血漿低分子量蛋白與多肽的研究進(jìn)展*

李 娜 蔡潭溪 楊福全**

（1）中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所，北京 100101；2）中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049）

低分子量蛋白與多肽（low molecular weight proteins and peptides，LMWPs）通常指復(fù)雜生物樣本中分子質(zhì)量≤30 ku 的所有蛋白質(zhì)及多肽，也被稱作多肽組。LMWPs 是繼基因組、轉(zhuǎn)錄組及蛋白質(zhì)組之后，更復(fù)雜的一種分子組合，造成其復(fù)雜程度如此高的原因主要有：a.體內(nèi)具有多種蛋白酶（超過(guò)550種）［1］；b.底物多樣性，即同種酶有多種底物；c.體內(nèi)存在多種蛋白酶抑制劑和激活劑。在龐大的蛋白酶調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中，體內(nèi)上百萬(wàn)的蛋白質(zhì)變體（proteoforms）可產(chǎn)生數(shù)量巨大的酶解產(chǎn)物［2］。血漿作為循環(huán)系統(tǒng)的一部分，不僅可以協(xié)助細(xì)胞、組織或器官之間進(jìn)行物質(zhì)交換，還可以攜帶大量來(lái)源不同的多肽、蛋白質(zhì)及其降解物等，而LMWPs以其分子質(zhì)量較小的優(yōu)勢(shì)，可通過(guò)血腦屏障、腫瘤等從組織或病灶進(jìn)入血漿。與血漿蛋白相比，LMWPs 的組成或豐度差異與疾病的相關(guān)性更強(qiáng)［3］。因此，血漿LMWPs 可用于病理生理的探究、生物標(biāo)志物的挖掘、治療靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)等。此外，通過(guò)血漿LMWPs也可以發(fā)現(xiàn)新的分子并進(jìn)一步探究其功能，例如新型活性肽［4］以及小開(kāi)放閱讀框編碼的多肽（sORF?encoded peptides，SEPs）。本文立足于當(dāng)前的研究熱點(diǎn)，綜述LMWPs的分類（圖1）及其應(yīng)用，以期為血漿LMWPs的研究與發(fā)展提供參考。

1 LMWPs的分類

1.1 完整小蛋白

血漿中常見(jiàn)的完整小蛋白包括激素、白介素、趨化因子、生長(zhǎng)因子和干擾素等，它們可參與調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化、炎癥、組織修復(fù)和免疫反應(yīng)等多種重要生物學(xué)過(guò)程，在腫瘤治療［5］、造血功能障礙［6］、自身免疫性疾?。?］等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。近年來(lái)，完整小蛋白的研究熱點(diǎn)是表征樣本中的蛋白質(zhì)變體，即來(lái)自同一基因所有形式的蛋白質(zhì)分子的集合，包括由遺傳變異、RNA 轉(zhuǎn)錄本選擇性剪接和翻譯后修飾（post?translational modifications，PTMs）引起的各類變化［8］。不過(guò)，隨著分子質(zhì)量增加，蛋白質(zhì)的離子化效率降低、質(zhì)譜信號(hào)抑制作用與擴(kuò)散作用增強(qiáng)，使得譜圖解析更加困難，從而阻礙了完整蛋白質(zhì)的檢測(cè)［9］。因此，在組學(xué)水平表征血漿中小蛋白的完整序列是一件充滿挑戰(zhàn)性的工作。

