低溫等離子體改性糧油植物蛋白結(jié)構(gòu)的研究進(jìn)展

李 琦，支 愛，何學(xué)明，沈 飛 ，邢常瑞，F(xiàn)irew Tafesse Mamo

(南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院1，南京 210023) (江蘇高?，F(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心2，南京 210023) (巴赫達(dá)爾大學(xué)埃塞俄比亞生物技術(shù)研究所3，亞的斯亞貝巴 5954)

蛋白質(zhì)是人體細(xì)胞、組織和器官的重要組成成分，是人類飲食中的關(guān)鍵營養(yǎng)物質(zhì)，在維持人體健康方面起著至關(guān)重要的作用[1]。與動(dòng)物蛋白相比，糧油植物蛋白的功能性相對較低，如水溶性差、對環(huán)境脅迫條件如酸度、鹽和溫度的敏感性及復(fù)雜性限制了其在各工業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用發(fā)展[2]。但植物蛋白具有低脂、不含膽固醇，富含膳食纖維、活性物質(zhì)等優(yōu)勢，且攝入高質(zhì)量的植物蛋白可降低患多種代謝疾病的風(fēng)險(xiǎn)[3]。糧油植物蛋白主要來源于谷物(小麥、玉米、高粱等)、豆類(大豆、豌豆、蕓豆等)、油籽(花生、芝麻、油菜籽等)等農(nóng)作物及其副產(chǎn)品[4]，具有抗氧化性[4]、乳化性[5]、持水性和凝膠性[6]等功能，被廣泛應(yīng)用于食品、藥品、化妝品及包裝材料等領(lǐng)域。因此，植物蛋白質(zhì)被認(rèn)為是經(jīng)濟(jì)成本低、環(huán)境友好型和可再生性的動(dòng)物蛋白質(zhì)的替代品[7]。我國的糧食作物含有較多植物蛋白，其中大豆蛋白占比較高，不僅是我國重要的糧食作物，還是植物中蛋白含量最豐富，氨基酸組成最均衡，最有望成為動(dòng)物蛋白替代品的農(nóng)產(chǎn)品。對于蛋白而言，其結(jié)構(gòu)決定功能，故合理有效的蛋白質(zhì)改性方法可改善其功能特性、營養(yǎng)價(jià)值和感官特性，進(jìn)而拓寬植物蛋白在各領(lǐng)域的應(yīng)用[8]。目前，蛋白質(zhì)的改性方法包括物理改性、化學(xué)改性、酶法改性和基因工程改性[3]，新興的幾種物理改性介紹如表1所示。

低溫等離子體是一種非熱、安全、環(huán)保的物理改性技術(shù)，被廣泛應(yīng)用于污水凈化、高分子材料印刷、聚合材料改善等領(lǐng)域，是當(dāng)下食品非熱加工的一個(gè)研究熱點(diǎn)[15]。低溫等離子體是通過自身產(chǎn)生的活性氧(Reactive Oxygen Species，ROS)、活性氮(Reactive Nitrogen Species，RNS)、自由基及高速電子打破蛋白質(zhì)中共價(jià)鍵并引發(fā)各種化學(xué)反應(yīng)而對食品表面進(jìn)行改性的方法[16]，適用于熱敏性食品[17]，可在無外源添加劑的條件下對食品進(jìn)行清潔、殺菌和改性[18]，既能較好保持食品營養(yǎng)價(jià)值，也能改善食品功能特性。

表1 幾種蛋白質(zhì)物理改性方法介紹

因此，低溫等離子體技術(shù)在食品加工領(lǐng)域具有重要的探索意義，國外已廣泛將該技術(shù)用于植物蛋白改性，但國內(nèi)研究較少，故本文對該技術(shù)在植物蛋白質(zhì)改性中的應(yīng)用進(jìn)行了概述，并對低溫等離子體改性蛋白的機(jī)理及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系進(jìn)行了簡要闡述，以期為今后進(jìn)行該領(lǐng)域的研究提供參考。

