皮膚鱗狀細(xì)胞癌的腫瘤干細(xì)胞研究進(jìn)展

孫忠輝， 張國龍， 王秀麗

（1.上海市奉賢區(qū)皮膚病防治所，上海 201408；2. 同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院光醫(yī)學(xué)研究所/上海市皮膚病醫(yī)院，上海 200443）

皮膚鱗狀細(xì)胞癌（Cutaneous squamous cell carcinoma，cSCC）屬最常見的皮膚惡性腫瘤之一，好發(fā)年齡50～60歲，可發(fā)生于體表的任何部位，常在癌前病變光線性角化病的基礎(chǔ)上發(fā)生。cSCC起源于表皮或毛囊附屬器角質(zhì)形成細(xì)胞。眾多惡性腫瘤中存在腫瘤干細(xì)胞（Cancer stem cells，CSCs），已被得到證實(shí)。惡性腫瘤的進(jìn)展、轉(zhuǎn)移、耐藥和復(fù)發(fā)，CSCs對其都有影響，當(dāng)前針對 CSCs的靶向治療已成為一種有前途的惡性腫瘤干預(yù)策略。用于cSCC靶向治療的臨床藥物還不多，對CSCs的研究有助于這些藥物的開發(fā)。cSCC腫瘤干細(xì)胞與表皮干細(xì)胞（Epidermal stem cells，ESCs）有一定的相似性，發(fā)現(xiàn)兩者的差異性標(biāo)記物，從而進(jìn)一步明確兩者信號通路的差別，可以為開發(fā)靶向藥物奠定基礎(chǔ)。本文綜述目前cSCC中腫瘤干細(xì)胞的起源、特性和其標(biāo)記物的研究進(jìn)展。

1 皮膚鱗狀細(xì)胞癌中腫瘤干細(xì)胞的起源

干細(xì)胞能在一定條件下無限自我更新與分化增殖，產(chǎn)生表型與基因型和其同樣的子代細(xì)胞，其具有多向分化潛能。目前證實(shí)在皮膚中干細(xì)胞有表皮干細(xì)胞、黑色素干細(xì)胞、真皮間充質(zhì)多能干細(xì)胞、內(nèi)皮干細(xì)胞和造血干細(xì)胞等5 種成體干細(xì)胞。這些細(xì)胞可產(chǎn)生相應(yīng)細(xì)胞譜系，最終發(fā)育并形成完整的皮膚。ESCs又稱上皮干細(xì)胞，是一種成體組織干細(xì)胞，包括毛囊間表皮（Interfollicular epidermis，IFE）、皮脂腺基底（Base of the sebaceous gland，BSG）和毛囊膨突部（Bulge of hair follicles，文獻(xiàn)習(xí)慣用毛囊干細(xì)胞HFs簡寫）干細(xì)胞，它們具有祖細(xì)胞作用，有自我更新能力和高度增殖能力。毛囊膨突部細(xì)胞是多能干細(xì)胞，通常其產(chǎn)生毛囊，但在皮膚損傷時(shí)可分化再生為表皮和皮脂腺細(xì)胞［1］。

腫瘤組織內(nèi)很大部分是只有增殖能力的腫瘤細(xì)胞，而腫瘤干細(xì)胞雖然僅一小部分，但能形成新的腫瘤克隆。它是慢細(xì)胞周期和永生化的起源驅(qū)動(dòng)細(xì)胞，具有自我更新和分化能力。惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)往往是由于CSCs沒有被完全消滅［2］。腫瘤細(xì)胞通常是正常細(xì)胞經(jīng)歷4 ～7 次突變后形成。占表皮大多數(shù)的角質(zhì)形成細(xì)胞如持續(xù)暴露在紫外線（Ultraviolet，UV ）、化學(xué)致癌物和人乳頭瘤病毒（Human papillomavirus，HPV）感染等環(huán)境中，獲得致癌突變的能力會(huì)增高。在表皮，大多數(shù)獲得突變的細(xì)胞都是在正常分化過程的終末中出現(xiàn)，而腫瘤的發(fā)展通常需要不止一次突變，因而皮膚腫瘤的發(fā)生相對較少。CSCs和正常干細(xì)胞具有部分相似的生物學(xué)特性。皮膚表皮中的CSCs來源于表皮干細(xì)胞（Epidermal stem cells，ESCs）［1］，ESCs也需要經(jīng)歷突變才能成為CSCs。ESCs具有形成腫瘤的能力，但是在致突變后克隆擴(kuò)增的驅(qū)動(dòng)因素出現(xiàn)前，它們盡管可能攜帶這些突變卻在表型上一直是正常的。相較正常表皮干細(xì)胞，此階段的ESCs及其子代具有明顯異質(zhì)性，它們具有更長的細(xì)胞周期，更強(qiáng)的修復(fù)能力，但是顯然它們的癌變趨勢明顯增強(qiáng)［3］。

