CRISPR/Cas技術(shù)在脊髓損傷修復研究中的應用

魏家寶 林俊卿 鄭憲友

脊髓損傷會導致患者損傷平面以下的運動、感覺功能障礙，并伴有排尿和排便障礙、呼吸困難、腸道菌群紊亂等并發(fā)癥[1-4]。我國每年新增約60 000例脊髓損傷患者[5-6]，而針對脊髓損傷的治療方法效果不佳，亟需探索新的治療模式。

基因編輯是一種有潛力的新模式。細菌中成簇存在具有規(guī)律間隔的短回文重復序列（CRISPR）[7]，它們是原核生物抵抗病毒入侵的有效手段。Cas基因編碼的Cas蛋白可與CRISPR序列區(qū)域發(fā)生作用，通 過CRISPRa、CRISPRi、CRISPRoff等 工 具[8-9]與遺傳修飾調(diào)控因子組合，借助向?qū)NA實現(xiàn)對靶基因的調(diào)控。該類技術(shù)具有特異、靈敏、快速、便捷等特點，可廣泛應用于基因治療、分子檢測等領(lǐng)域。近年來，學者們發(fā)現(xiàn)CRISPR/Cas技術(shù)可以調(diào)控脊髓損傷的相關(guān)基因表達，使其可以作為一種治療方法用于脊髓損傷修復。同時諸多研究利用CRISPR/Cas技術(shù)發(fā)現(xiàn)了更多與脊髓損傷相關(guān)的基因，為脊髓損傷修復帶來新的突破口。本文回顧相關(guān)文獻，對CRISPR/Cas技術(shù)調(diào)控脊髓損傷相關(guān)基因促進脊髓損傷修復及作為分子檢測工具探索脊髓損傷相關(guān)未知基因的研究進展進行綜述。

1 脊髓損傷與相關(guān)基因表達水平的變化

CRISPR/Cas技術(shù)通過靶向上調(diào)或沉默特定基因，從而改變某些細胞因子、蛋白酶的表達。在研究某一疾病時，可以利用CRISPR/Cas技術(shù)針對其誘發(fā)、進展及預后過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用的基因進行靶向調(diào)控，從而實現(xiàn)治療疾病的目的。脊髓損傷的病理生理過程極其復雜，損傷發(fā)生后可引起相關(guān)基因表達水平變化，而這些變化的關(guān)鍵基因被認為是治療脊髓損傷的潛在靶點。

脊髓損傷涉及損傷部位組織細胞凋亡、炎癥細胞浸潤、膠質(zhì)瘢痕形成、神經(jīng)血管再生等多個環(huán)節(jié)，各基因在這一過程中發(fā)揮各自的作用。在細胞凋亡方面，脊髓損傷后，與細胞凋亡相關(guān)的Bax、Fas基因的表達會上調(diào)，通過促進線粒體內(nèi)細胞色素C釋放，破壞DNA，形成死亡信號復合體，降解染色體，從而促使細胞凋亡[10]。而Bcl-2基因的表達上調(diào)可阻止細胞色素C釋放，抑制凋亡[11]。在炎癥細胞浸潤方面，脊髓損傷后，與炎癥反應相關(guān)的單核細胞趨化蛋白（MCP）-1[12]、巨噬細胞炎癥蛋白（MIP）-1α[13]基因的表達迅速上調(diào)，激活巨噬細胞釋放腫瘤壞死因子（TNF）-α、白細胞介素（IL）-1、IL-6等因子，使炎癥細胞在損傷區(qū)域聚集，參與繼發(fā)性脊髓損傷的調(diào)控。在膠質(zhì)瘢痕形成方面，脊髓損傷后，與膠質(zhì)瘢痕相關(guān)的膠質(zhì)細胞原纖維酸性蛋白（GFAP）基因表達上調(diào)，促進星形膠質(zhì)細胞的活化增生，封閉損傷區(qū)域形成膠質(zhì)瘢痕，在損傷前期可保護脊髓組織形態(tài)，在損傷后期則會抑制軸突生長[14]。在神經(jīng)血管再生方面，脊髓損傷后，再生基因蛋白（Reg）-2基因的表達迅速上調(diào)，促進施萬細胞分裂和軸突生長，同時也能促進產(chǎn)生多種神經(jīng)營養(yǎng)因子，促進神經(jīng)細胞存活[15]。同時，血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)基因的表達增加，促進血管再生，為脊髓損傷的修復提供良好的微環(huán)境[16]。這些在脊髓損傷各環(huán)節(jié)中表達的基因可以作為CRISPR/Cas技術(shù)編輯的象，通過調(diào)節(jié)其表達來促進脊髓損傷的恢復。

