阿爾茨海默病體外診斷納米技術(shù)*

宋詩(shī)潔 朱 凌 王 琛** 楊延蓮**

（1）國(guó)家納米科學(xué)中心，北京 100190；2）中國(guó)科學(xué)院大學(xué)中丹學(xué)院，北京101400）

阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）是一種最常見的神經(jīng)退行性疾病。最新數(shù)據(jù)顯示，目前全球大約有包括AD 患者在內(nèi)的5 000 萬(wàn)癡呆患者，預(yù)計(jì)到2050 年，這一數(shù)字將達(dá)到1.52 億［1］。在20 世紀(jì)初，德國(guó)神經(jīng)學(xué)家Alois Alzheimer 首次發(fā)現(xiàn)一種疾病，其主要特征是認(rèn)知的進(jìn)行性和不可逆轉(zhuǎn)的衰退［2］，這種疾病后來被命名為AD。該疾病的主要病理特征表現(xiàn)為：a.β 淀粉樣蛋白（amyloid beta peptide，Aβ）過度沉積形成老年斑［3］；b.過度磷酸化的tau 蛋白聚集形成神經(jīng)原纖維纏結(jié)［4］。Aβ和tau蛋白的積累會(huì)導(dǎo)致大腦中與記憶相關(guān)的突觸和神經(jīng)元的大規(guī)模損傷，進(jìn)而造成嚴(yán)重的記憶喪失和認(rèn)知喪失。

AD 從發(fā)生到出現(xiàn)臨床癥狀耗時(shí)長(zhǎng)達(dá)15～25年［1］。美國(guó)國(guó)立衰老研究所（National Institute of Aging，NIA）和阿爾茨海默病協(xié)會(huì)（Alzheimer’s Association，AA）提出的診斷標(biāo)準(zhǔn)認(rèn)為，AD的發(fā)展是一個(gè)連續(xù)進(jìn)展的過程［5］。該診斷標(biāo)準(zhǔn)將AD的進(jìn)展分為3 個(gè)階段。a.臨床前期（preclinical）：蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊、聚集并開始在大腦中的積累，神經(jīng)元的活性有所降低但是并沒有出現(xiàn)臨床癥狀；b.輕度認(rèn)知障礙（mild cognitive impairment，MCI）：與記憶形成相關(guān)的海馬體功能受損并且出現(xiàn)腦萎縮和認(rèn)知損傷等癥狀；c.癡呆（dementia）：記憶力嚴(yán)重?fù)p傷并伴隨全身性損傷，患者日常生活不能自理［6］。

目前，AD 的臨床診斷主要通過認(rèn)知測(cè)試、影像學(xué)檢查以及腦脊液（cerebrospinal fluid，CSF）分析來實(shí)現(xiàn)［7］。認(rèn)知測(cè)試往往會(huì)受到主觀因素的影響，因而診斷準(zhǔn)確率不高。相比之下，影像學(xué)檢查是一種更直觀的檢查手段。AD診斷常用的醫(yī)學(xué)影像技術(shù)有用于海馬體成像的磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）以及評(píng)估Aβ在大腦皮層沉積的正電子發(fā)射型計(jì)算機(jī)斷層顯像（positron emission computed tomography，PET）技術(shù)［8?9］。然而，這些影像學(xué)診斷方法價(jià)格昂貴，檢測(cè)成本偏高。CSF分析則具有侵入性，給患者帶來極大的痛苦。因此迫切地需要一種具有非侵入性、操作簡(jiǎn)單的低成本診斷方法。

目前發(fā)展的以血液為基礎(chǔ)的體外診斷技術(shù)，在AD 早期診斷方面突顯優(yōu)勢(shì)。近年來，質(zhì)譜（mass spectrometry，MS）分析技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于AD 生物標(biāo)志物的篩選［10］和檢測(cè)［11］，成為以體液為基礎(chǔ)的AD早期診斷的有用工具［12］。為了獲得小型化、便攜式的AD體外診斷工具，研究者們積極發(fā)展基于納米技術(shù)的AD生物標(biāo)志物的檢測(cè)平臺(tái)。納米材料和納米技術(shù)的高表面活性、獨(dú)特的光電特性、生物相容性好、易于表面修飾、小型化、集成化等特點(diǎn)，使得研發(fā)具有更高靈敏度、選擇性和穩(wěn)定性的AD體外診斷技術(shù)成為可能。本文分別從生物標(biāo)志物的富集、信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)與增強(qiáng)、靈敏度的提高以及臨床價(jià)值等方面介紹納米技術(shù)在伏安/阻抗檢測(cè)、電導(dǎo)檢測(cè)、表面等離激元共振檢測(cè)、表面增強(qiáng)拉曼散射檢測(cè)以及電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)等AD傳感檢測(cè)平臺(tái)中的應(yīng)用（圖1）。

Fig.1 Schematic illustration of sensing platform for detection of AD biomarkers圖1 用于檢測(cè)AD生物標(biāo)記物的傳感平臺(tái)示意圖

1 生物標(biāo)志物

蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊、聚集以及積累是AD等神經(jīng)退行性病的主要病理特征［13?15］。盡管這些蛋白質(zhì)的序列、結(jié)構(gòu)、大小以及功能各異，但在患者的大腦中都經(jīng)歷了由單體聚集形成小的寡聚體，再到大的原纖維、纖維的過程［16］（圖2）。起初，研究者們認(rèn)為在大腦中大量沉積的蛋白質(zhì)具有神經(jīng)毒性，但有越來越多的證據(jù)表明，由蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊產(chǎn)生的可溶性寡聚體才是造成神經(jīng)毒性的關(guān)鍵因素［17?19］。錯(cuò)誤折疊的聚集體小到二聚體，大到由數(shù)百個(gè)單體組成的原纖維［20?21］，這些異常變化的蛋白質(zhì)聚集體逐漸被作為生物標(biāo)志物應(yīng)用于AD的早期診斷。

