-1247-3p表達(dá)對高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響

黃建青 陳 陽 丘水林 童 艷 涂 梅 （福建醫(yī)科大學(xué)附屬龍巖第一醫(yī)院內(nèi)分泌科，龍巖 364000）

糖尿病腎病是糖尿病常見的慢性微血管并發(fā)癥之一，其患病率逐年攀升，嚴(yán)重影響患者的生命健康及生活質(zhì)量；近年來中醫(yī)藥治療糖尿病腎病具有一定優(yōu)勢，不良反應(yīng)較?。?-3］。仙茅苷是中藥仙茅的有效成分，可通過調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激降低脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷［4］。仙茅苷預(yù)處理可顯著改善細(xì)胞活力，降低心肌細(xì)胞凋亡［5］。仙茅苷可緩解海馬神經(jīng)元損傷，抑制海馬神經(jīng)元凋亡［6］。腎小管上皮細(xì)胞炎癥損傷與糖尿病腎病的發(fā)病密切相關(guān)。研究報(bào)道缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中miR-1247-3p表達(dá)下調(diào)，上調(diào)miR-1247-3p可減輕缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷［7］。miR-1247-3p能抑制氧-葡萄糖剝奪/復(fù)氧誘導(dǎo)的腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡［8］。說明miR-1247-3p具有減輕細(xì)胞損傷作用。本研究旨在探究仙茅苷對高糖致腎小管上皮細(xì)胞炎癥損傷的影響及機(jī)制是否與miR-1247-3p有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 材料 HK-2細(xì)胞（腎小管上皮細(xì)胞）購自美國ATCC；DMEM培養(yǎng)基購自美國Hyclone；D-葡萄糖購自艾美捷科技有限公司；仙茅苷購自江蘇永健醫(yī)藥科技有限公司；IL-6、TNF-α ELISA試劑盒購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司（貨號：E-ELH0102c、E-EL-H0109c）；凋亡檢測試劑盒（貨號：QN1317）、RIPA蛋白裂解液（貨號：HR0259）購自北京百奧萊博科技有限公司；Cleaved-caspase3和Cleaved-caspase9抗體購自亞科因（武漢）生物技術(shù)有限公司（貨號：ABP0020、ABP50010）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（貨號：D350A）、熒光定量試劑盒（貨號：RR420A）購自大連寶生物工程有限公司；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑（貨號：11668019）購自美國Invitrogen公司；anti-miR-NC、anti-miR-1247-3p購自上海吉瑪制藥有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞處理與分組 采用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)腎小管上皮細(xì)胞HK-2，用含5.5、25 mmol/L葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)HK-2細(xì)胞，分別作為正常對照組（Con）和高糖組（HG）；以0.5、5、50 μmol/L仙茅苷和25 mmol/L葡萄糖分別處理HK-2細(xì)胞，作為HG+仙茅苷低、中、高劑量實(shí)驗(yàn)組；將miR-NC、miR-1247-3p分別轉(zhuǎn)染至HK-2細(xì)胞后用25 mmol/L葡萄糖處理，為HG+miR-NC組、HG+miR-1247-3p組；將anti-miR-NC、anti-miR-1247-3p分別轉(zhuǎn)染至HK-2細(xì)胞，再加25 mmol/L葡萄糖和50 μmol/L仙茅苷，設(shè)為HG+仙茅苷+anti-miR-NC組、HG+仙茅苷+anti-miR-1247-3p組。轉(zhuǎn)染方法：轉(zhuǎn)染前1 d培養(yǎng)細(xì)胞，使其轉(zhuǎn)染密度為90%左右，采用50 μl無血清DMEM培養(yǎng)基稀釋1.0 μg質(zhì)粒；50 μl DMEM培養(yǎng)基稀釋1 μl LipofectamineTM2000試劑；5 min內(nèi)同稀釋的質(zhì)?；旌?；室溫靜置20 min；將復(fù)合物添加至含細(xì)胞的培養(yǎng)板中孵育6 h，然后加入藥物處理。

1.2.2 ELISA檢測TNF-α、IL-6水平 收集各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后的上清液，按照試劑盒說明操作，采用酶標(biāo)儀測定OD450nm值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品OD值計(jì)算相應(yīng)濃度。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h，PBS清洗細(xì)胞，加入300 μl結(jié)合緩沖液，Annexin V-FITC和PI避光孵育10 min，置于流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.2.4 Western blot檢測蛋白表達(dá) 提取各組細(xì)胞總蛋白，通過SDS-PAGE電泳分離蛋白，經(jīng)電轉(zhuǎn)將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉后加入Cleaved-caspase3和Cleaved-caspase9抗體，4 ℃孵育過夜，然后加入二抗孵育2 h，曝光顯影，分析蛋白條帶灰度值，以GAPDH為內(nèi)參計(jì)算蛋白表達(dá)水平。