2 CRISPR/Cas技術(shù)應用于脊髓損傷治療的探索

2.1 調(diào)控脊髓損傷相關(guān)細胞因子

神經(jīng)組織在其生長分化過程中受到多種細胞因子的調(diào)控，包括膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（GDNF）、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）、神經(jīng)生長因子(NGF)、結(jié)締組織生長因子（CTGF）等。這些細胞因子在脊髓神經(jīng)生長分化的各階段都起到不可忽視的調(diào)控作用，利用CRISPR/Cas技術(shù)調(diào)節(jié)這些細胞因子的表達有助于促進脊髓損傷的修復。

GDNF參與腦中多巴胺神經(jīng)元的生長和維持，對損傷神經(jīng)元進行保護，同時促進損傷后神經(jīng)元的再生[17]。Khazaei等[18]利用CRISPR/Cas技術(shù)敲除DLK1基因后發(fā)現(xiàn)，GDNF能夠通過介導DLK1基因來調(diào)節(jié)Notch信號的表達，以促進星形膠質(zhì)細胞分化、突觸重建，從而達到促進脊髓損傷小鼠運動功能恢復的作用。這表明，利用CRISPR/Cas技術(shù)增強GDNF表達能夠促進脊髓損傷的恢復。

NGF是一種神經(jīng)營養(yǎng)蛋白，其可激活傷害性神經(jīng)元，將疼痛信號從周圍傳遞至中樞神經(jīng)系統(tǒng)，并通過酪氨酸激酶受體發(fā)出信號，從而對神經(jīng)元產(chǎn)生作用[19]。目前，鼠源NGF（mNGF）已用于治療各種神經(jīng)元和非神經(jīng)元疾病。Gu等[20]利用CRISPR/Cas技術(shù)將NGF基因插入小鼠下頜下腺細胞，在小鼠下頜下腺中特異性表達人源NGF（hNGF），發(fā)現(xiàn)hNGF在人體細胞中的生物學活性明顯高于mNGF，其促進脊髓損傷修復的效果優(yōu)于mNGF，損傷部位軸突再生水平更高。這表明，可以利用CRISPR/Cas技術(shù)通過上調(diào)NGF表達來達到治療脊髓損傷的目的。

BDNF通過與酪氨酸激酶B結(jié)合，激活Ras-絲裂原激活蛋白激酶（MAPK）信號通路，增加BDNF基因及BCL-2基因的表達，其可以促進神經(jīng)生長發(fā)育[21]。Hsu等[22]利用CRISPR/Cas技術(shù)將BDNF基因插入大鼠脂肪干細胞后，將修飾后的脂肪干細胞植入脊髓損傷部位，發(fā)現(xiàn)其能夠促進施萬細胞遷移，同時促進神經(jīng)元增殖和神經(jīng)軸突生長。由此可見，利用CRISPR/Cas技術(shù)增強脊髓損傷部位BDNF表達能夠達到促進脊髓損傷恢復的目的。

CTGF上調(diào)能夠促進受損的神經(jīng)細胞間形成膠質(zhì)橋接，在細胞分化、組織遷移、腫瘤進展等方面具有重要意義[23]。Klatt等[24]研究發(fā)現(xiàn)，通過CRISPR/Cas技術(shù)增強CTGF表達后，斑馬魚脊髓損傷修復速度增快，游泳時間延長。這提示通過CRISPR/Cas技術(shù)增強CTGF表達有助于促進脊髓損傷的修復。