現(xiàn)有研究［4］證實(shí)，cSCC的起源細(xì)胞為表皮干細(xì)胞。二甲苯蒽（DMBA）/ 十四烷醋酸佛波醇（TPA）是一種常用的致cSCC的物質(zhì)。研究［5］發(fā)現(xiàn)在DMBA治療1年后給予TPA的小鼠與在DMBA治療后立即暴露于TPA的小鼠相似，都會(huì)發(fā)生癌癥；無論何時(shí)給予TPA，腫瘤潛伏期都非常短。該研究表明cSCC中DMBA誘導(dǎo)的腫瘤干細(xì)胞是長壽命、慢循環(huán)的細(xì)胞，cSCC起源于表皮干細(xì)胞（ESCs），也就是毛囊間表皮干細(xì)胞（IFE）和毛囊膨突部細(xì)胞（HFs），因此cSCC中的CSCs也被認(rèn)為起源于ESCs。然而僅獲得干細(xì)胞特征還不足以導(dǎo)致這些ESCs惡性轉(zhuǎn)化，研究表明特定類型或部位的細(xì)胞發(fā)生突變更為重要［5］。例如，HFs干細(xì)胞中如出現(xiàn)Harvey-Ras（H-Ras）表達(dá)通常具有高惡變能力，但當(dāng)這種突變在IFE表皮干細(xì)胞中出現(xiàn)時(shí)，病變很少是惡性的，只有良性腫瘤生長（乳頭狀瘤形式）。這表明IFE起源的惡性腫瘤生長與其他促進(jìn)因素的持續(xù)影響有關(guān)，而與H-Ras是否激活無關(guān)。cSCC長期以來被認(rèn)為只是起源于HFs，但目前研究證明CSCs也可以來自IFE。維持完整的HFs 表皮干細(xì)胞，同時(shí)去除IFE 表皮干細(xì)胞，形成良性瘤和cSCC的能力都會(huì)降低。HFs突變成cSCC的能力降低表明cSCC起源細(xì)胞不僅來自HFs，也存在于IFE中［1］。

2 皮膚鱗狀細(xì)胞癌中腫瘤干細(xì)胞的可塑性和異質(zhì)性

CSCs的可塑性（Plasticity）是指其具有轉(zhuǎn)變?yōu)槎喾N不同類型細(xì)胞的能力，而異質(zhì)性（Heterogeneity）是指其子代與親代及不同子代之間，表型或基因型方面的差異性。由于大多數(shù)惡性腫瘤含有以上特征的CSCs，因而這些腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)機(jī)制非常復(fù)雜，同時(shí)也造成了治療的難度。

正常干細(xì)胞（SCs）定植在專門的微環(huán)境中，即所謂的壁龕（Niche）。外部信號可以調(diào)節(jié)干細(xì)胞狀態(tài)及其后代的生物特性。在cSCC，皮膚由于長期暴露于紫外線、化學(xué)物或者HPV感染，在特定的調(diào)節(jié)信號表達(dá)或癌基因的激活參與下，SCs可轉(zhuǎn)化為CSCs［6］。這種可塑性變化與微環(huán)境中上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）密切相關(guān)。例如，毛囊膨突部干細(xì)胞（HFs）可以在Kras G12D表達(dá)和腫瘤抑制因子Tp53功能喪失時(shí)充當(dāng)cSCC的起源腫瘤細(xì)胞。而環(huán)氧合酶-2（Cox-2）可以調(diào)節(jié)上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)變，能介導(dǎo)間充質(zhì)樣梭形細(xì)胞cSCC（預(yù)后較差的cSCC，鱗狀細(xì)胞分化特征基本喪失）的形成。學(xué)者研究［7］利用工具鼠krt 15-crePR+ 在HFs中使癌基因Ras/Tp53相應(yīng)表達(dá)誘導(dǎo)產(chǎn)生具有間充質(zhì)特征的cSCC形成，然后下調(diào)并抑制Cox-2的功能，結(jié)果顯示HFs來源的腫瘤間充質(zhì)轉(zhuǎn)化特征明顯減少，而且腫瘤逐漸轉(zhuǎn)化為具有上皮特征，向良性轉(zhuǎn)化。