1 低溫等離子體作用原理

低溫等離子體(Cold plasma)是指中性氣體在室溫條件下，通過微波、光脈沖、交流電和直流電等多種激發(fā)源產(chǎn)生的帶電粒子(電子、離子)和不帶電粒子(分子、激發(fā)態(tài)原子、亞穩(wěn)態(tài)原子、自由基)以及紫外線、γ射線、β射線等，被稱為繼固態(tài)、液態(tài)、氣態(tài)之外的第四態(tài)[19,20]。目前，國內(nèi)在低溫等離子體改性蛋白質(zhì)領(lǐng)域進(jìn)行了諸多研究，但對蛋白質(zhì)改性的機(jī)制解析鮮見報(bào)道。因此，以現(xiàn)有低溫等離子體在食品殺菌、農(nóng)殘降解、材料改性等方面的研究為基礎(chǔ)，對低溫等離子體對蛋白質(zhì)改性機(jī)理進(jìn)行簡要概括，其改性機(jī)理見圖1。

低溫等離子體對蛋白質(zhì)改性的機(jī)理一般包括ROS、RNS及自由基的氧化作用，紫外線的光子蝕刻作用，以及激發(fā)態(tài)或非激發(fā)態(tài)原子和分子的蝕刻作用，其具體作用為：

pH作用：經(jīng)研究，pH降低主要與幾個(gè)原因有關(guān)：1)等離子體中的ROS、RNS及自由基等一些活性成分直接或間接參與蛋白質(zhì)氧化產(chǎn)生酸性物質(zhì)[21]；2)空氣氣體經(jīng)電場作用產(chǎn)生氮氧化物與水作用生成亞硝酸(HNO2)和硝酸(HNO3)[22]；3)高能電子或離子轟擊蛋白質(zhì)溶液產(chǎn)生酸性離子(H3O+)[23]。這些物化反應(yīng)均會(huì)改變處理樣品的 pH。蛋白質(zhì)屬于兩性電解質(zhì)，其解離程度取決于所處溶液的酸堿度。在蛋白質(zhì)等電點(diǎn)(pI)處，蛋白質(zhì)溶解度最小，會(huì)發(fā)生變性沉淀[24,25]。當(dāng)溶液 pH 偏離蛋白質(zhì)等電點(diǎn) 0.5 pH單位以上時(shí)，蛋白質(zhì)溶解度增加[24]。因此，蛋白質(zhì)在不同 pH 條件下會(huì)發(fā)生不同程度的變性，且環(huán)境中的酸性、堿性基團(tuán)也會(huì)在其他因素作用下與蛋白質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，進(jìn)而對蛋白質(zhì)改性。但是，等離子體處理樣品時(shí)，pH 值作用多適用于液體樣品，通過水的電離及與CO2間的相互作用使溶液呈酸性進(jìn)而改性蛋白質(zhì)；所以，當(dāng)樣品水分含量低時(shí)，樣品 pH 幾乎不變，作用效果一般。

紫外光作用：等離子體形成過程會(huì)伴隨著光輻射，其中包括紫外線和可見光[20]。紫外光子的光解作用會(huì)打破蛋白質(zhì)分子間鍵，破壞其氨基酸的結(jié)構(gòu)，使蛋白質(zhì)失活[26]。由于紫外線可被色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)和苯丙氨酸(Phe)等芳香族氨基酸吸收，所以紫外線輻射會(huì)誘導(dǎo)蛋白結(jié)構(gòu)變化，產(chǎn)生化學(xué)修飾[27]。Kumar 等[28]證實(shí)了紫外光會(huì)誘導(dǎo)小麥粉中蛋白主鏈及其構(gòu)像改變，進(jìn)而影響小麥粉蛋白的功能性質(zhì)。有研究證明，正常條件下，紫外線極易被空氣和水等介質(zhì)吸收，所以對蛋白質(zhì)溶液改性的作用有限[29,30]。紫外線的產(chǎn)生需要低溫等離子體在高壓條件下激發(fā)，較低電壓的等離子體處理產(chǎn)生的紫外線極少，部分還被介質(zhì)吸收，故對蛋白改性的效果極微；較高電壓的等離子體處理可產(chǎn)生較多的紫外線，但較高電壓會(huì)對蛋白功能特性產(chǎn)生不利影響。因此，紫外光作用對蛋白改性具有局限性。

