以丙三醇為穩(wěn)定劑的精漿檢測質(zhì)控品性能評價

張 琛， 李 婷， 孟慶昊， 謝 楠， 張為民， 趙 飛， 李 敏， 高 選， 楊斯桀

（山東大學(xué)附屬生殖醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗科，山東 濟(jì)南 250001）

精漿生化分析是用于評估男性生殖能力的重要的檢驗項目，涵蓋許多用于診斷男性不育和男性生殖系統(tǒng)疾病的生化標(biāo)志物。精漿生化檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性對于臨床診療尤為重要。陸金春等[1]開展的精漿生化檢測項目外部質(zhì)控調(diào)研結(jié)果顯示，男科學(xué)實驗室開展的精漿果糖、α-葡萄糖苷酶檢測結(jié)果差異很大，有必要標(biāo)準(zhǔn)化，男科實驗室應(yīng)建立有效的質(zhì)控措施[2]。精漿生化指標(biāo)的全自動檢測均應(yīng)帶有相應(yīng)項目的商品化或自制質(zhì)控品[3]。目前的精漿生化質(zhì)控品大部分為原廠適配試劑，無法檢測試劑批次/盒間或患者樣本偏移趨勢，而精漿生化檢測項目又缺乏第三方的質(zhì)控品，故實驗室自制精漿生化質(zhì)控品是目前進(jìn)行室內(nèi)質(zhì)控較好的選擇。自制質(zhì)控品與商品化質(zhì)控品比較，其優(yōu)勢是不受運輸條件影響，且為人源性樣本，能夠最大程度減少基質(zhì)效應(yīng)，更真實、準(zhǔn)確地反映檢測系統(tǒng)的穩(wěn)定性。有研究發(fā)現(xiàn)，丙三醇是蛋白類項目質(zhì)控品比較好的穩(wěn)定劑[4]。本研究選用丙三醇作為穩(wěn)定劑配制精漿生化質(zhì)控品，并與未加入任何穩(wěn)定劑的精漿原液進(jìn)行對比，分別對2種質(zhì)控品的均勻性、穩(wěn)定性和實驗室日常質(zhì)控結(jié)果進(jìn)行評價，以期獲得穩(wěn)定、低成本的質(zhì)控品，規(guī)范精漿生化項目的檢測。

1 材料和方法

1.1 研究對象

收集2019年11—12月山東大學(xué)附屬生殖醫(yī)院進(jìn)行精液檢測的精液樣本。要求受檢者禁欲2～7 d，采用手淫法留取精液樣本，收集1次射精的全部精液于清潔、無毒、密閉的取精管內(nèi)（深圳博銳德公司），置于37 ℃水浴箱中完全液化。納入標(biāo)準(zhǔn)：精液完全液化，pH值≥7.2，精子活動率≥50%，前向運動精子百分率≥40%；受檢者乙型肝炎、丙型肝炎、梅毒、人類免疫缺陷病毒篩查結(jié)果為陰性，無生殖道或泌尿系統(tǒng)感染。本研究通過山東大學(xué)附屬生殖醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核。

1.2 方法

1.2.1 分離精漿 將符合要求的患者剩余精液樣本3 000×g離心15 min，取上層精漿，混合后制備成質(zhì)控品，使用漩渦振蕩器將其充分混勻。

1.2.2 分組 根據(jù)實驗?zāi)康膶⒒旌暇珴{分為2份，其中1份加入占精漿體積30%的丙三醇溶液（A組），另1份不加入任何穩(wěn)定劑（B組）。

1.2.3 分裝保存 將充分混勻后的精漿生化質(zhì)控品一邊用一次性吸管吹打使其一直保持混勻狀態(tài)，一邊用移液器分裝于eppendorf管內(nèi)，每管500 μL，每組各制作180管，置于-20 ℃冰箱凍存。

1.2.4 檢測 采用Chemwell BRED 2900型全自動精漿生化免疫分析儀（美國Awareness公司）檢測精漿果糖和精漿中性α-葡萄糖苷酶，試劑盒購自深圳博銳德公司。