間充質(zhì)細(xì)胞表型的獲得使惡性腫瘤細(xì)胞容易侵襲和轉(zhuǎn)移。EMT激活的過程涉及到一定的細(xì)胞因子和信號分子［8］。目前認(rèn)為，轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）是最重要的因子之一。cSCC侵襲進(jìn)展過程中，CSCs能與腫瘤微環(huán)境相互作用。TGF-β上調(diào)引起CSCs釋放IL-33作為信號，促進(jìn)微環(huán)境募集ST2+造血祖細(xì)胞分化為FcεRIα+的巨噬細(xì)胞。FcεRIα+巨噬細(xì)胞又會(huì)釋放TGF-β，由此產(chǎn)生富含TGF-β的微環(huán)境，激活TGF-β信號，進(jìn)一步釋放CSCs相關(guān)功能，如NRF2介導(dǎo)的抗氧化反應(yīng)［9］，促進(jìn)cSCC發(fā)展。

腫瘤都存在異質(zhì)性，CSCs導(dǎo)致cSCC中的異質(zhì)性與所涉及的特定癌基因有關(guān)。過渡擴(kuò)充細(xì)胞（Transit-amplifying cell，TACs）是一種中間體，其介于干細(xì)胞和完全分化細(xì)胞之間。正常情況下，具有譜系限制性的TACs子代缺乏產(chǎn)生腫瘤，甚至良性乳頭狀瘤的能力。HFs中，對KrasG12D突變的反應(yīng)是角質(zhì)形成細(xì)胞過度增殖和去分化（乳頭狀瘤形式）。有研究表明盡管上游信號通路MAPK和AKT-S6表達(dá)均增加，但攜帶KrasG12D的TACs細(xì)胞表型依然能保持正常［10］。TACs細(xì)胞無異常表型可能是由于突變癌基因表達(dá)不足，從而未能啟動(dòng)腫瘤發(fā)生。另一項(xiàng)研究中，同樣攜帶krasG12D 的HFs，在缺乏腫瘤抑制基因TP53的保護(hù)下，可發(fā)生cSCC。而且TP53如出現(xiàn)R172H突變和基因拷貝數(shù)改變會(huì)預(yù)后更差［11］。這些結(jié)果表明，特定癌基因或抑癌基因的激活和抑制決定了腫瘤的發(fā)生，并且可以出現(xiàn)在祖細(xì)胞、終末分化干細(xì)胞或低分化的TACs細(xì)胞中。因此，臨床cSCC中腫瘤的不同分化狀態(tài)可能與CSCs被特定基因如何激活有關(guān)。

原發(fā)的表皮腫瘤都起源于CSCs，然而特定基因突變的發(fā)生在不同情況下又可產(chǎn)生不同的腫瘤表型。角蛋白15（K15）是毛囊膨突干細(xì)胞的標(biāo)志物。利用其 K15+小鼠模型，Kras的G12D突變可引發(fā)良性乳頭狀瘤，但再在DMBA誘導(dǎo)下可引發(fā)cSCC［12］。KrasG12D突變合并Smad4缺失不僅可以導(dǎo)致該模型鼠的轉(zhuǎn)移性cSCC，而且還產(chǎn)生其他腫瘤，如基底細(xì)胞癌、毛發(fā)上皮瘤和皮脂腺瘤［13］?；准?xì)胞癌和cSCC的CSCs都起源于表皮IFE和HFs，它們不同表型的引起顯然與某些特定基因差異表達(dá)有關(guān)。近期有研究［14］表明基底細(xì)胞癌特異性基因（如GLI2、PTCH1/ 2、FZD7），在基底細(xì)胞癌細(xì)胞中高表達(dá)，但在cSCC中卻下調(diào)。顯然以上基因的表達(dá)在cSCC是抑癌因素，在基底細(xì)胞癌細(xì)胞中則是促癌因素。