Fig.2 Amyloidogenic proteins aggregate via multiple pathways into different assembly structures［16］圖2 淀粉樣蛋白通過多種途徑聚集成不同的組裝結(jié)構(gòu)［16］

Aβ 是一類最重要的早期診斷生物標(biāo)志物。在正常人體內(nèi)，淀粉樣蛋白前體（amyloid precursor protein，APP）被α 和γ 蛋白酶切割，產(chǎn)生不具有神經(jīng)毒性的多肽片段。在AD 患者體內(nèi)，APP 在β和γ 蛋白酶的作用下分解成具有39～43 個(gè)氨基酸的多肽，其中Aβ42和Aβ40這兩個(gè)片段與AD疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［2，22］。大量Aβ聚集形成的寡聚體會(huì)產(chǎn)生神經(jīng)毒性，導(dǎo)致大腦內(nèi)的神經(jīng)元和突觸受損，從而影響患者的記憶和認(rèn)知［23］。最近，有觀點(diǎn)認(rèn)為在眾多Aβ聚集體中，Aβ二聚體是最主要的毒性蛋白形式［24］，這可能開啟AD 研究的新階段。近年來，納米技術(shù)的發(fā)展使得AD 患者CSF 中Aβ的微量變化能夠被獲取［25］，因此逐漸發(fā)展了眾多基于CSF 中Aβ 檢測(cè)的早期診斷技術(shù)。CSF 分析成本高，取樣困難，給患者帶來極大的痛苦。2018年，Nakamura等［26］提出血漿Aβ與CSF中Aβ濃度存在相關(guān)性，并且檢測(cè)結(jié)果與PET 的診斷結(jié)果吻合度達(dá)到90%，這意味著血液檢測(cè)有望成為替代CSF分析的新方法。隨后，逐漸發(fā)展了以血液標(biāo)志物為基礎(chǔ)的檢測(cè)技術(shù)。

tau 蛋白是一種結(jié)合在微管上的蛋白質(zhì)，其正常功能是維持微管的穩(wěn)定性，降低微管蛋白分子的解離。從微管上脫落的tau 蛋白在腦部聚集，形成的神經(jīng)纖維纏結(jié)被認(rèn)為是AD 病理特征之一［27］。有研究者還發(fā)現(xiàn)，AD 患者腦部tau 蛋白會(huì)出現(xiàn)過度磷酸化的現(xiàn)象［28?29］，過度磷酸化會(huì)導(dǎo)致tau 正常生物活性的喪失，引起微管解體和軸突運(yùn)輸功能的破壞［30］。另外，Aβ 能夠加速tau 蛋白的過度磷酸化［31］以及配對(duì)螺旋樣纖維（paired helical fibers，PHF）［32］的形成，并且能夠促進(jìn)tau 蛋白的聚集和擴(kuò)散［33?34］。

tau 蛋白中有85 個(gè)潛在的磷酸化位點(diǎn)，在AD大腦內(nèi)檢測(cè)出了約45個(gè)特異磷酸化位點(diǎn)［35］，其中CSF 中p?tau181（phosphorylated tau181）［36］以及p?tau217（phosphorylated tau217）［37］被認(rèn)為與AD病理相關(guān)。近期，研究者比較了p?tau217 與p?tau181 作為AD 生物標(biāo)志物的有效性，PET 結(jié)果顯示p?tau217 能夠更準(zhǔn)確地區(qū)分AD 和其他神經(jīng)退行性疾?。?8］。越來越多的結(jié)果證明［39?41］，血漿中磷酸化的tau，尤其是p?tau217，與AD疾病進(jìn)展密切相關(guān)。

目前已報(bào)道了許多新型的AD早期檢測(cè)生物標(biāo)志物［42］，除了有構(gòu)成神經(jīng)元細(xì)胞骨架的神經(jīng)絲蛋白L（neurofilament light，NFL）［43］、與tau mRNA代謝相關(guān)的交互反應(yīng)DNA 結(jié)合蛋白43（transactive response DNA binding protein 43，TDP?43）［44］、影響Aβ 生成的去整合素金屬蛋白酶10（a disintegrin and metalloprotease 10，ADAM10）［45］，還有與炎癥和神經(jīng)元損傷相關(guān)的髓系細(xì)胞觸發(fā)受體2（triggering receptor expressed on myeloid cells 2，TREM2）［46］、人幾丁質(zhì)酶3 樣蛋白?1（chitinase 3?like 1 protein CHI3L1）［47］以及視錐蛋白樣蛋白1（visinin?like protein 1，VLP?1）［48］等。國(guó)際工作組（International Working Group，IWG）僅將Aβ和tau蛋白納入診斷標(biāo)準(zhǔn)之中，目前關(guān)于AD 早期診斷的研究也主要集中于Aβ、tau 蛋白以及與之相關(guān)的蛋白質(zhì)。最新的AD診斷標(biāo)準(zhǔn)［1］認(rèn)為，只有臨床表型陽(yáng)性以及Aβ和tau蛋白生物標(biāo)志物同時(shí)表現(xiàn)為陽(yáng)性才可以確診為AD，因此未來多靶點(diǎn)檢測(cè)的方法將成為AD 早期檢測(cè)的重要手段。由于生物標(biāo)志物陽(yáng)性患者的異質(zhì)性特點(diǎn)，目前依然無(wú)法給出一個(gè)確定的陽(yáng)性判斷值，這進(jìn)一步限制了生物標(biāo)志物檢測(cè)方法在臨床上的應(yīng)用。