圖1 蛋白質(zhì)改性機(jī)理

活性粒子氧化作用：低溫等離子體體系中反應(yīng)物經(jīng)電場作用產(chǎn)生大量氧自由基(·O)、羥自由基(·OH)、臭氧(O3)、二氧化氮(NO2)等活性物質(zhì)，這些活性物質(zhì)會(huì)與蛋白質(zhì)分子相互作用，對蛋白質(zhì)氨基酸殘基進(jìn)行修飾，進(jìn)而改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)[31,32]。劉志偉等[33]在介質(zhì)阻擋放電等離子體處理誘導(dǎo)氧化降低 IgG/IgE 的結(jié)合能力并提高甘氨酸的功能性研究中表明，甘氨酸的IgG/IgE結(jié)合能力下降與氨基酸間肽鍵的氧化及敏感氨基酸(Trp、Tyr、Phe)的氧化有關(guān)，這些氧化修飾會(huì)破壞分子間氫鍵和氨基酸間的其他非共價(jià)相互作用，導(dǎo)致蛋白質(zhì)改性。低溫等離子體改性蛋白質(zhì)的關(guān)鍵物質(zhì)是活性氧與活性氮，它們可誘導(dǎo)蛋白質(zhì)發(fā)生化學(xué)鍵的變化及氨基酸側(cè)鏈的氧化等結(jié)構(gòu)變化，進(jìn)而改變蛋白質(zhì)功能特性。蛋白質(zhì)與活性粒子間的相互作用通常發(fā)生在蛋白質(zhì)表面幾納米到幾十納米之間，故活性粒子的氧化作用多作用于蛋白質(zhì)表面，蛋白改性程度與蛋白質(zhì)和活性粒子接觸的比表面積有關(guān)。因此，利用等離子體處理蛋白粉末時(shí)，可采用過篩的方法控制蛋白粉末的粒徑，進(jìn)一步擴(kuò)大蛋白粉的比表面積，從而達(dá)到良好的改性目的。

高速粒子蝕刻作用：低溫等離子體的產(chǎn)生是一個(gè)能量不斷傳遞的過程，即外加電場使電子獲得能量撞擊周圍氣體，使氣體被激發(fā)電離形成大量電子，且系統(tǒng)中部分原子或分子在放電后期也會(huì)被激發(fā)生成一些高能活性粒子，這些粒子會(huì)與未被激發(fā)的粒子發(fā)生非彈性碰撞，并得到大量活性自由基[34,35]。高能活性粒子在電場作用下會(huì)不斷轟擊蛋白表面產(chǎn)生蝕刻現(xiàn)象，且會(huì)將自身能量傳遞給物質(zhì)表面，誘導(dǎo)物質(zhì)表面的共價(jià)鍵破裂或新化學(xué)鍵形成，進(jìn)而啟動(dòng)一系列化學(xué)反應(yīng)[36]，此現(xiàn)象導(dǎo)致的理化變化包括化學(xué)鍵的斷裂、化學(xué)降解和低分子質(zhì)量片段的去除等[37]。但共價(jià)鍵的破裂和新化學(xué)鍵形成等變化只能發(fā)生在蛋白質(zhì)表面，改性程度有所限制。研究表明，由于放電過程中的蝕刻作用影響，低溫等離子處理能夠增加聚合物表面的粗糙度或使蛋白表面產(chǎn)生空穴，進(jìn)而對蛋白進(jìn)行改性[38]。高速粒子蝕刻作用不僅會(huì)使蛋白產(chǎn)生空穴現(xiàn)象，還會(huì)使蛋白粒徑減小，從而加大蛋白與活性粒子的接觸面，更有利于蛋白的改性。

2 低溫等離子體對植物蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響

蛋白質(zhì)是由多種氨基酸按一定順序通過肽鍵彼此連接形成的具有特定空間結(jié)構(gòu)的生物大分子，是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)[39]。大多數(shù)蛋白質(zhì)分子至少存在 3 個(gè)水平的構(gòu)像結(jié)構(gòu)，包括一級(jí)結(jié)構(gòu)、二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)，具體結(jié)構(gòu)情況見圖2。蛋白質(zhì)功能特性可分為三類：蛋白質(zhì)與水相互作用，如溶解性、持水力等；蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用，凝膠性、沉淀等；蛋白質(zhì)界面性質(zhì)，乳化性、起泡性等[40]。通常，蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)決定高級(jí)結(jié)構(gòu)，高級(jí)結(jié)構(gòu)是蛋白質(zhì)行使功能性質(zhì)的基礎(chǔ)，而蛋白質(zhì)各種功能性質(zhì)又是其結(jié)構(gòu)的表現(xiàn)。因此，在研究蛋白質(zhì)功能改性以拓寬其應(yīng)用時(shí)，應(yīng)對蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行全面探討。