Fig.1 The classify of plasma LMWPs圖1 血漿LMWPs的組成

1.2 蛋白質(zhì)降解物

大部分LMWPs 是由蛋白質(zhì)經(jīng)酶解作用產(chǎn)生的多肽組成。根據(jù)催化機(jī)理，蛋白酶可分為5 大類，包括天冬氨酸類、半胱氨酸類、絲氨酸類、金屬蛋白酶類和其他類。在哺乳動(dòng)物體內(nèi)，蛋白酶可選擇性地切割特定的蛋白質(zhì)底物，以影響細(xì)胞的行為、存活和死亡［10］。研究發(fā)現(xiàn)，它們?cè)谀[瘤中的功能更加復(fù)雜與多樣［11?12］。轉(zhuǎn)移性癌癥的多種特征是蛋白酶活性發(fā)生變化直接導(dǎo)致的結(jié)果。蛋白酶通過(guò)介導(dǎo)蛋白質(zhì)、細(xì)胞外基質(zhì)降解過(guò)程來(lái)影響腫瘤細(xì)胞侵入間質(zhì)、血管生成和轉(zhuǎn)移；級(jí)聯(lián)蛋白水解相互作用控制著細(xì)胞凋亡，癌細(xì)胞在其發(fā)展為惡性腫瘤的過(guò)程中必須逃脫該調(diào)控過(guò)程；蛋白酶通過(guò)特異性裂解前體蛋白來(lái)激活其他蛋白酶或信號(hào)分子，如激酶和細(xì)胞表面受體，控制信號(hào)在腫瘤細(xì)胞與其他細(xì)胞之間進(jìn)行傳導(dǎo)。腫瘤中失調(diào)的蛋白酶可改變LMWPs的分子組成，而這些LMWPs不同于高分子質(zhì)量蛋白質(zhì)，易分泌至細(xì)胞外間質(zhì)，通過(guò)血管屏障最終釋放到循環(huán)系統(tǒng)中。Li 等［3］研究發(fā)現(xiàn)，與健康對(duì)照相比，羧肽酶N（carboxypeptidase N，CPN）在乳腺腫瘤組織中的表達(dá)水平上調(diào)，但在血漿中的含量沒(méi)有顯著變化。不過(guò)其催化產(chǎn)物C3f_R1310?L1319在血漿中的含量顯著增加，且該增加主要與早期乳腺癌相關(guān)，表明腫瘤微環(huán)境中失調(diào)的蛋白酶催化而產(chǎn)生的多肽片段可在血漿中被檢測(cè)到，且含量與腫瘤早期的病理變化有相關(guān)性，提示蛋白降解物可作為疾病早期的診斷標(biāo)志物。

1.3 神經(jīng)肽

在神經(jīng)元之間傳遞信號(hào)的一類多肽被稱為神經(jīng)肽。神經(jīng)肽來(lái)源于前體蛋白質(zhì)，以一種受調(diào)控的方式釋放，并通過(guò)與細(xì)胞表面的G蛋白偶聯(lián)受體或酶偶聯(lián)受體（如胰島素受體）結(jié)合，在中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮作用。它們作用的靶點(diǎn)包括神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞或非神經(jīng)元靶細(xì)胞，如腺體或肌細(xì)胞［13］。不同于經(jīng)典的神經(jīng)遞質(zhì)，這些神經(jīng)肽生理功能的調(diào)節(jié)不是通過(guò)特定的突觸再攝取機(jī)制實(shí)現(xiàn)，而是通過(guò)降解機(jī)制實(shí)現(xiàn)。它們不僅在神經(jīng)元中表達(dá)，也在大腦其他類型細(xì)胞（如膠質(zhì)細(xì)胞）和外周組織細(xì)胞（如內(nèi)分泌細(xì)胞）中表達(dá)［14］，影響著廣泛的生理過(guò)程，包括進(jìn)食、體重調(diào)節(jié)、晝夜節(jié)律、睡眠、疼痛、恐懼、焦慮、學(xué)習(xí)和記憶，以及獎(jiǎng)勵(lì)機(jī)制等［15］。中國(guó)肥胖人群隊(duì)列研究顯示，神經(jīng)肽Y（neuropeptide Y，NPY）在血清中的含量增加與代謝異常型肥胖（metabolically unhealthy obesity，MUO）表型存在正相關(guān)性［16］，且NPY過(guò)表達(dá)可導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因小鼠出現(xiàn)肥胖表型和胰島素抵抗［17］，表明NPY 與肥胖相關(guān)，提示神經(jīng)肽在血液循環(huán)中的含量變化可作為評(píng)價(jià)生理功能失調(diào)程度的指標(biāo)。此外，值得注意的是，根據(jù)人類基因組分析，100多個(gè)G 蛋白偶聯(lián)受體的配體未知［18］，因此識(shí)別特定細(xì)胞、組織或體液中與G 蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合的配體，可用于新型神經(jīng)肽的發(fā)現(xiàn)［19］。