2 納米技術(shù)在AD體外診斷中的應(yīng)用

以納米技術(shù)為基礎(chǔ)的AD體外診斷技術(shù)是目前較為先進(jìn)的檢測(cè)技術(shù)。納米技術(shù)不僅能夠?qū)崿F(xiàn)低濃度生物標(biāo)志物的富集，還能夠?qū)⑸锓磻?yīng)轉(zhuǎn)化為光電信號(hào)并且將這些信號(hào)進(jìn)一步放大，因此利用納米材料或者納米技術(shù)構(gòu)建的納米生物傳感器平臺(tái)能夠在常規(guī)檢測(cè)技術(shù)無(wú)法檢測(cè)的濃度范圍內(nèi)定量分析CSF和血液中AD相關(guān)的生物標(biāo)志物。

盡早地識(shí)別AD有利于后續(xù)的治療，因此早期診斷成為AD研究領(lǐng)域一個(gè)備受關(guān)注的問題。目前AD的早期診斷迫切需要靈敏、精準(zhǔn)、便捷、經(jīng)濟(jì)的檢測(cè)技術(shù)，AD 的納米體外診斷技術(shù)在早期診斷、預(yù)后判斷以及療效評(píng)估等方面展現(xiàn)了極大臨床應(yīng)用潛力。

2.1 生物標(biāo)志物的富集

通常情況下，目標(biāo)蛋白在體液中的含量極低。例如，在CSF和血液中，Aβ和tau蛋白的濃度低至皮摩爾級(jí)別［49］。另外，復(fù)雜的體液環(huán)境為目標(biāo)蛋白的檢測(cè)增加了難度。因此，許多檢測(cè)技術(shù)需要在檢測(cè)目標(biāo)蛋白之前對(duì)其進(jìn)行預(yù)富集和分離。

免疫捕獲是一種依靠抗原?抗體相互作用實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)、多肽等生物分子捕獲和濃縮的富集技術(shù)［50］。免疫磁珠（immunomagnetic beads，IMB）是目前最常用的免疫捕獲新型生物納米材料。IMB實(shí)質(zhì)上是一種表面覆蓋高分子或者化學(xué)小分子的磁性納米顆粒，表面修飾的氨基、羧基、巰基等能夠與抗體偶聯(lián)，磁性納米顆粒的超順磁性使其能夠在外加磁場(chǎng)的作用下定向移動(dòng)。目前，免疫磁珠已經(jīng)可以用于細(xì)胞［51］、細(xì)胞外囊泡［52］、蛋白質(zhì)［53］以及基因［54］的富集、分離和提純。

目前報(bào)道的許多AD相關(guān)生物標(biāo)志物的檢測(cè)技術(shù)都使用IMB 對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行預(yù)富集。ADAM10是APP 的α 分泌酶，能夠通過裂解APP 來阻止Aβ的生成。研究表明，ADAM10的活性降低與AD病理相關(guān)［45］。在此基礎(chǔ)上，F(xiàn)aria 等［55］研制了一種用于CSF 和血漿中ADAM10 檢測(cè)的微流控平臺(tái)（圖3）。研究者首先使用羧基活化的免疫磁珠偶聯(lián)抗體，捕獲血漿樣本中的ADAM10，然后使用磁分離的方法將富含ADAM10 的免疫磁珠從血漿中分離出來，用于后續(xù)的檢測(cè)工作。與傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme?linked immune sorbent assays，ELISA）相比，使用該檢測(cè)方法能夠獲得更低的檢出限（limit of detection，LOD）。

Fig.3 Immunomagnetic capture of ADAM10 in a plasma sample and the detection using disposable microfluidic platform［55］圖3 血漿樣品中ADAM10的免疫磁性捕獲及一次性微流控平臺(tái)［55］

Tao 等［56］在使用滾環(huán)擴(kuò)增電化學(xué)發(fā)光分析法檢測(cè)血漿中的Aβ40 和Aβ42 時(shí)，也使用了IMB 對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行預(yù)富集。在進(jìn)行電化學(xué)分析之前，使用抗體功能化的IMB 捕獲血漿樣本中的Aβ。該方法獲得的Aβ40 和Aβ42 的LOD 分別是1.99 ng/L 和3.14 ng/L。此外，免疫捕獲還可以應(yīng)用于目標(biāo)蛋白的熒光檢測(cè)。Li等［57］使用氨基功能化的磁性納米顆粒和磁性納米棒偶聯(lián)不同抗體，分別捕獲CSF中的Aβ42 以及tau 蛋白。在進(jìn)行熒光分子標(biāo)記后，用全內(nèi)反射熒光顯微鏡的電子倍增電荷耦合器件（electron?multiplying charge?coupled device，EMCCD）成像系統(tǒng)采集熒光信號(hào)，對(duì)CSF 中的Aβ42和tau蛋白進(jìn)行定量分析。IMB的使用實(shí)現(xiàn)了對(duì)Aβ42和tau蛋白的預(yù)富集和純化，減少了CSF中其他成分對(duì)檢測(cè)信號(hào)的干擾，這大大提高了檢測(cè)的靈敏性和準(zhǔn)確性。

2.2 納米生物傳感器的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與增強(qiáng)

生物傳感器是能夠?qū)⑸锓磻?yīng)轉(zhuǎn)化為可測(cè)量信號(hào)的裝置，因其具有分析速度快、成本低、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)勢(shì)，成為生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域十分有前景的疾病診斷輔助工具［58］。納米技術(shù)的發(fā)展促進(jìn)了生物傳感器的構(gòu)成和性能提升［59］。納米材料和納米技術(shù)不僅可以促進(jìn)生物信號(hào)轉(zhuǎn)換為可以量化的光電信號(hào)，而且可以憑借自身優(yōu)異的理化性質(zhì)來提高生物傳感器的靈敏度，進(jìn)而降低檢測(cè)極限。納米技術(shù)與生物傳感器的融合為AD生物標(biāo)志物的檢測(cè)提供了更靈敏、更精準(zhǔn)、更穩(wěn)定的檢測(cè)平臺(tái)。