3 皮膚鱗狀細(xì)胞癌中腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物及調(diào)控因子

目前，皮膚干細(xì)胞標(biāo)記物包括CD34、CD44、ABC家族成員、CDl33、整合素、P63、CD20、角蛋白15、角蛋白17和角蛋白19等。cSCC中皮膚CSCs與皮膚干細(xì)胞有一定的相似性，以上標(biāo)記物部分已被證實(shí)與皮膚鱗癌有關(guān)，比如CDl33［15］。但兩者之間有何明確的區(qū)別目前還不清楚，需要進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)兩者的差異性標(biāo)記。明確兩者信號通路的差異，選擇性殺傷皮膚腫瘤干細(xì)胞，避免損傷皮膚干細(xì)胞，對腫瘤的治療尤為重要［16］。

近期，在研究cSCC時(shí)發(fā)現(xiàn)腫瘤干細(xì)胞中一些與分類和發(fā)病有關(guān)的標(biāo)志物，這些標(biāo)志物備受人們的關(guān)注。①CD133 ： cSCC腫瘤干細(xì)胞的表面標(biāo)記物中最早可以作為分類標(biāo)志。Patel等［15］研究癌癥起始細(xì)胞（CIC）向皮膚腫瘤干細(xì)胞（CSC）轉(zhuǎn)化時(shí)，首先采用基于CD133是否表達(dá)的cSCC細(xì)胞系簡單分類，證明在異種移植模型中CD133陽性的CICs中含有異質(zhì)性cSCC，而CD133陰性細(xì)胞不能維持cSCC繼續(xù)發(fā)展［18］。除了細(xì)胞表面標(biāo)記物，cSCC腫瘤干細(xì)胞還可以根據(jù)醛脫氫酶（ALDH）和ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性進(jìn)行分類。②Survivin： Lotti等［17］最早提出表皮干細(xì)胞是皮膚腫瘤起源細(xì)胞。他們研究了皮膚干細(xì)胞的標(biāo)志物Survivin在cSCC展中的作用。siRNA敲除Survivin后減少了細(xì)胞克隆形成和細(xì)胞存活率，侵襲性降低。正常角質(zhì)形成細(xì)胞轉(zhuǎn)染致癌RAS逆轉(zhuǎn)錄 Q病毒和加入NF-κB抑制劑IκBαM可促進(jìn)Survivin的表達(dá)。但是這些細(xì)胞中敲除Survivin雖然可以減少增殖，但不能阻止異種移植模型中腫瘤的形成，只會(huì)延緩它們的發(fā)展。③SOX2 ： Siegle等［18］比較了小鼠cSCC的癌癥起始細(xì)胞（Cancer initiating cells，CIC）、HFs干細(xì)胞和表皮祖細(xì)胞中的基因表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)它們表達(dá)最顯著的是SOX2。通過免疫染色，證實(shí)SOX2在正常皮膚樣本中缺失，只在cSCC中存在。SOX2在腫瘤/間質(zhì)交界處的未分化細(xì)胞中表達(dá)，這些細(xì)胞來源于CSC微環(huán)境。SOX2基因敲除顯示腫瘤生長減少，表明SOX2在cSCC的發(fā)展中起促癌作用。研究還顯示SOX2從AK到cSCC譜系發(fā)展中表達(dá)均增加。④FRMD4A：有學(xué)者在鑒定IFE表皮干細(xì)胞時(shí)，發(fā)現(xiàn)FRMD4A是一個(gè)新的腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物［19］。通過Q-PCR對cSCC細(xì)胞上的14個(gè)表皮干細(xì)胞標(biāo)記物進(jìn)行檢測，證實(shí)FRMD4A是唯一一個(gè)在cSCC中持續(xù)上調(diào)明顯的基因［20］。它的表達(dá)為探索正常干細(xì)胞和腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物之間的關(guān)系提供了一種手段。FRMD4A可調(diào)節(jié)細(xì)胞間粘附并維持正常細(xì)胞中E-鈣粘蛋白（E-cad）的表達(dá)；在體外和體內(nèi)的異種移植模型中，人cSCC細(xì)胞系中FRMD4A的敲除降低了腫瘤細(xì)胞的克隆形成效率和生長潛力。從機(jī)制上講，F(xiàn)RMD4A的表達(dá)降低調(diào)節(jié)了Hippo通路，該通路與組織生長和癌癥發(fā)展控制有關(guān)［21］。⑤Lrig1： 它是IFE表皮內(nèi)的干細(xì)胞標(biāo)志物和EGFR的拮抗劑。在cSCC中，Lrig1陽性干細(xì)胞群中炎癥可以引起癌變。炎癥因子IL-17R能夠動(dòng)員Lrig1陽性的干細(xì)胞增多從而影響傷口愈合和腫瘤發(fā)生。IL-17R可以影響EGFR通路，Lrig1能夠起到腫瘤抑制因子作用［22］。⑥Lgr5是Wnt靶基因，腸上皮和毛囊的干細(xì)胞標(biāo)記物。在小鼠模型可發(fā)現(xiàn)在毛囊干細(xì)胞“壁龕”中的慢循環(huán)細(xì)胞中表達(dá)。移植和譜系追蹤實(shí)驗(yàn)表明，這些lgr5陽性細(xì)胞在很長一段時(shí)間內(nèi)保持了毛囊的所有標(biāo)志物，并可以構(gòu)建整個(gè)新的毛囊。最近，已有研究表明Lgr5在cSCC中表達(dá)上調(diào)，可作為腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物［23］。