1.4 免疫多肽

免疫多肽組指由主要組織相容性復(fù)合體（MHC）分子（在人類中稱為人類白細(xì)胞抗原，HLA）呈遞到細(xì)胞表面的所有多肽。其中，部分呈遞到細(xì)胞表面的HLA 分子及其結(jié)合的多肽被釋放到血漿中，形成血漿可溶性HLA 多肽組（soluble HLA?peptidome，sHLA）。sHLA 與呈遞到細(xì)胞表面的膜多肽組（membranal peptidomes，mHLA）類似，均由細(xì)胞蛋白質(zhì)降解產(chǎn)生的多肽組成［20］。當(dāng)處于病理狀態(tài)時(shí)，細(xì)胞產(chǎn)生并降解疾病相關(guān)的蛋白質(zhì)，然后將降解產(chǎn)生的多肽呈遞出來(lái)，因此HLA 多肽組可作為癌癥免疫治療靶點(diǎn)候選物來(lái)源之一［21］。此外，正常情況下，HLA 多肽組在人體內(nèi)保持相對(duì)穩(wěn)定，但在特定疾病影響下，細(xì)胞會(huì)向血漿中釋放比正常狀態(tài)下更多的sHLA 分子，所以血漿sHLA與疾病嚴(yán)重程度相關(guān)，可用于疾病潛在生物標(biāo)志物的挖掘［22］。Shraibman 等［23］通過(guò)對(duì)142 份多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（glioblastoma multiforme，GBM）患者血漿樣本的sHLA 和其中10例腫瘤樣本的mHLA進(jìn)行大規(guī)模質(zhì)譜鑒定分析，發(fā)現(xiàn)無(wú)論是分子組成還是含量sHLA和mHLA均有較強(qiáng)的相關(guān)性。此外，經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)篩選，作者也提供了多個(gè)GBM 早期診斷的潛在生物標(biāo)志物（如僅在GBM 中檢測(cè)到的來(lái)自SOX11 的多肽AHSASEQQL和NFSDLVFTY）以及免疫治療的潛在靶點(diǎn)（如來(lái)自ETV5的6條多肽）。這強(qiáng)有力地說(shuō)明，在癌癥生物標(biāo)志物和免疫抑制劑候選物篩選中，血漿sHLA 研究意義重大。總之，系統(tǒng)表征HLA多肽組有助于診斷、預(yù)防和治療感染性疾病、自身免疫病和癌癥等。

相較于其他類型的多肽，sHLA 多肽在富集技術(shù)上更具有優(yōu)勢(shì)，它們主要是利用HLA?A/B/C 單克隆抗體（W6/32）進(jìn)行富集純化，該方法簡(jiǎn)單且高效。

1.5 載體蛋白結(jié)合的LMWPs

血漿中蛋白質(zhì)濃度的高動(dòng)態(tài)范圍是限制血漿蛋白質(zhì)組及LMWPs研究的重要因素之一，例如白蛋白（albumin）是血漿中豐度最高的蛋白質(zhì)，含量高達(dá)50 g/L，遠(yuǎn)大于細(xì)胞因子等低豐度蛋白質(zhì)的含量（ng/L），嚴(yán)重阻礙了LMWPs 的發(fā)現(xiàn)與檢測(cè)。因此，在富集和提取血漿LMWPs時(shí)，去除被視為“污染蛋白”的高豐度蛋白質(zhì)是實(shí)驗(yàn)方法中的首要步驟。不過(guò)，白蛋白具有多種功能，包括維持血漿滲透壓，作為脂蛋白、小分子和藥物的載體等，同時(shí)，因分子質(zhì)量高于腎臟過(guò)濾和清除功能的界限，白蛋白成為L(zhǎng)MWPs 常見(jiàn)的天然循環(huán)載體。Mehta等［24］在其研究中提出了以下幾個(gè)發(fā)現(xiàn)與觀點(diǎn)：a.LMWPs 在循環(huán)載體蛋白上的累積極大地放大了潛在生物標(biāo)志物在血漿中的總濃度；b.血漿LMWPs 的濃度主要由載體蛋白而非其本身清除速率決定；c.與特定載體蛋白結(jié)合的LMWPs可能包含重要的診斷信息。隨后，許多研究人員將焦點(diǎn)轉(zhuǎn)向載體蛋白結(jié)合的LMWPs，試圖分析載體蛋白結(jié)合的LMWPs 與各類疾病之間的關(guān)系，包括卵巢癌［25］、子宮內(nèi)膜癌［26］、阿爾茨海默?。?7］、腦卒中［28］、酒精濫用［29］等。例如，Kikuchi等［26］在研究子宮內(nèi)膜癌患者和健康對(duì)照的血清白蛋白結(jié)合的多肽時(shí)，發(fā)現(xiàn)3 種多肽（m/z4769、6254 和11792）的質(zhì)譜信號(hào)強(qiáng)度在兩組之間存在顯著性差異。在這些研究中，質(zhì)譜技術(shù)分析載體蛋白結(jié)合的LMWPs已被證明是一種識(shí)別疾病潛在生物標(biāo)記物的有效手段。

1.6 小開(kāi)放閱讀框（sORF）編碼的多肽

一直以來(lái)，大多數(shù)尋找開(kāi)放閱讀框（ORF）的算法都將300 個(gè)核苷酸或100 個(gè)氨基酸作為最小檢測(cè)限，以降低假陽(yáng)性編碼區(qū)被檢測(cè)的可能性。然而，這種過(guò)濾方法直接導(dǎo)致一些小的具有蛋白質(zhì)編碼潛力的轉(zhuǎn)錄本被錯(cuò)誤地歸類為更大類別的非編碼RNA（ncRNAs）。近年來(lái)，核糖體圖譜結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)加速了這類SEPs或小蛋白（microproteins）的發(fā)現(xiàn)［30］。與經(jīng)典的多肽類激素或神經(jīng)肽不同，SEPs不是由前體蛋白經(jīng)酶解產(chǎn)生，而是由sORF直接翻譯而來(lái)，也屬于LMWPs。