1.2.5 RT-qPCR檢測miR-1247-3p表達(dá)水平 提取細(xì)胞總RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以U6為內(nèi)參，根據(jù)試劑盒說明進(jìn)行PCR反應(yīng)，相對表達(dá)量采用 2-ΔΔCt法計(jì)算。miR-1247-3p 正向引物：5'-CCCCGGGAACGTCGAGACTGGAGC-3'，反向引物：5'-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3'；U6正向引物：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，反向引物：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。引物由上海生工生物工程公司合成。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 以SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用±s表示，兩組獨(dú)立樣本比較方差齊行t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 仙茅苷對高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的影響 與Con組相比，HG組腎小管上皮細(xì)胞中IL-6、TNF-α水平升高（P＜0.05）；與HG組相比，HG+仙茅苷低、中、高劑量組腎小管上皮細(xì)胞中IL-6、TNF-α水平逐漸降低，呈劑量依賴性（P＜0.05，表1）。

表1 仙茅苷對高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的影響（±s，n=9，pg/ml）Tab.1 Effect of curculigoside on expressions of inflammatory factors in renal tubular epithelial cells induced by high glucose （±s，n=9，pg/ml）

表1 仙茅苷對高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的影響（±s，n=9，pg/ml）Tab.1 Effect of curculigoside on expressions of inflammatory factors in renal tubular epithelial cells induced by high glucose （±s，n=9，pg/ml）

Note：Compared with Con group， 1）P＜0.05； compared with HG group，2）P＜0.05； compared with HG+curculigoside-L group， 3）P＜0.05； compared with HG+curculigoside-M group， 4）P＜0.05.

Groups Con HG HG+curculigoside-L HG+curculigoside-M HG+curculigoside-H F P IL-6 42.12±3.69 133.14±11.191）92.49±7.952）74.22±6.992）3）56.48±4.972）3）4）204.139 0.000 TNF-α 16.13±1.45 85.82±6.971）66.68±4.152）45.22±4.392）3）28.25±2.152）3）4）391.162 0.000

2.2 仙茅苷對高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞凋亡的影響 與Con組相比，HG組HK-2細(xì)胞的凋亡率及Cleaved-caspase3、Cleaved-caspase9蛋白表達(dá)水平均升高（P＜0.05）；不同濃度仙茅苷處理后，細(xì)胞凋亡率及Cleaved-caspase3、Cleaved-caspase9蛋白表達(dá)水平較HG組逐漸降低，且呈劑量依賴性（P＜0.05，圖1、表2）。

表2 仙茅苷對高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞凋亡的影響（±s，n=9）Tab.2 Effect of curculigoside on renal tubular epithelial cell apoptosis induced by high glucose （±s，n=9）

表2 仙茅苷對高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞凋亡的影響（±s，n=9）Tab.2 Effect of curculigoside on renal tubular epithelial cell apoptosis induced by high glucose （±s，n=9）

Note：Compared with Con group， 1）P＜0.05； compared with HG group，2）P＜0.05； compared with HG+curculigoside-L group， 3）P＜0.05；compared with HG+curculigoside-M group， 4）P＜0.05.

Groups Con HG HG+curculigoside-L HG+curculigoside-M HG+curculigoside-H F P Apoptosis rate （%）7.13±0.69 33.33±3.011）24.34±2.022）16.99±1.052）3）10.23±0.842）3）4）331.080 0.000 Cleavedcaspase3 protein 0.27±0.02 0.84±0.061）0.67±0.052）0.51±0.042）3）0.36±0.032）3）4）265.750 0.000 Cleavedcaspase9 protein 0.19±0.02 0.64±0.051）0.49±0.042）0.37±0.032）3）0.25±0.022）3）4）256.966 0.000

圖1 仙茅苷對高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞凋亡的影響Fig.1 Effect of curculigoside on apoptosis of renal tubular epithelial cells induced by high glucose

2.3 仙茅苷對高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞miR-1247-3p表達(dá)的影響 與Con組相比，HG組HK-2細(xì)胞中miR-1247-3p表達(dá)水平降低（P＜0.05）；與HG組相比，仙茅苷低、中、高劑量組HK-2細(xì)胞中miR-1247-3p表達(dá)水平逐漸升高，呈劑量依賴性（P＜0.05，表3）。