2.2.1 電信號(hào)調(diào)控

電化學(xué)傳感器是生物傳感器領(lǐng)域的一個(gè)重要分支。電極與導(dǎo)電溶液接觸時(shí)會(huì)發(fā)生生物化學(xué)反應(yīng)，電化學(xué)工作站通過監(jiān)測(cè)該過程的電流、阻抗和電導(dǎo)率的變化對(duì)分析物進(jìn)行定量檢測(cè)［2］。

循環(huán)伏安法（cyclic voltammetry，CV）是一種最常用的電化學(xué)分析方法。該方法主要是通過監(jiān)測(cè)溶液中發(fā)生的氧化還原反應(yīng)實(shí)現(xiàn)對(duì)分析物的檢測(cè)，在AD 早期生物標(biāo)志物的檢測(cè)中也有實(shí)用價(jià)值。例如，Costa?García等［60］在金納米顆粒（gold nanoparticles，AuNPs）修飾的絲網(wǎng)印刷碳電極上通過鏈霉親和素?生物素偶聯(lián)Aβ42，隨后加入Aβ 42和Aβ42抗體的混合溶液。由于抗體的結(jié)合位點(diǎn)有限，溶液中的Aβ42和電極上的Aβ42參與競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)。當(dāng)反應(yīng)達(dá)到平衡后，加入堿性磷酸酶耦合IgG抗體（Anti?IgG?AP）以及3?吲哚基磷酸鹽與銀離子的混合物（3?IP/Ag+）。在堿性磷酸酶催化作用下，溶液中發(fā)生酶促銀沉積反應(yīng)，Ag+被還原成Ag0。此時(shí)進(jìn)行CV 掃描，溶液中的氧化還原反應(yīng)會(huì)引起峰值電流的變化，峰值電流的強(qiáng)度即可反映溶液中Aβ42 的濃度。研究結(jié)果表明，該免疫傳感器在為0.5～500 μg/L 范圍內(nèi)可以對(duì)Aβ42 進(jìn)行有效檢測(cè)，LOD為0.1 μg/L。

電化學(xué)阻抗譜（electrochemical impedance spectroscopy，EIS）是另一個(gè)應(yīng)用比較廣泛的電化學(xué)分析方法。Qin 等［61］制備了一種基于姜黃素的非酶電化學(xué)傳感器檢測(cè)Aβ 寡聚體（Aβ oligomer，AβO）。該工作利用姜黃素?鎳配合物修飾電極，鎳的存在增加了姜黃素的導(dǎo)電性。AβO 能夠阻礙電極表面的電子傳遞，導(dǎo)致電子轉(zhuǎn)移電阻明顯增加。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在0.001～5 nmol/L的范圍內(nèi)，姜黃素傳感器阻抗響應(yīng)與AβO 的濃度呈現(xiàn)良好的線性對(duì)應(yīng)關(guān)系。

方波伏安法（square?wave voltammetry，SWV）是一種快速、靈敏的電化學(xué)定量分析方法。SWV 可以用于AD 生物標(biāo)志物tau441 的靈敏檢測(cè)。Guo 等［62］使用化學(xué)剝離的單層還原氧化石墨烯（reduced graphene oxide，rGO）修飾的電極進(jìn)行tau 蛋白抗體功能化，隨后用于檢測(cè)AD 患者血清樣本中的tau441。tau441與電極表面抗體結(jié)合從而阻斷了電子的傳遞，因此隨著tau 蛋白濃度增加，SWV 峰值電流逐漸降低。該電化學(xué)傳感器在0.08～80 pmol/L的濃度范圍內(nèi)與tau441的濃度有良好的線性關(guān)系，LOD為75 fmol/L。

差分脈沖伏安法（differential pulse voltammetry，DPV）在物質(zhì)痕量檢測(cè)分析中有著廣泛的應(yīng)用。因其能夠降低背景的電流信號(hào)，表現(xiàn)出更高的靈敏度和更低的檢出限。Guo 等［63］研發(fā)了一種基于tau 蛋白抗體功能化金電極的電化學(xué)傳感器，用于檢測(cè)AD 患者血清樣本中的tau381。為了實(shí)現(xiàn)信號(hào)的進(jìn)一步放大，研究者還制備了一種基于AuNPs的生物偶聯(lián)體，從而形成抗體?蛋白質(zhì)?生物偶聯(lián)體的三明治結(jié)構(gòu)。AuNPs 增加了電極表面的電子轉(zhuǎn)移效率，從而提高了DPV 電流峰值，進(jìn)而起到信號(hào)放大的作用。該傳感器在0.5～100 μmol/L 范圍內(nèi)能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)tau381 的靈敏檢測(cè)，LOD為0.42 pmol/L。