迄今為止，許多研究發(fā)現(xiàn)了SEPs 的存在，并表明這類多肽在生長(zhǎng)發(fā)育［31］、機(jī)體調(diào)節(jié)［32］，以及疾病發(fā)生中（如癌癥［33］）具有重要作用。例如，由pri 基因編碼的SEP，可以引發(fā)轉(zhuǎn)錄因子Svb 的截短，使之從阻遏物轉(zhuǎn)變?yōu)榧せ钗?，影響果蠅的表皮分化過(guò)程［34］；在D’lima 等［35］研究中，lncRNA翻譯而成的NoBody 被證實(shí)位于P?bodies 中，與mRNA 脫帽蛋白（尤其是EDC4）存在相互作用，可調(diào)節(jié)P?body 的數(shù)量。該研究揭示，NoBody 是mRNA 脫帽復(fù)合物中的一個(gè)新成分，為SEPs 作為調(diào)節(jié)因子參與重要生物過(guò)程提供了新的證據(jù)；Pauli 等［36］發(fā)現(xiàn)，在斑馬魚(yú)原腸胚形成過(guò)程中，lncRNA 編碼的多肽Toddler，通過(guò)與APJ/Apelin 受體結(jié)合激活G 蛋白偶聯(lián)信號(hào)，促進(jìn)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)；Humanin 是Hashimoto 等在篩選阻止阿爾茨海默病患者神經(jīng)元死亡的相關(guān)因子時(shí)發(fā)現(xiàn)的，它可以影響B(tài)ax 定位，進(jìn)而阻止細(xì)胞死亡［37?38］。目前，SEPs的存在已被廣泛接受并引起了越來(lái)越多的關(guān)注。

雖然生物信息學(xué)結(jié)合核糖體圖譜技術(shù)在多種物種中預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)了大量SEPs［39?40］，但是證實(shí)這些SEPs 的表達(dá)較難。質(zhì)譜技術(shù)作為一種高通量的發(fā)現(xiàn)及驗(yàn)證手段，能夠檢測(cè)蛋白質(zhì)/多肽的分子質(zhì)量和氨基酸序列，目前已廣泛應(yīng)用于SEPs 表征和驗(yàn)證中。不過(guò)，SEPs 分子質(zhì)量小且濃度低，它們?cè)诟哓S度蛋白質(zhì)的掩蓋下很難被有效地富集和鑒定，所以如何有效地富集SEPs 至關(guān)重要。為此，Ma等［41］比較了幾種富集K562 細(xì)胞中SEPs 的方法，包括酸沉淀、30 ku分子截?cái)喑瑸V法及反相C8固相萃取法，結(jié)合其他參數(shù)的優(yōu)化，建立了一套高效表征細(xì)胞中SEPs 的方法。截至目前，細(xì)胞、組織、體液等樣本中均有大規(guī)模SEPs的鑒定報(bào)告。Zhang等［42］系統(tǒng)開(kāi)展了SEPs富集和鑒定方法學(xué)研究，從人源和鼠源細(xì)胞或組織中共鑒定到762條SEPs。Li等［43］首次報(bào)道了在血漿中鑒定到19 條SEPs，而Cai 等［44］也首次報(bào)道了在血漿外泌體中鑒定到48條SEPs。

2 LMWPs研究進(jìn)展及發(fā)展趨勢(shì)

2.1 LMWPs富集方法進(jìn)展

相較于蛋白質(zhì)組學(xué)持續(xù)、蓬勃的發(fā)展，LMWPs 相關(guān)研究處于相對(duì)滯后狀態(tài)，主要是因?yàn)檠獫{樣本具有蛋白質(zhì)豐度的高動(dòng)態(tài)范圍和組成的高度復(fù)雜性。長(zhǎng)期以來(lái)，研究血漿LMWPs受限于富集與分析方法。不過(guò)，近年來(lái)，隨著新方法、新技術(shù)的應(yīng)運(yùn)而生，LMWPs的研究也取得可喜進(jìn)展。