總而言之，在脊髓損傷的進展和恢復過程中，各環(huán)節(jié)都受到諸多細胞因子的調(diào)控，通過CRISPR/Cas技術(shù)來調(diào)節(jié)這些細胞因子的表達，能夠促進脊髓損傷的恢復。

2.2 調(diào)控蛋白酶

脊髓損傷后，受損的局部組織會出現(xiàn)氧化應激障礙、膠質(zhì)瘢痕形成、血管再生等多種病理生理過程，其間許多蛋白酶也發(fā)揮著不可忽視的作用，如磷酸酶及張力蛋白同源物（PTEN）、吡哆醛激酶（PDXK）、髓磷脂堿性蛋白（MBP）、C3補體等，利用CRISPR/Cas技術(shù)調(diào)節(jié)這些蛋白酶的表達有助于進一步探明脊髓損傷后各環(huán)節(jié)的進展過程。

PTEN蛋白具有磷酸酯酶的活性，可使磷脂酰肌醇三磷酸去磷酸化，從而抑制磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶（AKT）信號通路，抑制腫瘤細胞生長。Moses等[25]研究發(fā)現(xiàn)，先天性PTEN基因遺傳缺失可導致中樞神經(jīng)系統(tǒng)軸突再生。該實驗研究結(jié)果顯示，使用CRISPR/Cas技術(shù)沉默神經(jīng)細胞中的PTNE基因，可起到促進神經(jīng)細胞軸突再生的作用，提示CRISPR/Cas技術(shù)可通過調(diào)控PTEN基因表達來促進脊髓損傷修復。

PDXK是維生素B6的重要組成部分[26]，能夠抑制氧化應激反應，減少血管內(nèi)皮損傷，維持多種細胞生長發(fā)育。Xiong等[27]通過使用CRISPR/Cas技術(shù)敲除PDXK的靶標miRNA-339，結(jié)果脊髓橫斷面遠端皮質(zhì)中神經(jīng)軸突生長顯著增加，且皮質(zhì)神經(jīng)元細胞凋亡減少。這提示，除了直接編輯脊髓損傷相關(guān)DNA外，通過CRISPR/Cas技術(shù)敲除靶標RNA也是促進脊髓損傷恢復的一種方法。

MBP是一種髓鞘相關(guān)蛋白，具有絲氨酸蛋白酶活性。MBP通過切割細胞外蛋白L1細胞黏附分子，增強成年哺乳動物神經(jīng)元生長。MBP對神經(jīng)祖細胞軸突生長的刺激作用是通過抑制過氧化物酶體增殖物激活受體（PPAR）γ基因的表達而實現(xiàn)的。一些學者使用CRISPR/Cas技術(shù)敲除MBP基因，發(fā)現(xiàn)MBP通過MBP/L1cam/PPARγ信號通路促進軸突再生，這也進一步提示CRISPR/Cas技術(shù)可通過增加MBP基因表達來促進脊髓損傷的恢復[28-29]。

C3是血清中含量最高的補體成分，主要由巨噬細胞和肝臟合成，具有酶活性，在炎癥反應中發(fā)揮重要作用。Guo等[30]研究發(fā)現(xiàn)，通過CRISPR/as技術(shù)敲除C3相關(guān)基因能夠激活星形膠質(zhì)細胞，上調(diào)TNF-α的表達，使C3缺陷小鼠的神經(jīng)纖維再生得到改善。這表明，補體抑制也可能是促進中樞神經(jīng)系統(tǒng)再生的潛在靶向療法。

脊髓損傷進展和恢復過程中有諸多蛋白酶發(fā)揮著不可或缺的作用，通過CRISPR/Cas技術(shù)編輯基因來調(diào)節(jié)這些蛋白酶的水平，有望成為治療脊髓損傷的有效方法。

3 基于CRISPR/Cas技術(shù)的分子檢測在脊髓損傷領(lǐng)域的探索

隨著脊髓損傷相關(guān)研究不斷深入，研究人員需要篩查參與脊髓損傷病理生理學改變的大量未知基因，分子檢測工具是一種可用方法。常規(guī)分子檢測工具主要包括聚合酶鏈式反應、分子雜交技術(shù)以及基因芯片技術(shù)，這些技術(shù)操作復雜、花費昂貴，因此需要開發(fā)一種更快捷、更廉價、更靈敏的檢測技術(shù)。

