不同溫度下短時(shí)間磁場(chǎng)處理對(duì)大鼠血清的影響

王焱冰 劉炳君 劉 纓,2

(1 北京中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京，102488; 2 中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所腦與認(rèn)知國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京，100101)

血液檢測(cè)是臨床診斷和科研中常用的分析方法，血液標(biāo)本在進(jìn)行采集、儲(chǔ)存、送檢、分離等環(huán)節(jié)對(duì)血液質(zhì)量、生化檢驗(yàn)的結(jié)果以及血液樣品的使用產(chǎn)生影響[1-4]。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中血液的檢測(cè)優(yōu)選現(xiàn)取現(xiàn)測(cè)，但在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量較多時(shí)，經(jīng)驗(yàn)不足的實(shí)驗(yàn)者常會(huì)忽略待測(cè)血液的放置時(shí)間及溫度對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響[5-7]，導(dǎo)致不同程度的血液質(zhì)量或指標(biāo)的改變[8]。此外，現(xiàn)有的血液保存方法往往采用低溫冷藏，能相對(duì)減少血液在儲(chǔ)藏過(guò)程中的“儲(chǔ)存損傷”[9]。但也有研究表明，低溫保存會(huì)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，造成血液質(zhì)量指標(biāo)如2,3-二磷酸甘油酸(2,3-diphosphoglycerate，2,3-DPG)等下降[10]。因此，正確的血液保存是血液檢測(cè)和制品質(zhì)量保證的關(guān)鍵。

中醫(yī)的“天人合一”理論[11]認(rèn)為，正常狀態(tài)下，人與自然界即外在環(huán)境保持著平衡統(tǒng)一的整體關(guān)系，而這種整體關(guān)系的溝通是通過(guò)“氣”的相互作用達(dá)成的。人體之氣與自然界之氣交相呼應(yīng)，互相影響。磁場(chǎng)是一種能量場(chǎng)，可以看作是中醫(yī)描述的“氣”的一種，對(duì)生物體產(chǎn)生影響[12]。隨著現(xiàn)代科技的發(fā)展及檢測(cè)方式的多樣化，人們對(duì)磁場(chǎng)的認(rèn)識(shí)日益清晰，衡量磁場(chǎng)的參數(shù)及性能指標(biāo)也逐步完善，磁場(chǎng)的運(yùn)用方向也隨之拓展[13]。

近年來(lái)，有研究指出磁場(chǎng)強(qiáng)度的改變對(duì)血液的血紅蛋白、血小板等多種生理指標(biāo)產(chǎn)生影響[14-16]。Lin等[17]檢測(cè)了24 h靜態(tài)強(qiáng)磁場(chǎng)對(duì)冷凍紅細(xì)胞存活率的影響，結(jié)果顯示0.2 T組和0.4 T組冷凍紅細(xì)胞相對(duì)存活率分別提高5.7%和9.1%，其中，0.4 T靜磁場(chǎng)24 h處理可降低紅細(xì)胞膜流動(dòng)性、提高紅細(xì)胞膜穩(wěn)定性。磁場(chǎng)也能夠影響組織和血液中氧化應(yīng)激水平[18-19]，王勤友等[19]發(fā)現(xiàn)中心磁場(chǎng)強(qiáng)度為40 mT的H型強(qiáng)場(chǎng)磁化杯每天處理12 h能使紅細(xì)胞超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)在第7、14、21、28、35天時(shí)明顯降低，可能通過(guò)減弱氧化損傷保護(hù)紅細(xì)胞；Terpilovskii等[20]發(fā)現(xiàn)弱磁場(chǎng)(<5 μT)可損害紅細(xì)胞的功能狀態(tài)；丁海敏[21]發(fā)現(xiàn)亞磁場(chǎng)暴露48 h使小鼠血清中SOD活力顯著低于地磁組；本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)亞磁場(chǎng)能直接促進(jìn)體外銅鋅超氧化物歧化酶(CuZn-SOD)蛋白的聚集，進(jìn)而加速其失活[22]。此外，Ciorba和Morariu[23]發(fā)現(xiàn)亞磁場(chǎng)(<500 nT)導(dǎo)致室溫下儲(chǔ)存72 h血液中谷草轉(zhuǎn)氨酶(Glutamic-oxaloacetic Transaminase，GOT)和谷丙轉(zhuǎn)氨酶(Glutamic-pyruvic Transaminase，GPT)活性明顯下降。

磁場(chǎng)確實(shí)會(huì)對(duì)血液質(zhì)量產(chǎn)生影響，因此在本實(shí)驗(yàn)中，我們以4種不同的磁場(chǎng)強(qiáng)度對(duì)不同保存溫度下大鼠血液進(jìn)行短時(shí)間(2 h)的體外暴露處理，并對(duì)血清中GOT、GPT、SOD、2,3-DPG進(jìn)行檢測(cè)，系統(tǒng)分析短時(shí)間磁場(chǎng)處理對(duì)不同溫度下血液質(zhì)量變化的影響，探索針對(duì)不同檢測(cè)指標(biāo)血樣的磁場(chǎng)輔助保存技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 32只無(wú)特定病原體(Specific Pathogen Free，SPF)級(jí)雄性SD(Sprague Dawly)大鼠(北京斯貝福生物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SYXK2014-32)，體質(zhì)量(220±20) g，6～8周齡。實(shí)驗(yàn)室和動(dòng)物房由中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所提供,室溫(24±1)℃，濕度(50±1)%，12 h明暗交替環(huán)境，標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)。所有實(shí)驗(yàn)程序遵循中華人民共和國(guó)科技部頒布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》,均經(jīng)中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所動(dòng)物福利與研究倫理委員會(huì)審批(倫理審批號(hào):4-2021090804-3074)。