1.3 精漿生化質(zhì)控品的性能評價

根據(jù)CNAS-GL03《能力驗證樣品均勻性和穩(wěn)定性評價指南》[5]的要求對精漿生化質(zhì)控品的均勻性和穩(wěn)定性進(jìn)行性能評價。（1）均勻性評價。隨機(jī)抽取2種質(zhì)控品各10管，于室溫下放置15 min后融化混勻，連續(xù)檢測每管質(zhì)控品2次并記錄數(shù)據(jù)，并進(jìn)行單因素方差分析，根據(jù)F值查表判斷質(zhì)控品是否均一。（2）穩(wěn)定性評價。分別于質(zhì)控品配制后的第1、8、15、22、29、36、43、50、57、64、71、78、85天隨機(jī)抽取2種質(zhì)控品各3支，置于液氮罐中保存。于第86天將定期抽取的質(zhì)控品從液氮罐中取出，置于室溫下放置15 min后融化混勻，每管質(zhì)控品連續(xù)檢測2次，并記錄數(shù)據(jù)。檢測方法：質(zhì)控品配制后每7天從-20 ℃冰箱內(nèi)取出6份樣本置于液氮罐內(nèi)保存，至第85天時從液氮罐內(nèi)全部取出進(jìn)行檢測，每管質(zhì)控品連續(xù)檢測2次并記錄數(shù)據(jù)，并進(jìn)行t檢驗，根據(jù)t值查表判斷質(zhì)控品是否穩(wěn)定。（3）2種精漿生化質(zhì)控品每日常規(guī)檢測。每天取出2種質(zhì)控品各1支，隨當(dāng)日臨床標(biāo)本進(jìn)行精漿果糖和精漿中性α-葡萄糖苷酶檢測，并記錄數(shù)據(jù)，連續(xù)檢測30 d，根據(jù)30個數(shù)據(jù)點計算、s和變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）。（4）A組精漿生化質(zhì)控品的長期日常質(zhì)控檢測。根據(jù)前期實驗結(jié)果，選定A組作為實驗室長期使用的精漿生化質(zhì)控品，連續(xù)檢測6個月，并記錄數(shù)據(jù)，根據(jù)所得數(shù)據(jù)點計算、s和CV。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

1.4.1 均勻性 采用Excel軟件統(tǒng)計均勻性檢驗數(shù)據(jù)，并進(jìn)行單因素方差分析，分別計算2個組的F值。在每次抽取10個樣本，每個樣本測定2次的條件下，F(xiàn)臨界值為F0.05（9，10）=3.02，若計算所得的F值＜3.02，表示質(zhì)控品的均勻性較好。

1.4.2 穩(wěn)定性 采用Excel軟件統(tǒng)計穩(wěn)定性檢驗數(shù)據(jù)，并進(jìn)行t檢驗，分別計算2個組的t值。在穩(wěn)定性評價測定6次（每次3管，每管測定2次）的條件下，t臨界值為t0.05（5）=2.57，若計算所得的t值＜2.57，表示質(zhì)控品的穩(wěn)定性較好。

1.4.3 日常質(zhì)控數(shù)據(jù)處理 采用SPSS 19.0軟件比較2個組的CV。正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用±s表示，比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 均勻性檢驗結(jié)果

2種精漿生化質(zhì)控品精漿果糖和精漿中性α-葡萄糖苷酶的F值均＜3.02，均勻性較好。見表1。

表1 2個組精漿生化質(zhì)控品均勻性檢測結(jié)果

2.2 穩(wěn)定性檢驗

將2種精漿生化質(zhì)控品第8、15、22、29、36、43、57、64、71、78、85天的質(zhì)控數(shù)據(jù)分別與第1天的質(zhì)控數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗，結(jié)果顯示，A組第8、15、22、29天的精漿果糖質(zhì)控數(shù)據(jù)所得t值均＜2.57（臨界值），提示29 d內(nèi)A組質(zhì)控品的精漿果糖項目穩(wěn)定；B組質(zhì)控品的精漿果糖數(shù)據(jù)從第8天開始計算，所得t值＞2.57，提示B組質(zhì)控品的精漿果糖項目在8 d內(nèi)無法保持穩(wěn)定。A組的精漿中性α-葡萄糖苷酶結(jié)果在實驗期間所得t值均＜2.57，提示A組質(zhì)控品的精漿中性α-葡萄糖苷酶項目在85 d內(nèi)均穩(wěn)定；B組質(zhì)控品在第8、15、22、29天的精漿中性α-葡萄糖苷酶質(zhì)控數(shù)據(jù)所得t值均＜2.57，提示29 d內(nèi)B組質(zhì)控品的精漿中性α-葡萄糖苷酶項目穩(wěn)定。見表2。