圖2 蛋白質(zhì)構(gòu)像結(jié)構(gòu)

2.1 表面微觀結(jié)構(gòu)

低溫等離子體處理作為一種有效的表面改性技術(shù)，能顯著改變材料表面的形貌。如低溫等離子體產(chǎn)生的高能粒子在電場作用下會(huì)不斷撞擊蛋白質(zhì)分子表面，以改變蛋白質(zhì)外觀，對其產(chǎn)生一定的物理修飾作用[39]；存在的活性粒子及自由基會(huì)與蛋白質(zhì)表面的氨基酸殘基發(fā)生氧化反應(yīng)，對蛋白質(zhì)產(chǎn)生化學(xué)修飾，進(jìn)而改變蛋白質(zhì)形態(tài)。通常采用掃描電子顯微鏡觀察低溫等離子體處理前后蛋白質(zhì)表面微觀結(jié)構(gòu)的變化。Dong 等[42]分別采用 50、75、100、125 V電壓的大氣低溫等離子體處理玉米蛋白粉，結(jié)果表明低溫等離子體處理后的蛋白質(zhì)表面粗糙，未處理樣品的表面光滑，隨處理電壓升高，光滑表面逐漸消失，出現(xiàn)不規(guī)則扭曲和破裂，處理電壓達(dá)到75 V 時(shí)，樣品表面出現(xiàn)明顯的空腔現(xiàn)象，是由低溫等離子體處理時(shí)產(chǎn)生的高速粒子碰撞造成，且隨電壓增大，粒子間碰撞越激烈，蛋白表面越粗糙，但功能性在高電壓下會(huì)變差。Sharafodin 等[43]探究介質(zhì)阻擋放電低溫等離子體在大豆分離蛋白理化性質(zhì)修飾中的潛在應(yīng)用時(shí)，分別采用不同時(shí)間和電壓處理樣品，結(jié)果表明，等離子體處理的樣品表面根據(jù)處理電壓不同出現(xiàn)不同大小的孔穴，主要由高速等離子體流產(chǎn)生的太陽風(fēng)使蛋白質(zhì)分子間相互碰撞及等離子體中的高能電子、離子和其他類型活性粒子與蛋白表面相互作用這兩種方式造成，并表明不是蛋白表面改性越大，蛋白功能特性越優(yōu)異，當(dāng)其電壓達(dá)到20 kV并處理15 min 時(shí)，蛋白功能特性出現(xiàn)顯著下降。低溫等離子體處理可通過蝕刻作用改變蛋白質(zhì)分子表面，對蛋白質(zhì)產(chǎn)生物理修飾作用，但研究者需通過控制蛋白處理量及處理?xiàng)l件來達(dá)到相應(yīng)的改性效果。此外，低溫等離子體對蛋白表面的作用程度并不與蛋白的功能特性成正相關(guān)，且處理不同蛋白時(shí)的作用效果不同，故使用等離子體改性蛋白時(shí)應(yīng)對其處理?xiàng)l件進(jìn)行探索。