CRISPR/Cas技術(shù)具有精準識別和切割核酸片段的能力，使其可用于分子檢測。CRISPR/Cas檢測平臺靈敏度高、速度快、無需大型設(shè)備，相較于傳統(tǒng)分子檢測方式有明顯優(yōu)勢。除了Cas9，Cas家族還有許多具有切割活性的蛋白。Cas13a能在CRISPR RNA（crRNA）引導下切割靶標RNA，之后仍能保持活性，進而切割其他RNA[31]；Cas12a也具有類似性質(zhì)，其能夠切割特異的靶標單鏈DNA[32]。此外，有學者開發(fā)出基于Cas14a的檢測平臺，相較于Cas12a，其與靶標結(jié)合的特異性更強，可用于需要單堿基分辨的檢測[33]。

基于這些檢測平臺， CRISPR/Cas技術(shù)可用于脊髓損傷等多個領(lǐng)域的分子診斷和篩查。Klatt Shaw等[34]以CRISPR雙鏈引導核糖核蛋白（dgRNP）誘變斑馬魚基因，通過28個dgRNP篩選出17個靶向基因，這些基因的誘變體在脊髓損傷后未能恢復游泳功能。此外，Keatinge等[35]使用CRISPR/Cas技術(shù)將合成CRISPR RNA（sCrRNA）注射入脊髓損傷部位，通過約350種sCrRNA靶向30個潛在的巨噬細胞相關(guān)基因后，篩查出4個影響軸突再生的基因（tgfb1a、tgfb3、tnfa、sparc），這4種突變體的軸突再生受到明顯抑制。這提示，可通過CRISPR/Cas技術(shù)增強這4種基因的表達來促進脊髓損傷的修復。Sox2是Sox轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一，通過高遷移率族蛋白介導，在早期胚胎發(fā)育階段對干細胞干性維持和神經(jīng)組織細胞增殖有重要作用，在生長發(fā)育后期其表達則會受到限制[36]。Tazaki等[37]通過研究蠑螈篩查得到脊髓生長發(fā)育的關(guān)鍵基因Sox2，蠑螈是唯一能在功能上再生肢體和脊髓所有細胞類型的四足動物，通過CRISPR/Cas介導的基因編輯，敲除蠑螈細胞中Sox2基因，蠑螈的脊髓生長發(fā)育出現(xiàn)異常，且再生功能消失。這表明可以通過CRISPR/Cas技術(shù)增強Sox2基因的表達來促進脊髓損傷的修復。

隨著基于CRISPR/Cas的分子檢測技術(shù)不斷進步，研究人員能夠更便捷、更高效地發(fā)現(xiàn)脊髓損傷某一病理過程中發(fā)揮作用的關(guān)鍵基因，進而開發(fā)新治療方案來促進脊髓損傷的恢復。通過CRISPR/Cas技術(shù)進行分子檢測能大大加快脊髓損傷領(lǐng)域的科研進展。

4 結(jié)語

脊髓損傷具有高發(fā)病率、高致殘率、高耗費及低齡化的特點，并產(chǎn)生很多并發(fā)癥，目前臨床上僅能采用常規(guī)的藥物治療和針對并發(fā)癥的輔助治療。CRISPR/Cas技術(shù)給治療脊髓損傷帶來新希望。通過CRISPR/Cas技術(shù)對在脊髓損傷過程中發(fā)揮重要作用的細胞因子、蛋白酶的相關(guān)基因進行編輯，達到了促進脊髓損傷恢復的效果。雖然在使用中也面臨著脫靶和遺傳毒性[38]的問題，但是隨著Cas9TX[39]、SuperFi-Cas9[40]等更先進的蛋白酶被開發(fā)，脫靶率顯著降低，CRISPR/Cas技術(shù)的安全性也大大提高。同時，基于CRISPR/Cas的分子檢測技術(shù)不斷發(fā)展，能不斷發(fā)現(xiàn)新的治療靶點，加速脊髓損傷領(lǐng)域的研究進展。