表2 2個組2種精漿生化質(zhì)控品穩(wěn)定性評價結(jié)果（t值）

2.3 每日常規(guī)質(zhì)控檢測結(jié)果

對2種精漿生化質(zhì)控品分別連續(xù)進(jìn)行30 d的檢測，得到20個質(zhì)控數(shù)據(jù)，結(jié)果顯示，2種精漿生化質(zhì)控品檢測結(jié)果均分布在±2s范圍內(nèi)，CV的變化均在10%以內(nèi)。2個組CV差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），即2個組質(zhì)控品均可滿足日常質(zhì)控要求。2個組質(zhì)控品精漿中性α-葡萄糖苷酶項目批間精密度（CV）均優(yōu)于精漿果糖項目。見表3。

表3 精漿生化質(zhì)控品常規(guī)檢測結(jié)果比較

2.4 A組、B組質(zhì)控品長期室內(nèi)質(zhì)控檢測情況

A組質(zhì)控品均一性、穩(wěn)定性均較好，可用于日常質(zhì)控檢測。靶值和s的設(shè)定為日常檢測前累計30 d的數(shù)據(jù)，使用A組質(zhì)控品進(jìn)行為期6個月的室內(nèi)質(zhì)控檢測，共累計116個數(shù)據(jù)點；使用B組質(zhì)控品進(jìn)行為期4個月的室內(nèi)質(zhì)控檢測，共累計97個數(shù)據(jù)點，其中A組2個項目CV的變化均＜15%，B組質(zhì)控品2個項目的CV均高于A組，精密度與A組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表4。

表4 精漿生化質(zhì)控品常規(guī)檢測結(jié)果對比

3 討論

隨著輔助生殖技術(shù)的迅速發(fā)展，目前開展精漿生化項目檢測的男科實驗室數(shù)量急速增多，在為臨床診斷提供更多選擇的同時，隨之而來的問題是精漿生化項目檢測在質(zhì)量控制上的短板。室內(nèi)質(zhì)控是保證實驗室檢測質(zhì)量非常重要的一個環(huán)節(jié)，均勻、穩(wěn)定的質(zhì)控品非常重要。目前，國內(nèi)商品化精漿質(zhì)控品存在價格高、使用周期短的問題，男科實驗室自制精漿質(zhì)控品有較大的意義。

理想的臨床化學(xué)檢驗質(zhì)控品應(yīng)具備有人源基質(zhì)特征、無傳染性、添加劑和調(diào)制物的數(shù)量盡可能少、瓶間變異小、穩(wěn)定時間足夠長等特點[6]。本研究自制精漿生化質(zhì)控品均為人源精液，避免了基質(zhì)效應(yīng)，樣本選擇無傳染性的樣本，僅添加丙三醇作為調(diào)制物，均一性和穩(wěn)定性均良好，滿足自制質(zhì)控品的全部要求。本研究在添加丙三醇的同時對質(zhì)控品的濃度進(jìn)行了調(diào)節(jié)，A組中加入質(zhì)控品體積30%的丙三醇，故其檢測值均低于B組的30%；通過調(diào)節(jié)精漿原液的取用量，可以獲得不同濃度的質(zhì)控品。本研究良好的均一性驗證結(jié)果證實了精液選擇與分裝方法的有效性。精液液化不良會導(dǎo)致儀器檢測時出現(xiàn)吸樣不足或失敗，從而產(chǎn)生隨機(jī)誤差。本研究在分裝混合精漿時時刻保持混勻狀態(tài)，采用邊使用一次性吸管反復(fù)吹打邊混勻邊分裝的方法，直至分裝完畢，以保證各管質(zhì)控品的均一性，結(jié)果顯示，該方法配制的精漿生化質(zhì)控品的均勻性好，穩(wěn)定周期更長，可減少配制次數(shù)，以縮小質(zhì)控品批間差帶來的偏移。