2.2表面疏水性

蛋白質(zhì)表面疏水性是指蛋白質(zhì)表面與極性溶液環(huán)境接觸時(shí)的疏水基團(tuán)數(shù)量，主要取決于芳香族和脂肪族氨基酸殘基的暴露程度[44]。疏水相互作用被認(rèn)為是維系蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)的主要作用力，在三級(jí)結(jié)構(gòu)的形成和穩(wěn)定中起著重要的作用[45]。蛋白質(zhì)表面疏水基團(tuán)的數(shù)量會(huì)影響蛋白質(zhì)分子在水溶液中的膠束大小，進(jìn)而影響蛋白質(zhì)的溶解性。因此，蛋白質(zhì)表面疏水性是研究蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的重要參數(shù)，通常采用 ANS 發(fā)射熒光探針測定蛋白質(zhì)表面的疏水性。Ji 等[46]采用 35 V 介質(zhì)阻擋放電低溫等離子體分別對花生分離蛋白溶液處理 1、2、3、4 min 后發(fā)現(xiàn)，花生分離蛋白表面疏水性隨處理時(shí)間的增加逐漸降低，表明蛋白間疏水相互作用減少，親水作用增加，蛋白質(zhì)的溶解度也相應(yīng)增加，疏水性的降低是由蛋白內(nèi)部疏水基團(tuán)暴露引起。經(jīng)研究證明，蛋白疏水性的變化主要由親水基團(tuán)的引入和蛋白內(nèi)部疏水基團(tuán)的暴露有關(guān)。此外，蛋白質(zhì)粒徑的大小也會(huì)因比表面積的變化來影響疏水基團(tuán)的暴露比，進(jìn)而影響蛋白質(zhì)的疏水性。Dong等[41]在接觸角分析中也得出相應(yīng)的結(jié)論。有研究認(rèn)為，低溫等離子體處理后親水性提高可能與樣品表面引入的含氧基團(tuán)有關(guān)，可增加了樣品表面的潤濕性[47-49]。但是，低溫等離子體處理蛋白質(zhì)并不總是降低蛋白表面的疏水性，季慧等[50]在常壓低溫等離子處理提高花生分離蛋白水合性質(zhì)的研究中表明處理時(shí)間在3 min內(nèi)時(shí)，疏水性逐漸下降，花生分離蛋白對水的結(jié)合能力增強(qiáng)，其凝膠持水性(WHC)也相應(yīng)增強(qiáng)，但3 min后，由于蛋白質(zhì)分子展開，暴露更多內(nèi)部疏水基團(tuán)，使得蛋白質(zhì)疏水性又有所增強(qiáng)。因此，低溫等離子體不同處理?xiàng)l件對蛋白疏水性的影響也不同，且影響疏水性會(huì)受蛋白種類、粒徑、pH等因素的影響，但低溫等離子體可通過高壓電場作用產(chǎn)生的活性氧、活性氮等活性粒子對蛋白改性，故采用不同氣體包裝蛋白粉或在處理器中充斥不同氣體成分均會(huì)對蛋白質(zhì)產(chǎn)生不同程度的改性，但尚未發(fā)現(xiàn)相關(guān)研究，后續(xù)研究應(yīng)針對不同氣體成分對蛋白結(jié)構(gòu)及功能特性的影響進(jìn)行系統(tǒng)研究。

2.3 二級(jí)結(jié)構(gòu)

蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)是指蛋白質(zhì)多肽鏈借助氫鍵進(jìn)行自身盤繞折疊的方式，主要有α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲，是蛋白質(zhì)形成立體結(jié)構(gòu)的前提[51]。傅里葉變換紅外光譜(FTIR)是一種很好的生物分析方法[52]，可用于研究化學(xué)鍵的變化，故用來測定蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)。在 FTIR 光譜研究中通常選用酰胺Ⅰ帶(1 600～1 700 cm-1)的變化分析蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化，該區(qū)域代表了蛋白質(zhì)主干中最突出、最敏感的振動(dòng)帶[53]。研究表明，蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)對應(yīng)條帶為：α-螺旋(1 650～1 660 cm-1)、β-折疊(1 618～1 640和1 670～1 690 cm-1)、β-轉(zhuǎn)角(1 660～1 670和1 690～1 700 cm-1)、無規(guī)則卷曲(1 645 cm-1)[54]。Ji 等[55]在大氣壓低溫等離子體(ACP)處理花生蛋白分離物的研究中表明，ACP 處理 3 min 時(shí)，處理組樣品與未處理組相比，β-轉(zhuǎn)角含量呈增加的趨勢，但β-折疊含量則出現(xiàn)明顯下降；當(dāng)處理時(shí)間超過 3 min 時(shí)，β-折疊和無規(guī)卷曲含量增加，而α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角的含量有所下降，花生分離蛋白的結(jié)構(gòu)經(jīng)處理后被破壞，蛋白構(gòu)象從致密、折疊變成展開、松散，該研究的二級(jí)結(jié)構(gòu)變化與 Misra 等[69]在大氣低溫等離子體處理小麥粉的研究結(jié)果一致。蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的展開、松散與電場下高速粒子的蝕刻作用和活性粒子對蛋白基團(tuán)的氧化作用有關(guān)，在多種作用下，蛋白質(zhì)的化學(xué)鍵被打開、重新折疊或氧化，從而改變蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響蛋白質(zhì)的功能特性。有研究結(jié)果表明α-螺旋、β-折疊均與樣品疏水性有關(guān)，α-螺旋含量越低、β-折疊含量越高其疏水性越大，溶解性就相對較差，乳化活性也就相對越好[73]。Ji 等[58]表明，較高的β-折疊和無規(guī)則卷曲含量可以提高溶解度、持水性和起泡性。因此，并不是β-折疊含量高，其溶解性差，這還要根據(jù)其分子內(nèi)外的β-折疊含量比、疏水基團(tuán)與親水基團(tuán)間的比例等因素影響，結(jié)構(gòu)變化是對功能性的一種解釋手段，但是否存在必然關(guān)系，其關(guān)系如何需進(jìn)一步研究。大量研究表明，低溫等離子體處理過程中的蝕刻作用會(huì)使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開，產(chǎn)生的活性粒子也會(huì)氧化蛋白質(zhì)的氨基酸基團(tuán)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)改變，最終起到改變蛋白質(zhì)的溶解性、乳化性、起泡性等功能性質(zhì)的作用。