表3 仙茅苷對高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞miR-1247-3p表達(dá)的影響（±s，n=9）Tab.3 Effect of curculigoside on expression of miR-1247-3p in renal tubular epithelial cells induced by high glucose （±s，n=9)

表3 仙茅苷對高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞miR-1247-3p表達(dá)的影響（±s，n=9）Tab.3 Effect of curculigoside on expression of miR-1247-3p in renal tubular epithelial cells induced by high glucose （±s，n=9)

Note：Compared with Con group， 1）P＜0.05； compared with HG group，2）P＜0.05； compared with HG+curculigoside-L group， 3）P＜0.05；compared with HG+curculigoside-M group， 4）P＜0.05.

Groups Con HG HG+curculigoside-L HG+curculigoside-M HG+curculigoside-H F P miR-1247-3p 1.00±0.00 0.31±0.031）0.52±0.042）0.66±0.052）3）0.82±0.062）3）4）370.570 0.000

2.4 miR-1247-3p過表達(dá)對高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的影響 與HG+miR-NC組相比，HG+miR-1247-3p組miR-1247-3p表達(dá)水平升高，IL-6、TNF-α水平降低（P＜0.05，表4）。

表4 miR-1247-3p過表達(dá)對高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的影響（±s，n=9）Tab.4 Effect of miR-1247-3p overexpression on expressions of inflammatory factors in renal tubular epithelial cells induced by high glucose （±s，n=9）

表4 miR-1247-3p過表達(dá)對高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的影響（±s，n=9）Tab.4 Effect of miR-1247-3p overexpression on expressions of inflammatory factors in renal tubular epithelial cells induced by high glucose （±s，n=9）

Note：Compared with HG+miR-NC group， 1）P＜0.05.

Groups HG+miR-NC HG+miR-1247-3p t P miR-1247-3p 1.00±0.00 3.09±0.261）24.115 0.000 IL-6/（pg·ml-1）135.04±11.79 64.17±5.571）16.305 0.000 TNF-α/（pg·ml-1）86.59±6.65 36.69±3.241）20.237 0.000

2.5 miR-1247-3p過表達(dá)對高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞凋亡的影響 與HG+miR-NC組相比，HG+miR-1247-3p組腎小管上皮細(xì)胞凋亡率降低，Cleaved-caspase3和Cleaved-caspase9蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05，圖2、表5）。

表5 miR-1247-3p過表達(dá)對高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞凋亡的影響（±s，n=9）Tab.5 Effect of miR-1247-3p overexpression on apoptosis of renal tubular epithelial cells induced by high glucose （±s，n=9）

表5 miR-1247-3p過表達(dá)對高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞凋亡的影響（±s，n=9）Tab.5 Effect of miR-1247-3p overexpression on apoptosis of renal tubular epithelial cells induced by high glucose （±s，n=9）

Note：Compared with HG+miR-NC group， 1）P＜0.05.

Groups HG+miR-NC HG+miR-1247-3p t P Apoptosis rate（%）33.97±3.12 13.86±1.151）18.143 0.000 Cleavedcaspase3 protein 0.86±0.05 0.45±0.041）19.209 0.000 Cleavedcaspase9 protein 0.67±0.05 0.32±0.041）16.398 0.000

圖2 miR-1247-3p過表達(dá)對高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞凋亡的影響Fig.2 Effect of miR-1247-3p overexpression on apoptosis of renal tubular epithelial cells induced by high glucose

2.6 下調(diào)miR-1247-3p表達(dá)和仙茅苷對高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞炎癥損傷的作用 與HG+仙茅苷+anti-miR-NC 組相比，HG+仙茅苷（50 μmol/L）+anti-miR-1247-3p組miR-1247-3p表達(dá)水平降低，IL-6、TNF-α水平升高，細(xì)胞凋亡率升高，Cleaved-caspase3和Cleaved-caspase9蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05，圖3、表6、表7）。

表6 下調(diào)miR-1247-3p表達(dá)和仙茅苷對高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞miR-1247-3p表達(dá)和炎癥因子的作用（±s，n=9）Tab.6 Effect of down-regulation of miR-1247-3p expression and curculigoside on miR-1247-3p expression and inflammatory factors in renal tubular epithelial cells induced by high glucose （±s，n=9）

表6 下調(diào)miR-1247-3p表達(dá)和仙茅苷對高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞miR-1247-3p表達(dá)和炎癥因子的作用（±s，n=9）Tab.6 Effect of down-regulation of miR-1247-3p expression and curculigoside on miR-1247-3p expression and inflammatory factors in renal tubular epithelial cells induced by high glucose （±s，n=9）

Note：Compared with HG+curculigoside+anti-miR-NC group， 1）P＜0.05.