精漿富含糖類、脂類和蛋白質(zhì)，保持其中有活性的酶類的穩(wěn)定是制備精漿生化質(zhì)控品需關(guān)注的問題。本研究的穩(wěn)定性驗證結(jié)果顯示，A組精漿果糖項目在29 d內(nèi)于-20℃保存穩(wěn)定性較好，精漿中性α-葡萄糖苷酶在85 d內(nèi)于-20℃保存穩(wěn)定性較好，A組質(zhì)控品2個項目的穩(wěn)定性均優(yōu)于B組，與張志強(qiáng)等[4]將丙三醇用于酶蛋白類檢測項目的質(zhì)控品穩(wěn)定性較好的結(jié)果一致。本研究分別對加入丙三醇配制的精漿質(zhì)控品和未加入任何穩(wěn)定劑的精漿原液質(zhì)控品進(jìn)行比較，以期能夠評價更易普及的精漿生化質(zhì)控品配制方法，為男科實驗室室內(nèi)質(zhì)控的常規(guī)開展提供更優(yōu)的選擇。丙三醇通常用于室間質(zhì)評樣本保存，本研究結(jié)果顯示，質(zhì)控品內(nèi)添加丙三醇作為穩(wěn)定劑可使質(zhì)控品穩(wěn)定1個月左右，這對于室間質(zhì)評樣本檢測和結(jié)果回報后的復(fù)測分析來說是足夠的。開展精漿生化項目室間質(zhì)評需考慮質(zhì)控品在常溫運輸條件下的穩(wěn)定性，后續(xù)將模擬常溫下運輸對于質(zhì)控品穩(wěn)定性的影響，以便于開展大范圍的室間質(zhì)評。

CV是重要的室內(nèi)質(zhì)控參數(shù)。本研究結(jié)果顯示，精漿果糖項目的批間精密度較精漿中性α-葡萄糖苷酶大，原因可能是丙三醇的化學(xué)結(jié)構(gòu)有利于維持中性α-葡萄糖苷酶的穩(wěn)定，而對于糖類的穩(wěn)定作用不明顯，且果糖化學(xué)結(jié)構(gòu)中的羥基易被氧化，較蛋白類的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性較差。本研究30 d常規(guī)質(zhì)控數(shù)據(jù)顯示，A組和B組精漿果糖項目的CV均＜10%，精漿中性α-葡萄糖苷酶的CV均＜5%，2個組CV的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。本研究A組質(zhì)控品6個月監(jiān)測數(shù)據(jù)顯示，2個項目的CV均＜15%，滿足英國男科學(xué)會提出的精液分析CV應(yīng)＜20%的要求[7]，提示質(zhì)控品的精密度較好。本研究中，日常質(zhì)控數(shù)據(jù)中存在超出2s的數(shù)據(jù)點，可能為試劑或質(zhì)控品存在瓶間差引起的偶然誤差，后續(xù)進(jìn)行質(zhì)控檢測時，應(yīng)對試劑配制、質(zhì)控品開瓶等操作信息進(jìn)行記錄，以便回顧異常質(zhì)控數(shù)據(jù)，并分析原因，同時加強(qiáng)人員培訓(xùn)，推行標(biāo)準(zhǔn)化操作，減少誤差。隨著質(zhì)控品使用時間的延長，本研究數(shù)據(jù)點離散度有所增大，這與質(zhì)控品的穩(wěn)定性隨時間延長而下降有關(guān)，但仍然控制在可接受范圍內(nèi)，但究竟穩(wěn)定期有多長，尚需要更長時間的室內(nèi)質(zhì)控監(jiān)測。

綜上所述，直接使用精漿原液作為日常質(zhì)控也能夠滿足室內(nèi)質(zhì)控的要求，但需要頻繁更換質(zhì)控品配制批次，調(diào)整靶值，不利于室內(nèi)質(zhì)控的長期監(jiān)測。使用丙三醇作為穩(wěn)定劑制備質(zhì)控品，并以丙三醇作為稀釋液調(diào)節(jié)質(zhì)控品所需的濃度水平，可滿足室內(nèi)質(zhì)控要求。實驗室應(yīng)制定質(zhì)控品制備的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，保證較小的瓶間差異，從而滿足男科實驗室室內(nèi)質(zhì)控的需求。