2.2.2 光信號(hào)轉(zhuǎn)化

光學(xué)生物傳感器能夠?qū)⑸锓磻?yīng)轉(zhuǎn)化為吸收、反射、散射和熒光等可量化的光學(xué)信號(hào)［2］。目前已經(jīng)發(fā)展了基于不同光學(xué)傳感技術(shù)的生物傳感器，用于檢測(cè)蛋白質(zhì)、核酸和膽固醇等生物分子。表面等離激元共振（surface plasmon resonance，SPR）是一種重要的光學(xué)檢測(cè)技術(shù)，其工作原理是基于折射率（refractive index，RI）的變化來實(shí)現(xiàn)生物分子間相互作用的分析［64］。當(dāng)生物分子與SPR 傳感芯片有結(jié)合時(shí)，芯片表面的質(zhì)量增加引起RI的變化，進(jìn)而SPR 角也隨之發(fā)生變化。因此SPR 角的動(dòng)態(tài)變化即可反映生物分子間相互作用的特異性信號(hào)。SPR具有高通量、高靈敏度、無(wú)標(biāo)記和實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)等優(yōu)點(diǎn)［65］，因此其在生物傳感檢測(cè)方面具有廣泛的應(yīng)用。金納米薄膜和銀納米薄膜是制備SPR傳感芯片的常用材料，它們?cè)诮t外和可見光范圍內(nèi)能夠產(chǎn)生強(qiáng)烈的等離激元共振［66］。由于金納米薄膜具有很好的化學(xué)穩(wěn)定性和生物相容性，因此在SPR傳感器中更為常見。

借助金納米薄膜基底的SPR 傳感芯片，Homola課題組［67］實(shí)現(xiàn)了對(duì)CSF中tau?Aβ復(fù)合物的靈敏檢測(cè)。首先，端基為COOH?和OH?的硫醇分子在金基底上形成混合自組裝單分子膜（self?assembled monolayer，SAM），然后通過氨基偶聯(lián)的方法將tau蛋白抗體修飾在SAM上制備SPR傳感芯片。為了放大傳感器的檢測(cè)信號(hào)，研究者引入了AuNPs，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，AuNPs能夠顯著增加不同濃度tau?Aβ 樣本的信號(hào)差異。該傳感器對(duì)CSF 中tau?Aβ復(fù)合物檢測(cè)的LOD為0.1 pmol/L。

為了提高受體與標(biāo)志物的親和力，進(jìn)而提高傳感器的特異性，近年來逐漸發(fā)展了抗體的替代品。例如，Yang課題組［68］使用類肽納米片層修飾的表面等離激元共振成像（SPR imaging，SPRi）傳感器實(shí)現(xiàn)對(duì)血清和血漿中Aβ的高靈敏高特異性檢測(cè)。具有識(shí)別環(huán)的類肽分子在外力作用下形成緊密堆積的納米片層（圖4），該納米片層能夠模擬抗體的功能，納米片層起到支撐作用，表面的識(shí)別環(huán)能夠與Aβ 發(fā)生特異性結(jié)合，從而產(chǎn)生SPR 響應(yīng)信號(hào)。與抗體識(shí)別相比，類肽納米片層具有更高的穩(wěn)定性和更低的成本，并且在區(qū)分對(duì)照組和AD組血液樣本時(shí)，二者的信號(hào)差異更為顯著。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，該傳感器在區(qū)分對(duì)照組、MCI與AD組樣本時(shí)具有良好的效果，LOD低至皮摩爾級(jí)別。

Fig.4 Schematic illustration of the detection of Aβ42 in the serum or plasma by the loop-displaying peptoid nanosheets in combination with surface plasmon resonance imaging［68］圖4 環(huán)狀類肽納米片結(jié)合表面等離子體共振成像（SPRi）檢測(cè)血清或血漿中Aβ42的示意圖［68］

納米技術(shù)的發(fā)展為傳感器性能優(yōu)化奠定了基礎(chǔ)。近年來，在SPR技術(shù)的基礎(chǔ)之上，逐漸發(fā)展了另一種具有更高靈敏度的檢測(cè)技術(shù)，局域表面等離激元共振（localized surface plasmon resonance，LSPR）技術(shù)［69］。與SPR類似的，該方法主要是通過檢測(cè)金屬納米結(jié)構(gòu)上RI的變化引起共振波的偏移來檢測(cè)生物分子［70］。與SPR不同，LSPR傳感芯片表面不是金屬薄層，而是均勻分布的金屬納米結(jié)構(gòu)，例如金納米球［71］、金納米星［72］和金納米棒［73］等納米結(jié)構(gòu)。由于金屬納米結(jié)構(gòu)和周圍介質(zhì)之間界面處的RI變化會(huì)引起共振波長(zhǎng)更大的偏移［70］，因此LSPR具有更高的靈敏度。

以均勻分散的AuNPs單層為基底，Ly等［74］制備了一種LSPR 傳感平臺(tái)，用來檢測(cè)AD 生物標(biāo)志物蛋白Aβ42。在鏈霉親和素的幫助下，生物素功能化的Aβ42 單克隆抗體被固定在AuNPs 的Langmuir?Blodgett（LB）膜上，用于捕獲Aβ42。該傳感器能夠檢測(cè)到CSF 中微量的Aβ42，低至1 μg/L。

除了使用單一形狀的AuNPs，根據(jù)納米顆粒的形狀不同，LSPR 還可以對(duì)不同的生物標(biāo)志物進(jìn)行識(shí)別和檢測(cè)。在此基礎(chǔ)上，Kim 等［75］制備了一種形狀編碼的LSPR生物傳感器，用于檢測(cè)模擬血漿中的Aβ40、Aβ42以及tau蛋白。3種不同形狀的AuNPs 分別對(duì)Aβ40、Aβ42 以及tau 蛋白的抗體功能化，用于捕獲溶液中相應(yīng)的生物標(biāo)志物。隨后，研究者以不同的轉(zhuǎn)速對(duì)混合溶液進(jìn)行離心，將分離產(chǎn)物分別進(jìn)行LSPR 分析。該傳感器對(duì)3 種生物標(biāo)志物檢測(cè)的LOD都達(dá)到了飛摩爾級(jí)別。