2.4 游離巰基

巰基(-SH)和二硫鍵(S-S)是蛋白質(zhì)基食品中表達(dá)功能性質(zhì)的兩個(gè)重要功能基團(tuán)，二者間的轉(zhuǎn)換或變化代表著蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化[58]。維持蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的主要作用力——二硫鍵，是蛋白質(zhì)分子中巰基氧化形成。氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)中含有對氧敏感的巰基和芳香基，易被活性粒子氧化，其中半胱氨酸最為敏感[59]。此外，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的共價(jià)鍵(S—S 鍵、C—S 鍵)之間的裂解能較低，在等離子體處理過程中很容易發(fā)生裂解[60]。巰基和二硫鍵的變化會(huì)改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，進(jìn)而改變其功能特性，是研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的重要參數(shù)，通常采用分光光度法測定。Segat 等[61]在大氣壓低溫等離子體(ACP)處理乳清分離蛋白模型溶液的研究中表明，與對照組相比，處理組樣品中的游離巰基隨處理時(shí)間延長，游離巰基的含量逐漸降低，在 ACP 處理 10 min時(shí)，-SH含量降到初始值的一半，故表明ACP會(huì)誘導(dǎo)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中存在的半胱氨酸巰基丟失。研究結(jié)果表明，巰基經(jīng)過氧化會(huì)轉(zhuǎn)變成分子間的二硫鍵，從而加強(qiáng)分子間的穩(wěn)定性，與薄膜結(jié)構(gòu)間存在良好的相關(guān)性。季慧等[62]在低溫等離子體處理對花生分離蛋白溶解行為的研究中分別采用 1、2、3、4 min處理樣品，結(jié)果顯示，經(jīng)處理后花生蛋白中的總巰基含量逐漸減少，在處理3 min時(shí)，總巰基含量與未處理樣品相比，降低了50%，這與巰基被氧化成二硫鍵有關(guān)，隨后總巰基含量有所增加是因?yàn)楦吣芰Ｗ拥霓Z擊使生成的二硫鍵斷裂重新形成巰基。故低溫等離子體處理蛋白時(shí)，巰基含量的變化趨勢并不是一成不變的，當(dāng)處理?xiàng)l件不同時(shí)，不同的作用方式會(huì)對巰基含量產(chǎn)生不同的影響。游離巰基并不是隨處理時(shí)間的延長而無限增加的，適當(dāng)?shù)牡入x子體處理會(huì)使蛋白分子中的巰基氧化生成二硫鍵，過度處理則會(huì)使形成的二硫鍵再次斷裂。而且，低溫等離子體是一個(gè)復(fù)雜的體系，其處理對蛋白質(zhì)的影響是相互作用的結(jié)果，故在用低溫等離子體改性蛋白時(shí)應(yīng)針對不同蛋白探索相應(yīng)的處理參數(shù)，并將該蛋白質(zhì)性能修飾到最佳效果。