在富集血漿LMWPs 的策略中，去除高豐度蛋白質(zhì)是關(guān)鍵的一步，常用的方法有：有機(jī)溶劑沉淀法、分子截?cái)喑瑸V法、固相萃取法、親和法和凝膠分離法（圖2a）。雖然這些方法在一定程度上可降低血漿樣本的復(fù)雜性和動(dòng)態(tài)范圍，但高豐度蛋白質(zhì)去除的效果有限，質(zhì)譜定性分析的再現(xiàn)性差，例如，固相萃取法三次技術(shù)重復(fù)的結(jié)果僅有40%重疊［45］。所以，LMWPs相關(guān)研究迫切需要一種更高效、穩(wěn)定、便捷的富集或分離方法，以進(jìn)一步降低樣品的復(fù)雜性，便于利用組學(xué)手段研究其組成和變化情況。2017 年，悉尼大學(xué)Parker 等［46］運(yùn)用三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）沉淀法開(kāi)展了運(yùn)動(dòng)相關(guān)的血漿多肽組研究。在這項(xiàng)研究中，該團(tuán)隊(duì)首先將TCA 沉淀法與乙腈沉淀法、丙酮沉淀法和分子截?cái)喑瑸V法進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)TCA 法鑒定的LMWPs數(shù)目最多（近550個(gè)）。雖然TCA沉淀法展現(xiàn)出較好的鑒定結(jié)果，但是血漿樣本基質(zhì)的復(fù)雜性，例如大量脂質(zhì)小分子存在，依然干擾著LMWPs 的富集與鑒定。2019 年，Harney 等［47］發(fā)表 了SPEA（small?protein enrichment assay）方法學(xué)研究工作。該方法的卓越之處是在單針?lè)前邢蜻M(jìn)樣分析的前提下，共定性到100多種低分子質(zhì)量蛋白質(zhì)，有效地提高了小蛋白的鑒定率。雖然該方法結(jié)合分子排阻色譜法實(shí)現(xiàn)了小蛋白與載體蛋白的分離、高豐度蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的去除，但整個(gè)實(shí)驗(yàn)流程過(guò)于繁瑣，難以應(yīng)用于大規(guī)模臨床樣本制備中。Li等［43］提出了一種新的富集血漿LMWPs 的方法——順序沉淀脫脂法（sequential precipitation and delipidation，SPD），該方法的再現(xiàn)性及定量穩(wěn)定性顯著高于經(jīng)典的乙腈沉淀法與近期報(bào)道的TCA沉淀法（圖2b）。

Fig.2 Strategies for enrichment of plasma LMWPs［43，48］圖2 血漿中LMWPs的富集策略［43，48］

2.2 LMWPs鑒定策略進(jìn)展

除了富集方法上的進(jìn)步，質(zhì)譜鑒定策略也趨于多樣化，不斷更新?；|(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（matrix?assisted laser desorption/ionization time?of?flight mass spectrometry，MALDI?TOF?MS）是表征LMWPs 常用的質(zhì)譜技術(shù)，具有靈敏度高、檢測(cè)快速、通量高和成本低等優(yōu)勢(shì)，已廣泛應(yīng)用于癌癥［49?51］、慢性腎病［52］、感染性疾?。?3?54］、認(rèn)知障礙［55］，甚至是當(dāng)前全球流行的COVID?19［56］等疾病潛在生物標(biāo)志物的挖掘中。不過(guò)，該技術(shù)無(wú)法在較寬的質(zhì)量范圍內(nèi)實(shí)現(xiàn)多肽組可靠的定性定量分析。隨著高分辨、高靈敏度質(zhì)譜儀器與相應(yīng)軟件的不斷發(fā)展，多肽組學(xué)研究也變得越來(lái)越全面和系統(tǒng)。

LMWPs 鑒定策略的進(jìn)步主要包括：a.蛋白質(zhì)組學(xué)研究策略的進(jìn)步。在自下而上蛋白質(zhì)組學(xué)（bottom?up proteomics，BUP）技術(shù)中，質(zhì)譜采集速度的大幅提升顯著增加了蛋白質(zhì)組的鑒定深度，推動(dòng)了該技術(shù)的廣泛應(yīng)用；作為表征完整小蛋白的理想手段之一，自上而下蛋白質(zhì)組學(xué)（top?down proteomics，TDP）的技術(shù)策略是結(jié)合多種質(zhì)譜碎裂模式，直接使樣本中的LMWPs實(shí)現(xiàn)有效碎裂并最終完成氨基酸序列的完整解析［57］。相較于BUP，TDP 的技術(shù)優(yōu)勢(shì)是保留了LMWPs 的原始序列信息，但是由于完整LMWPs的分子質(zhì)量較大，該技術(shù)難以產(chǎn)生信息豐富的串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)，不過(guò)新一代Orbitrap儀器的開(kāi)發(fā)為T(mén)DP技術(shù)的快速發(fā)展奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。b.質(zhì)譜碎裂模式的多樣化應(yīng)用。例如Parker 等［46］利用具有高效分離能力的納流速超高效毛細(xì)管液相色譜與新一代超高分辨三合一質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，在EThcD 和HCD 兩種質(zhì)譜碎裂模式下分別對(duì)樣本進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，極大地提高了多肽的鑒定數(shù)目。c.質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集方法的進(jìn)步。近年來(lái)，隨著數(shù)據(jù)非依賴采集（data?independent acquisition，DIA）技術(shù)的蓬勃發(fā)展，LMWPs 的相關(guān)研究也得到了進(jìn)一步延伸。Lin 等［58］首次運(yùn)用DIA 技術(shù)開(kāi)展了腎透明細(xì)胞癌相關(guān)的血清LMWPs研究，在該臨床研究中，研究人員將DIA 技術(shù)與傳統(tǒng)的數(shù)據(jù)依賴采集（data?dependent acquisition，DDA）技術(shù)進(jìn)行了對(duì)比，雖然兩種技術(shù)在3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)中鑒定的多肽數(shù)目相差無(wú)幾，但DIA 技術(shù)定性結(jié)果的重現(xiàn)性與定量結(jié)果的穩(wěn)定性均顯著高于DDA，具有巨大的發(fā)展?jié)摿?。d.各類數(shù)據(jù)檢索軟件及算法的進(jìn)步。例如，具有de novo未知序列解序功能的PEAKS 軟件［59］、第一個(gè)TDP 質(zhì)譜鑒定算法ProSight［60］、高譜圖解析率的新一代開(kāi)放式搜索引擎Open?pFind［61］以及DIA 數(shù)據(jù)解析軟件Spectronaut［62］等。