與LSPR 類似，拉曼光譜也是一種可以用于AD生物標(biāo)志物檢測(cè)的光學(xué)傳感技術(shù)。拉曼散射效應(yīng)本身的信號(hào)很弱，僅占整個(gè)散射光的千分之幾，因此很難將其直接應(yīng)用。有研究者發(fā)現(xiàn)，粗糙表面能夠?qū)⑵浔砻娣肿拥睦庾V信號(hào)提高102～106倍［76］，這種效應(yīng)被稱為表面增強(qiáng)拉曼（surface?enhanced Raman spectroscopy，SERS）效 應(yīng)。SERS 包含分子的拉曼散射信息，通常稱之為“拉曼指紋”［77］?！袄讣y”可以用來識(shí)別目標(biāo)蛋白，拉曼信號(hào)的強(qiáng)度則可以實(shí)現(xiàn)目標(biāo)蛋白的定量分析。

SERS 是一種很有前途的生物分析傳感平臺(tái)，研究者已經(jīng)將SERS 應(yīng)用于AD 早期生物標(biāo)志物的檢測(cè)。為了進(jìn)一步提高SERS的檢測(cè)性能，通過利用特殊納米結(jié)構(gòu)來增加表面粗糙度，進(jìn)而提高SERS 信號(hào)增強(qiáng)因子是一種有效途徑。Kim 等［78］使用一種銀納米間隙（silver nanogaps，AgNGs）作為納米探針，通過SERS 來檢測(cè)血液中的Aβ40和Aβ42。在進(jìn)行AD 生物標(biāo)志物檢測(cè)時(shí)，首先構(gòu)建免疫磁珠?目標(biāo)蛋白?AgNGs的三明治結(jié)構(gòu)，利用免疫磁珠將其從血清樣本中分離出來，而后進(jìn)行SERS分析。研究結(jié)果表明，AgNGs增加了原本銀納米顆粒（silver nanoparticle，AgNPs）的表面粗糙度，使SERS 信號(hào)強(qiáng)度增強(qiáng)高達(dá)7 個(gè)數(shù)量級(jí)，該傳感器的LOD可以低至0.25 μg/L。

僅靠肉眼觀察來區(qū)分正常人、AD患者以及其他癡呆患者的SERS譜圖是不可靠的。近幾年，人工智能的迅速發(fā)展為提高AD早期診斷的準(zhǔn)確性帶來了新的希望。例如，Lednev 等［79］報(bào)道了一種SERS 與多元統(tǒng)計(jì)分析相結(jié)合的方法，借助人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（artificial neural network，ANN）對(duì)AD 患者血清樣本進(jìn)行SERS譜的分析和分類，診斷靈敏度可以達(dá)到98%。

此外，電化學(xué)發(fā)光技術(shù)也可以實(shí)現(xiàn)AD生物標(biāo)志物的靈敏檢測(cè)。電化學(xué)發(fā)光（electrochemiluminescence，ECL）是在氧化還原反應(yīng)中，發(fā)光基團(tuán)通過電化學(xué)誘導(dǎo)產(chǎn)生光的過程［80］。ECL 傳感器可以通過數(shù)值變化來反映電極上的電荷轉(zhuǎn)移，從而定量分析待檢測(cè)物的濃度。釕（Ru）配合物是一種重要的電致發(fā)光材料，在光電傳感器中有廣泛的應(yīng)用。Da 等［81］將其應(yīng)用于Aβ42 聚集體的免疫檢測(cè)，開發(fā)了一種無(wú)標(biāo)簽的紙基生物傳感器。在該傳感器中，［Ru（phen）2dppz］2+與Aβ42 聚集體鍵合后與溶液中的三丙胺發(fā)生氧化還原反應(yīng)，導(dǎo)致電化學(xué)發(fā)光，最終的光信號(hào)由紙基雙電極電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)采集輸出，該方法可檢測(cè)到100 pmol/L Aβ42。石墨氮化碳納米片（graphitic carbon nitride nanosheet，g?C3N4NSs）具有良好的ECL 性質(zhì)，并且具有比表面積大、導(dǎo)電性好和生物相容性高的優(yōu)點(diǎn)，在ECL 傳感器領(lǐng)域有良好的應(yīng)用前景［82］。Deng 等［83］以AgNPs 改性的g?C3N4NSs 和Ru（bpy）32+摻雜的TiO2納米顆粒為發(fā)光元件（圖5），制備了一種用于檢測(cè)Aβ42的雙波長(zhǎng)比率電化學(xué)發(fā)光傳感器。兩組發(fā)光元件分別在不同波長(zhǎng)表現(xiàn)出穩(wěn)定的ECL 信號(hào)，使用兩個(gè)信號(hào)的比率作為檢測(cè)信號(hào)有利于排除外部的干擾，進(jìn)而提高檢測(cè)的可靠性。該傳感器檢測(cè)Aβ42 的線性范圍為1×10-5至200 μg/L，LOD為2.6 ng/L。

2.3 檢測(cè)靈敏度的提高

碳納米材料，例如石墨烯（graphene）、碳納米管（carbon nanotubes，CNTs）、碳納米纖維（carbon nanofibers，CNFs）等，具有良好的光學(xué)、電學(xué)以及力學(xué)性能，在能源、檢測(cè)和藥物遞送等領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價(jià)值［84］。其中，石墨烯是一種極具影響力的碳材料，它是由單層碳原子排列成六角形或蜂窩狀晶格的二維碳納米材料，具有比表面積大、生物相容性好以及易于表面功能化等優(yōu)點(diǎn)［85］，對(duì)于提高檢測(cè)靈敏度非常有利，因此在納米生物傳感器領(lǐng)域有很大的實(shí)用價(jià)值。