2.5 分子質(zhì)量分布

蛋白質(zhì)大多是由多個(gè)亞基通過二硫鍵結(jié)合而成的大分子物質(zhì)，若二硫鍵被破壞，構(gòu)成蛋白質(zhì)的亞基分開，其結(jié)構(gòu)和分子質(zhì)量也會(huì)相應(yīng)發(fā)生改變。因此，測定蛋白質(zhì)分子質(zhì)量是研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)改變的重要參數(shù)，通常采用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)測定，表征蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)和其組成。SDS-PAGE 可通過SDS消除蛋白質(zhì)分子間原有的電荷差異和分子形狀差異，從而使該電泳速度只取決于蛋白質(zhì)分子質(zhì)量大小。Mahdavian 等[63]對草豆(甘草豆)分離蛋白(GPPI)納米顆粒分別采用 9.4、18.6 kVpp的大氣低溫等離子體處理300、600 s，其 SDS-PAGE 結(jié)果顯示，非還原條件下，草豆分離蛋白在高壓和長時(shí)間處理后分子質(zhì)量發(fā)生改變，且在酸性和堿性條件下的亞基也存在不同程度的變化，還會(huì)出現(xiàn)新的亞基條帶，新亞基條帶的出現(xiàn)主要是由物理和化學(xué)蝕刻作用使原始蛋白聚集體破壞，使其碎片化造成的。根據(jù) Segat 等[59]的研究表明，蛋白分子質(zhì)量的變化主要與二硫鍵的變化或硫醇在等離子體處理過程中過度氧化有關(guān)。通常，蛋白質(zhì)是由肽鏈經(jīng)二硫鍵連接并折疊盤區(qū)而成的，二硫鍵的斷裂會(huì)使蛋白小亞基條帶增多，相反，二硫鍵的形成會(huì)出現(xiàn)較大亞基條帶，但二硫鍵的變化不會(huì)影響蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)。這表明二硫鍵的斷裂會(huì)使原蛋白聚集體解聚，形成小分子亞基，但蛋白質(zhì)的主要條帶不變，即該處理不會(huì)改變蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)。因此，適當(dāng)?shù)蜏氐入x子體處理可在不改變蛋白質(zhì)分子主要條帶的前提下使蛋白質(zhì)分子展開，改善蛋白質(zhì)功能。但較高電壓或較長處理時(shí)間的等離子體處理會(huì)因二硫鍵的再次形成而使較小分子亞基間鍵合形成較大亞基，但是否會(huì)對蛋白質(zhì)分子主要條帶產(chǎn)生影響還需進(jìn)一步研究。

3 結(jié)語及展望

在糧油食品加工過程中，由于低溫等離子體處理屬于非熱加工，所以對處理樣品的理化性質(zhì)及感官性質(zhì)影響較小，可最大程度的保持原有品質(zhì)。低溫等離子體改性蛋白質(zhì)的機(jī)理主要是高速粒子對蛋白表面的蝕刻作用和活性粒子與蛋白質(zhì)氨基酸殘基的相互作用，不會(huì)改變植物蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)及氨基酸組成，且植物蛋白中脂肪含量低，活性粒子的氧化作用并不會(huì)引起大量脂肪酸氧化，進(jìn)而影響植物蛋白的營養(yǎng)價(jià)值及感官品質(zhì)。但低溫等離子體的作用機(jī)理均局限于蛋白表面，無法使蛋白徹底改性，且處理?xiàng)l件、處理樣品的種類及樣品內(nèi)部結(jié)構(gòu)均會(huì)影響蛋白質(zhì)的改性效果，故距離現(xiàn)實(shí)應(yīng)用還需要進(jìn)一步研究。

隨著低溫等離子體(CP)在蛋白質(zhì)改性領(lǐng)域的應(yīng)用，CP對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的作用機(jī)制需要更深入的探索。此外，單一 CP處理對蛋白質(zhì)的改性存在一定的局限性，可與一些傳統(tǒng)蛋白質(zhì)改性方法相結(jié)合，如酶法與CP處理結(jié)合、糖基化與CP處理結(jié)合等，以提高蛋白質(zhì)改性的效果。當(dāng)前，大多低溫等離子體改性蛋白的研究均采用介質(zhì)阻擋低溫等離子體，且多將樣品置于培養(yǎng)皿內(nèi)處理，其處理面積及作用效果均受到限制，后續(xù)可針對蛋白改性設(shè)計(jì)相應(yīng)的等離子體處理器，將樣品直接置于處理器內(nèi)，并向處理器中充入相應(yīng)的改性氣體，從而達(dá)到蛋白改性的目的。最后，CP改性后的蛋白質(zhì)是否存在過敏性、處理本身是否安全或是否會(huì)存在其他的安全隱患均需進(jìn)行大量毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)，以確保 CP改性蛋白質(zhì)的食用安全及使用安全，進(jìn)而為大規(guī)模的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展打下基礎(chǔ)。