2.3 LMWPs功能研究進(jìn)展

從葡萄糖調(diào)節(jié)（胰島素）到免疫識(shí)別（MHC分子），以各類生物活性肽形式存在的LMWPs，構(gòu)成了眾多生理穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)機(jī)制。在細(xì)胞和組織中，蛋白酶/肽酶密切參與了這些多肽的產(chǎn)生、降解和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，調(diào)控著LMWPs的組成、濃度及生物活性。探究體內(nèi)LMWPs，一方面可發(fā)現(xiàn)具有生物活性的新分子；另一方面可揭示內(nèi)源性多肽代謝的途徑以及體內(nèi)調(diào)節(jié)生物活性肽水平和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的新靶點(diǎn)。

Taguchi等［4］利用肽組學(xué)技術(shù)鑒定到幾千個(gè)多肽，通過(guò)化學(xué)合成多肽序列及功能研究，他們發(fā)現(xiàn)了3 種來(lái)自表皮分化標(biāo)記蛋白suprabasin 的新型生物活性肽。當(dāng)向小鼠腹腔注射SBSN_HUMAN［279?295］時(shí)，該多肽可有效地抑制食物/水的攝入，并誘導(dǎo)小鼠運(yùn)動(dòng)，而SBSN_HUMAN［225?237］和SBSN_HUMAN［243?259］通過(guò)激活血管細(xì)胞內(nèi)NF?κB信號(hào)，刺激炎癥前細(xì)胞因子的表達(dá)。該研究基于從頭測(cè)序的數(shù)據(jù)庫(kù)檢索方式生成多肽庫(kù)，結(jié)合功能研究，為發(fā)現(xiàn)血漿中未知生物活性肽提供了新的途徑。

研究蛋白酶?多肽的關(guān)系可以揭示蛋白酶調(diào)節(jié)生理功能的機(jī)制以及疾病潛在的治療靶點(diǎn)。二肽基肽酶IV（dipeptidyl peptidase IV，DPPIV 或CD26）參與了多種激素和趨化因子生物活性的調(diào)節(jié)，包括胰高血糖素樣肽1（glucagon?like peptide 1，GLP?1）和葡萄糖依賴性促胰島素多肽（glucose?dependent insulinotropic polypeptide，GIP）［63?64］。盡管完整的GLP?1?（7?36）?酰胺和GIP?（1?42）可以增強(qiáng)葡萄糖刺激的胰島素分泌，但是當(dāng)它們N端二肽在體外被DPPIV 剪切后即失去這種活性［65］。N 端截短的GLP?1 和GIP 可以在血液循環(huán)中被檢測(cè)到［64，66］，提示蛋白質(zhì)降解可能是調(diào)節(jié)它們生理活性的機(jī)制。因此，Marguet等［67］利用CD26基因靶向失活的小鼠探究了該酶在血糖控制中的作用，發(fā)現(xiàn)在葡萄糖的刺激下，CD26?/?小鼠血液中的胰島素與完整形式的GLP?1含量增加，同時(shí)CD26酶活性特異性抑制劑可以提高野生型小鼠的葡萄糖耐受性，表明CD26 很可能通過(guò)調(diào)節(jié)GLP?1 或其他底物的活性控制血糖，提示CD26可作為II型糖尿病的潛在治療靶點(diǎn)。