借助石墨烯的優(yōu)良性質(zhì)，Hwang 等［86］制備了一種氧化石墨烯場(chǎng)效應(yīng)晶體管（graphene oxide field effect transistor，gFET）生物傳感器，對(duì)血漿中的Aβ42和tau蛋白進(jìn)行超靈敏和多重檢測(cè)。還原氧化石墨烯（reduced graphene，rGO）為抗體的固定提供了大量結(jié)合位點(diǎn)，這大大增強(qiáng)了傳感器捕獲Aβ42和t?tau（總tau蛋白）的能力，進(jìn)而提高了檢測(cè)的靈敏度。Awan 等［87］報(bào)道了另外一種用于檢測(cè)AD 的重要生物標(biāo)志物凝聚素（clusterin）的gFET。該研究使用1?戊二酸丁二酰亞胺酯作為連接分子，將凝聚素抗體連接在退火石墨烯表面。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該傳感器的最低檢出限為4 fmol/L。

Fig.5 Schematic illustration of preparation of dual-wavelength ratiometric electrochemiluminescence sensor［83］圖5 雙波長(zhǎng)比率電化學(xué)發(fā)光傳感器制備示意圖［83］

CNTs 是由石墨烯卷曲形成的管狀結(jié)構(gòu)，可分為單壁碳納米管（single?walled carbon nanotubes，SWCNTs）和多壁碳納米管（multi?walled carbon nanotubes，MWCNTs）。碳納米管擁有與石墨烯類似的性質(zhì)，已經(jīng)被用于AD 早期生物標(biāo)志物的檢測(cè)。例如，Park 等［88］研制了一種基于SWCNTs 薄膜的生物傳感器，用于同時(shí)檢測(cè)人體血漿中t?tau、p?tau181、Aβ42 和Aβ40 4 種AD 核心生物標(biāo)志物。首先使用LB 膜方法制備了單層碳納米管薄膜，通過反復(fù)施加外力讓所獲得的單層碳納米管緊密堆積，單向排列（圖6）。緊密堆積的SWCNTs 結(jié)構(gòu)為抗體的偶聯(lián)提供了更多有效活性位點(diǎn)，與隨機(jī)排列的碳納米管相比，可以將傳感器的檢測(cè)靈敏度提高1.88倍。

MWCNTs 也可以應(yīng)用于AD 生物標(biāo)志物的檢測(cè)。Yu 等［89］設(shè)計(jì)了一種用夾心法檢測(cè)Aβ 分子的高靈敏度的生物傳感器。該方法是以MWCNTs 和AuNPs 為基礎(chǔ)，依靠明膠蛋白來捕獲AD 大鼠CSF和腦組織中可溶性Aβ40 和Aβ42。一方面，MWCNTs 能夠加速電子的轉(zhuǎn)移；另一方面，巨大的比表面積為明膠蛋白提供更多的附著位點(diǎn)，這大大提高了檢測(cè)靈敏度。數(shù)據(jù)結(jié)果顯示，使用碳納米管能夠?qū)㈦娦盘?hào)響應(yīng)至少提高1倍［90］。

2.4 AD納米檢測(cè)技術(shù)的臨床價(jià)值

AD 生物標(biāo)志物檢測(cè)平臺(tái)的構(gòu)建以及性能優(yōu)化最終是為了滿足臨床應(yīng)用的需求。臨床價(jià)值的體現(xiàn)是眾多傳感檢測(cè)平臺(tái)面臨的巨大挑戰(zhàn)。近年來，以納米技術(shù)為基礎(chǔ)的檢測(cè)平臺(tái)，在AD 的預(yù)后判斷、療效評(píng)估以及早期診斷等方面都顯現(xiàn)了實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

2.4.1 疾病的預(yù)后判斷和療效評(píng)估

以納米科學(xué)為基礎(chǔ)的體外診斷技術(shù)具有操作簡(jiǎn)單和便于攜帶的優(yōu)點(diǎn)，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)生物標(biāo)志物的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。例如，Singh 等［91］開發(fā)了一種用于同時(shí)檢測(cè)Aβ40和Aβ42的生物傳感芯片。該芯片連接了便攜式讀取器并且將其與移動(dòng)手機(jī)應(yīng)用程序相結(jié)合，用于數(shù)據(jù)的分析和采集。盡管該設(shè)備并沒有應(yīng)用于真實(shí)樣本的分析，但是提供了一種可視化AD生物標(biāo)志物的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)方法，可能用于藥物療效的評(píng)估。

Fig.6 Schematic illustration of a densely aligned CNT sensor array for AD biomarkers［88］圖6 AD生物標(biāo)志物密集排列的CNT傳感器陣列示意圖［88］

盡管AD 治療藥物的研發(fā)工作［92?95］從未停止，但目前依然沒有能夠治療AD的特效藥物。目前已有AD治療藥物的有效成分主要都是乙酰膽堿酯酶抑制劑（acetylcholinesterase inhibitors，AChEIs）［96］，因此，檢測(cè)藥物對(duì)乙酰膽堿酯酶（acetylcholinesterase，AChE）的抑制效果在藥物的研發(fā)過程中至關(guān)重要。rGO的能帶結(jié)構(gòu)中，其布里淵區(qū)邊界的高對(duì)稱點(diǎn)上存在具有線性色散關(guān)系的上下錐形結(jié)構(gòu)，這些錐形結(jié)構(gòu)的頂點(diǎn)稱之為狄拉克點(diǎn)。狄拉克點(diǎn)的位移變化可以用來評(píng)估rGO 表面發(fā)生的化學(xué)反應(yīng)。在此基礎(chǔ)上，Hwang等［97］制備了一種AChE 功能化的gFET。AChE 與乙酰膽堿（acetycholine，ACh）之間的酶催化反應(yīng)會(huì)引起狄拉克點(diǎn)位移，從而可以推斷溶液中ACh 的濃度。作者使用該設(shè)備驗(yàn)證了兩種常見的AChE 抑制劑，多奈哌齊和卡巴拉汀對(duì)AChE 有明顯的抑制效果。該工作提供了一種乙酰膽堿的檢測(cè)方法，并在藥療效評(píng)估方面具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