Groups HG+curculigoside+anti-miR-NC HG+curculigoside+anti-miR-1247-3p t P miR-1247-3p 1.00±0.00 0.42±0.041）43.500 0.000 IL-6/（pg·ml-1）54.75±4.92 108.73±10.031）14.496 0.000 TNF-α/（pg·ml-1）26.91±3.09 73.71±5.741）21.537 0.000

表7 下調(diào)miR-1247-3p表達(dá)和仙茅苷對高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞凋亡的作用（±s，n=9）Tab.7 Effect of down-regulation of miR-1247-3p expression and curculigoside on apoptosis of renal tubular epithelial cells induced by high glucose （±s，n=9）

表7 下調(diào)miR-1247-3p表達(dá)和仙茅苷對高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞凋亡的作用（±s，n=9）Tab.7 Effect of down-regulation of miR-1247-3p expression and curculigoside on apoptosis of renal tubular epithelial cells induced by high glucose （±s，n=9）

Note：Compared with HG+curculigoside+anti-miR-NC group， 1）P＜0.05.

Groups HG+curculigoside+anti-miR-NC HG+curculigoside+10.03±0.93 Apoptosis rate（%）anti-miR-1247-3p t P 25.23±2.181）19.240 0.000 0.35±0.03 0.75±0.051）20.580 0.000 0.24±0.02 0.55±0.041）20.795 0.000 Cleavedcaspase3 protein Cleavedcaspase9 protein

圖3 下調(diào)miR-1247-3p表達(dá)和仙茅苷對高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞凋亡的作用Fig.3 Effect of down-regulation of miR-1247-3p expression and curculigoside on apoptosis of renal tubular epithelial cells induced by high glucose

3 討論

糖尿病腎病發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，慢性炎癥反應(yīng)、腎小管上皮細(xì)胞凋亡、腎小管基底膜增厚、腎小管間質(zhì)纖維化等均與其相關(guān)，腎小管上皮細(xì)胞損傷可促進(jìn)多種炎癥因子分泌，導(dǎo)致間質(zhì)炎癥［9-11］。因此，抑制腎小管上皮細(xì)胞炎癥損傷是防治糖尿病腎病的重要途徑。研究表明中藥具有抑制腎小管上皮細(xì)胞損傷及炎癥作用［12-13］。研究報(bào)道仙茅苷預(yù)處理可減少過氧化氫誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，保護(hù)心肌細(xì)胞免受氧化損傷［14］。仙茅苷可激活PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)、抑制炎癥反應(yīng)從而減輕腦組織損傷，保護(hù)腦組織的結(jié)構(gòu)和功能［15］。本研究采用不同濃度仙茅苷處理高糖作用的HK-2細(xì)胞，結(jié)果顯示，隨著仙茅苷濃度增加，高糖損傷的腎小管上皮細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-6、TNF-α水平逐漸降低，細(xì)胞凋亡率及Cleaved-caspase3、Cleaved-caspase9蛋白表達(dá)水平逐漸降低，顯示出明顯的量效關(guān)系，提示仙茅苷能夠減輕高糖損傷腎小管上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)。

miRNA參與調(diào)控細(xì)胞損傷過程。研究報(bào)道m(xù)iR-1247-3p與機(jī)體炎癥反應(yīng)直接相關(guān)［16］。miR-1247-3p可參與調(diào)控肺泡上皮細(xì)胞損傷過程［17］。而miR-1247-3p對損傷的腎小管上皮細(xì)胞影響作用尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：高糖誘導(dǎo)損傷HK-2細(xì)胞中miR-1247-3p表達(dá)水平降低，miR-1247-3p過表達(dá)后，IL-6、TNF-α水平降低，HK-2細(xì)胞凋亡率及Cleaved-caspase3、Cleaved-caspase9蛋白表達(dá)水平降低；表明miR-1247-3p過表達(dá)可抑制高糖作用的腎小管上皮細(xì)胞凋亡及炎癥反應(yīng)。本研究還發(fā)現(xiàn)仙茅苷能增加miR-1247-3p表達(dá)水平，且通過antimiR-1247-3p驗(yàn)證了下調(diào)miR-1247-3p表達(dá)可逆轉(zhuǎn)仙茅苷對高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞炎癥損傷。提示仙茅苷可能通過上調(diào)miR-1247-3p表達(dá)，從而減少高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)與細(xì)胞凋亡。