成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子21（fibroblast growth factor 21，F(xiàn)GF21）是一種參與調(diào)節(jié)葡萄糖穩(wěn)態(tài)、胰島素敏感性、脂質(zhì)代謝和體重的激素，是治療代謝紊亂的潛在靶點(diǎn)。但是FGF21 在血液循環(huán)中的快速水解降低了其潛在的生物活性。為探究FGF21的調(diào)控機(jī)制，Zhen等［68］利用質(zhì)譜技術(shù)系統(tǒng)地研究了人FGF21 的加工過(guò)程，證明了DPPIV 是負(fù)責(zé)其在Pro?2和Pro?4殘基后N端裂解的主要蛋白酶，以及成纖維細(xì)胞活化蛋白（fibroblast activation protein，F(xiàn)AP）是負(fù)責(zé)FGF21 在Pro?171 后C 端裂解的蛋白酶。FAP可使FGF21失活，該功能的發(fā)現(xiàn)不僅擴(kuò)展了FGF21 的信號(hào)通路，也在治療上為增強(qiáng)FGF21 生物活性提供了新的方法。與之類似，Sierra 等［69］發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞表達(dá)、分泌的完整趨化因子基質(zhì)衍生因子1α（stromal cell?derived factor 1α，SDF?1α）經(jīng)血清處理后以截短體的形式存在，同時(shí)，與其結(jié)構(gòu)對(duì)應(yīng)的生物功能隨之降低，揭示了蛋白質(zhì)降解是調(diào)節(jié)SDF?1α 生物功能的重要機(jī)制。該團(tuán)隊(duì)還進(jìn)一步從人血清中分離、純化和鑒定了這種特異性剪切SDF?1α C 端賴氨酸的蛋白酶，即羧肽酶N［70］。SDF?1α 是造血、淋巴細(xì)胞歸家、B 細(xì)胞生長(zhǎng)和血管生成的重要調(diào)節(jié)因子，該發(fā)現(xiàn)闡明了SDF?1α功能活性精細(xì)調(diào)控的重要分子機(jī)制。

2.4 疾病相關(guān)生物標(biāo)志物研究進(jìn)展

臨床上，癌癥等重大疾病的高發(fā)病率及高死亡率威脅著全球人口的健康，而當(dāng)前老齡化社會(huì)的發(fā)展也凸顯了各類慢性病對(duì)人們生活質(zhì)量的影響。因此，目前迫切需要發(fā)展各類疾病早期診斷的生物標(biāo)志物。Anderson［71］分析了2008年美國(guó)食品和藥物管理局批準(zhǔn)的所有蛋白質(zhì)類的實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目，結(jié)果顯示在這些實(shí)驗(yàn)中來(lái)自血漿的蛋白質(zhì)共有109個(gè)，其中第一類高豐度蛋白質(zhì)約占50%，由組織分泌到血漿中的蛋白質(zhì)約占25%，剩余則是一些異常分泌的蛋白質(zhì)或者激素、受體等。在回顧利用血漿蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)挖掘生物標(biāo)志物的研究時(shí)，Geyer 等［72］提出血漿蛋白質(zhì)組鑒定深度達(dá)1 500 個(gè)蛋白質(zhì)時(shí)才能覆蓋由組織分泌出來(lái)的蛋白質(zhì)，在此鑒定深度下，將蛋白質(zhì)按豐度高低進(jìn)行排序，依照前300個(gè)蛋白質(zhì)中約23%的蛋白質(zhì)為生物標(biāo)志物這一比例進(jìn)行推算，在后續(xù)1 200 個(gè)蛋白質(zhì)中應(yīng)該還存在許多生物標(biāo)志物。

一般認(rèn)為，源自組織的蛋白質(zhì)分子質(zhì)量較大，無(wú)法以被動(dòng)運(yùn)輸?shù)姆绞酵ㄟ^(guò)內(nèi)皮擴(kuò)散到循環(huán)系統(tǒng)中，而LMWPs以其分子質(zhì)量較小的優(yōu)勢(shì)，可作為細(xì)胞間信息交流的媒介。同時(shí)，LMWPs 富含更多可用于臨床診斷的信息，包括多肽數(shù)目、序列信息、蛋白質(zhì)歸屬、酶切位點(diǎn)信息等。因此，來(lái)源廣泛的LMWPs中尚有大量生物標(biāo)志物有待挖掘，具有巨大發(fā)展?jié)摿Α?/p>