2.4.2 疾病的早期診斷

到目前為止，由于AD 的致病機(jī)理尚不清晰，臨床上針對(duì)AD 的治療方法只能延緩而不能阻止AD的發(fā)生。如果能夠在MCI期甚至臨床前期識(shí)別AD 風(fēng)險(xiǎn)人群，將對(duì)后續(xù)的治療有重要的指導(dǎo)意義。

由于rGO 具有良好的穩(wěn)定性和生物相容性，常被用于構(gòu)建生物傳感器，對(duì)AD血液樣本進(jìn)行分析。Hwang 等［98］制備了一種依賴于電阻變化的rGO傳感器。為了評(píng)估傳感器的檢測(cè)性能，作者應(yīng)用該傳感器檢測(cè)血漿分離細(xì)胞外囊泡中的Aβ42，結(jié)果表明rGO傳感器在區(qū)分AD患者和正常對(duì)照組的臨床樣本時(shí)顯示出顯著的信號(hào)差異（P<0.001），這說明該傳感器在AD 診斷方面具有臨床應(yīng)用潛力。

基于SWCNTs的生物傳感器也可以用于AD患者血液樣本的分析。Kim 等［88］借助緊密堆積的SWCNTs薄膜生物傳感器，提供了一種基于血液樣本的多靶點(diǎn)檢測(cè)方法。通過測(cè)量血液樣本中t?tau/Aβ42、p?tau181/Aβ42和Aβ42/Aβ40的檢測(cè)信號(hào)值，該傳感器能夠?qū)崿F(xiàn)臨床診斷中AD患者與健康對(duì)照組的區(qū)分。該傳感器的平均靈敏度為90.0%，選擇性為90.0%，平均準(zhǔn)確率為88.6%。

目前已經(jīng)有許多納米檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用于臨床樣本的分析，要想應(yīng)用于對(duì)臨床樣本進(jìn)行AD疾病進(jìn)展的判斷，早日實(shí)現(xiàn)AD的早期診斷，還需要進(jìn)一步提高檢測(cè)器靈敏度、準(zhǔn)確性等檢測(cè)性能。

3 總結(jié)與展望

盡管人們對(duì)AD致病機(jī)制進(jìn)行了長(zhǎng)達(dá)近百年的探索，目前依然無(wú)法對(duì)AD 有一個(gè)透徹清晰的認(rèn)識(shí)。這也是阻礙AD 特效藥物研發(fā)的一個(gè)關(guān)鍵因素。已經(jīng)獲得批準(zhǔn)的AD治療藥物主要是用來延緩AD 疾病進(jìn)展，而不能從根本上阻止AD 進(jìn)展，因此，AD的早期診斷顯得至關(guān)重要。在眾多檢測(cè)方法中，納米體外診斷技術(shù)具有顯著的優(yōu)勢(shì)。納米技術(shù)不僅能夠?qū)z測(cè)信號(hào)轉(zhuǎn)換成光學(xué)、電學(xué)等易于檢測(cè)的信號(hào)，而且還能通過納米材料本身的性質(zhì)優(yōu)化檢測(cè)設(shè)備的性能。

近年來報(bào)道的檢測(cè)方法主要聚焦于檢測(cè)靈敏度的提高，要想在CSF和血漿這樣成分復(fù)雜的體系中實(shí)現(xiàn)AD生物標(biāo)志物的精準(zhǔn)檢測(cè)，提高檢測(cè)靈敏度仍然是一個(gè)值得關(guān)注的話題。越來越多的研究結(jié)果表明，對(duì)單一生物標(biāo)志物的檢測(cè)無(wú)法實(shí)現(xiàn)對(duì)AD進(jìn)展的準(zhǔn)確判斷。為了提高檢測(cè)的準(zhǔn)確度，目前的研究方向逐漸從僅針對(duì)單一靶點(diǎn)的檢測(cè)過渡到多個(gè)靶點(diǎn)的同時(shí)檢測(cè)。另外，要想在CSF和血液等復(fù)雜的體液中準(zhǔn)確定量生物標(biāo)志物，受體的特異性識(shí)別能力也是影響檢測(cè)性能的關(guān)鍵因素。目前已經(jīng)發(fā)展了多肽、類肽、核酸適配體等可替代抗體的受體識(shí)別分子。未來還需要開發(fā)更多特異性更強(qiáng)的受體識(shí)別元件。同時(shí)，在進(jìn)行復(fù)雜體液的檢測(cè)工作中，傳感器的信號(hào)穩(wěn)定性、重現(xiàn)性有待進(jìn)一步研究。為了將目前的檢測(cè)技術(shù)早日應(yīng)用于AD的臨床診斷，除了提高檢測(cè)靈敏度之外，診斷靈敏度也是一個(gè)值得關(guān)注的因素。人工智能的興起，提供了一種更為準(zhǔn)確的AD 診斷輔助工具。為了更好地實(shí)現(xiàn)AD 的預(yù)后判斷，實(shí)時(shí)追蹤AD藥物的治療效果，小型化、集成化的傳感芯片有待開發(fā)。納米技術(shù)、微流控技術(shù)、芯片制造技術(shù)和人工智能技術(shù)等的有機(jī)結(jié)合將推動(dòng)AD 體外診斷技術(shù)的快速發(fā)展，AD 早期診斷有望成為現(xiàn)實(shí)。