以上是目前明確的皮膚干細(xì)胞標(biāo)志物，也是腫瘤干細(xì)胞的標(biāo)志物。它們的陽性表達(dá)可以區(qū)分出腫瘤干細(xì)胞。但它們并不精確，例如，CD133陽性細(xì)胞并不都是腫瘤干細(xì)胞，在非干細(xì)胞/祖細(xì)胞和非癌細(xì)胞中也可以檢測到ALDH活性增加。

另外，調(diào)控皮膚 cSCC 中腫瘤干細(xì)胞生長的因子還有① TGF-β可以促進(jìn)cSCC化療耐藥；② BMI1：與腫瘤自我更新和腫瘤發(fā)生有關(guān)；③ YAP1是Hippo 通路的關(guān)鍵下游效應(yīng)器，影響正常表皮和 cSCC 中干細(xì)胞的生長；④ Grhl3是保守的發(fā)育轉(zhuǎn)錄因子，與表皮分化、屏障形成有關(guān)，cSCC的發(fā)生起至關(guān)重要作用；⑤ TARC（CCL17）驅(qū)動(dòng)Grhl3 缺失模型中腫瘤細(xì)胞過度增殖；⑥ miR-204 的缺失在曬傷中驅(qū)動(dòng) STAT3 促炎反應(yīng)導(dǎo)致 cSCC 的發(fā)展；⑦ MEK1過度表達(dá)會(huì)促進(jìn)過度增殖和皮膚炎癥，導(dǎo)致乳頭狀瘤形成［24］。

4 結(jié)語

cSCC具有侵襲性并可向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，晚期、轉(zhuǎn)移性和免疫低下的患者非常適合生物治療（包括靶向和生物治療）。目前，在臨床開展成熟的主要藥物有EGFR抑制劑和免疫檢查點(diǎn)抑制劑，遠(yuǎn)不能滿足精準(zhǔn)治療的需求。幾乎所有惡性腫瘤都存在CSCs，其存在往往導(dǎo)致腫瘤易侵襲、易復(fù)發(fā)和治療抵抗。因此針對腫瘤干細(xì)胞治療將更加具有目的性，更加精準(zhǔn)，臨床患者也將獲益更大。腫瘤干細(xì)胞的治療策略主要有靶向CSCs標(biāo)志物、調(diào)節(jié)因子及相關(guān)異常信號通路［2］，靶抗原的特異性是成功根除CSCs和防止腫瘤復(fù)發(fā)的關(guān)鍵。盡管上文提到了多個(gè)在cSCC的CSCs標(biāo)志物，但由于cSCC是一種高突變負(fù)擔(dān)的腫瘤，就目前來說，以上所及并不是非常特異。但是，隨著研究的深入，相信未來會(huì)必將出現(xiàn)特異、敏感的cSCC的CSCs標(biāo)志物或調(diào)節(jié)因子，隨之也產(chǎn)生相應(yīng)的藥物去治愈cSCC。