在腫瘤微環(huán)境中，蛋白質(zhì)水解異常可促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)、細(xì)胞外和組織的重塑、炎癥、細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移［73］。因此，與癌癥生物學(xué)相關(guān)的蛋白酶催化而產(chǎn)生的蛋白質(zhì)降解物可以用作指示癌癥發(fā)生、發(fā)展及治療情況的生物標(biāo)志物。據(jù)Petricoin 等［74?75］報(bào)道，在卵巢癌與前列腺癌中，血漿/血清中多肽組合模式在癌癥及其早期診斷中展現(xiàn)的臨床特異性與靈敏度均顯著高于臨床上已有的生物標(biāo)志物——分別是癌癥抗原（cancer antigen 125，CA125）［74］與前列腺特異性抗原（prostate?specific antigen，PSA）［75］。隨后，Zhang等［76］利用交叉驗(yàn)證和獨(dú)立的多中心樣本鑒定出3 個(gè)LMWPs，這些潛在生物標(biāo)志物結(jié)合CA125 提高了早期卵巢癌檢測(cè)的靈敏度與特異性。此外，Bedin 等［51］探索了與結(jié)腸癌進(jìn)展相關(guān)的多肽組，通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)降解模式在結(jié)腸癌的不同階段各不相同。相較于健康對(duì)照，患者的蛋白酶活性更高，揭示了疾病進(jìn)展與LMWPs 變化的相關(guān)性。癌癥的早期檢測(cè)是治療惡性腫瘤的關(guān)鍵，因此，早期生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)將極大地幫助患者進(jìn)行疾病控制，顯著提高患者的生存率。

除了癌癥之外，基于質(zhì)譜技術(shù)探究LMWPs 已被廣泛應(yīng)用于各類疾病潛在生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)中，例如代謝綜合征［77?78］、精神類疾?。?9?80］和感染性疾病［81］等。不過(guò)，隨著研究的逐漸增多與深入，越來(lái)越多的結(jié)果表明，血漿中與不同疾病相關(guān)的差異多肽大部分源自高豐度蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)似乎沒(méi)有特異性，因?yàn)樗鼈冊(cè)诓煌愋偷募膊≈幸灿胁町惐磉_(dá)。這可能是因?yàn)楦哓S度蛋白質(zhì)確實(shí)與多種疾病之間存在顯著性關(guān)聯(lián)［82］。另外，在復(fù)雜生物體中，多種因素調(diào)控著多肽的產(chǎn)生，因此，與疾病生理病理直接相關(guān)的或許不是差異多肽，而是與多肽產(chǎn)生相關(guān)的蛋白酶或其調(diào)控因子，豐度發(fā)生改變的多肽是疾病間接相關(guān)標(biāo)志物；LMWPs 富集方法的局限性也是一個(gè)重要原因，血漿樣本中高豐度蛋白質(zhì)及其衍生的多肽片段的存在極大地掩蓋了低豐度LMWPs 的鑒定，現(xiàn)有的檢測(cè)深度降低了其他可能具有診斷作用的低豐度多肽的檢出率，這也再次強(qiáng)調(diào)了推動(dòng)方法學(xué)及研究策略進(jìn)展的必要性。不過(guò)，從多種研究結(jié)果來(lái)看，比起單一的生物標(biāo)志物，多肽組合或指紋圖譜有望滿足更高的臨床敏感性和特異性的要求［73?75］。因此，無(wú)論是什么原因?qū)е铝瞬町惗嚯牡漠a(chǎn)生，LMWPs 在生物標(biāo)志物的挖掘方面仍具有無(wú)限的潛力。

3 總結(jié)與展望

隨著樣本處理技術(shù)、質(zhì)譜技術(shù)以及計(jì)算機(jī)技術(shù)的高速發(fā)展，大量關(guān)于血漿LMWPs的質(zhì)譜數(shù)據(jù)已產(chǎn)生，如何從多肽數(shù)量、含量和序列組成等信息中尋找與臨床應(yīng)用、生理病理現(xiàn)象相關(guān)的分子，需要生物信息學(xué)等多種技術(shù)的支持。其次，LMWPs 的研究策略仍需進(jìn)一步優(yōu)化。事實(shí)上，受限于疾病的異質(zhì)性、研究方法的再現(xiàn)性以及研究隊(duì)列的有限性與延伸性，研究發(fā)現(xiàn)的差異多肽并沒(méi)有得到很好的隊(duì)列或功能驗(yàn)證，因此，研究策略的轉(zhuǎn)變與升級(jí)將是促進(jìn)LMWPs 研究進(jìn)展的重要環(huán)節(jié)。實(shí)踐證明，多中心、多樣本、多疾病的研究策略將有助于挖掘臨床有效的差異分子。最后，探究差異多肽的來(lái)源、功能作用將有助于疾病病理學(xué)的理解，并推動(dòng)其向臨床轉(zhuǎn)化的速度。未來(lái)，血漿LMWPs全面而深入的研究將為多種疾病的早期診斷、病理分型、預(yù)后判定和精準(zhǔn)治療帶來(lái)新的希望。