1.1.2 試劑與儀器 GOT試劑盒(南京建成科技有限公司，貨號(hào)：C009-2-1)，GPT試劑盒(南京建成科技有限公司，貨號(hào)：C009-2-2)，SOD測(cè)定試劑盒(南京建成科技有限公司，貨號(hào)：A001-3-2)，2,3-DPG酶聯(lián)免疫試劑盒(上海江萊生物科技有限公司，貨號(hào)：JL40950)，三溴乙醇(南京愛(ài)貝生物科技有限公司，型號(hào)：M2940)；坡莫合金磁屏蔽罐[24]、塑料對(duì)照罐(直徑×高度，20 cm×10 cm)，釹鐵硼永磁體(直徑×厚度50 mm×5 mm)(以上由中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所自制)，中科院生物物理所北京磁共振成像中心磁共振成像儀(西門子股份公司，德國(guó)，型號(hào)：Prisma fit 3.0T)，CCG-1000感應(yīng)式交變磁強(qiáng)計(jì)(中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院自制)，手持式高斯計(jì)(長(zhǎng)沙天恒測(cè)控技術(shù)有限公司，型號(hào)：TD8620)，冷凍離心機(jī)(Sigma公司，德國(guó)，貨號(hào)：3K18)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 分別以塑料對(duì)照罐、坡莫合金磁屏蔽罐構(gòu)建地磁場(chǎng)、亞磁場(chǎng)環(huán)境，以2塊釹鐵硼永磁體相夾6 mm培養(yǎng)皿構(gòu)建強(qiáng)磁場(chǎng)環(huán)境，以磁共振成像中心磁共振成像儀構(gòu)建超強(qiáng)磁場(chǎng)環(huán)境。見(jiàn)圖1。大鼠經(jīng)7 d適應(yīng)性飼養(yǎng)后，對(duì)其進(jìn)行腹腔注射阿佛丁麻醉，腹主動(dòng)脈取血[25]。每只鼠血樣等分為8份，隨機(jī)分為室溫組(25 ℃)和低溫冷藏組(0～4 ℃)，每個(gè)溫度組分別設(shè)置地磁場(chǎng)組、亞磁場(chǎng)組[26]、強(qiáng)磁場(chǎng)組、超強(qiáng)磁場(chǎng)組[27]4組，每組8只。

圖1 磁場(chǎng)處理設(shè)備

1.2.2 干預(yù)方法 首先對(duì)磁場(chǎng)強(qiáng)度進(jìn)行檢測(cè)，使用中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院提供的CCG-1000感應(yīng)式交變磁強(qiáng)計(jì)分別測(cè)量坡莫合金磁屏蔽罐、塑料對(duì)照罐的磁場(chǎng)強(qiáng)度，使用TD8620高斯計(jì)測(cè)量釹鐵硼永磁體強(qiáng)度。在磁場(chǎng)環(huán)境中分別測(cè)定培養(yǎng)皿中心點(diǎn)，皿沿方形邊中心正西點(diǎn)，正東點(diǎn)、正南點(diǎn)，正北點(diǎn)的磁場(chǎng)強(qiáng)度，計(jì)算出磁場(chǎng)環(huán)境磁場(chǎng)強(qiáng)度總量。將全血樣品按不同溫度和磁場(chǎng)條件處理2 h。將血樣用冷凍離心機(jī)(1 000×g)4 ℃離心10 min，取上層血清，用于后續(xù)生化指標(biāo)的檢測(cè)。

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法 使用GOT試劑盒、GPT試劑盒、SOD測(cè)定試劑盒、2,3-DPG酶聯(lián)免疫試劑盒對(duì)血清進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)過(guò)程嚴(yán)格按照試劑盒的操作流程進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 磁場(chǎng)強(qiáng)度檢測(cè) 經(jīng)檢測(cè)，在實(shí)驗(yàn)時(shí)塑料對(duì)照罐模擬的地磁場(chǎng)強(qiáng)度為(49.4±0.7)μT(表1)、坡莫合金磁屏蔽罐模擬的亞磁場(chǎng)強(qiáng)度為(3.0±0.2)μT(表1)、釹鐵硼永磁體模擬的強(qiáng)磁場(chǎng)強(qiáng)度為(126.6±20.5) mT(表2)以及超強(qiáng)磁場(chǎng)強(qiáng)度由磁共振成像儀設(shè)定為1.7 T。

表1 坡莫合金磁屏蔽罐及塑料對(duì)照罐不同位置磁場(chǎng)強(qiáng)度總量和各方向分量分布情況(μT)

表2 強(qiáng)磁場(chǎng)釹鐵硼永磁體磁場(chǎng)分布情況

2.2 室溫下不同磁場(chǎng)強(qiáng)度短時(shí)間處理對(duì)血液的影響 室溫下，不同磁場(chǎng)條件對(duì)血液指標(biāo)的影響不同。如圖2A所示，2 h處理后不同磁場(chǎng)處理組的GOT活力均低于地磁場(chǎng)組，亞磁場(chǎng)組和強(qiáng)磁場(chǎng)組的GOT活力分別降至73%±0.5%和83%±0.4%，超強(qiáng)磁場(chǎng)組GOT顯著下降，活力均值僅為地磁場(chǎng)組的58%±0.1%(P<0.01)。如圖2B所示，GPT對(duì)亞磁場(chǎng)處理的響應(yīng)則呈現(xiàn)升高趨勢(shì)，2 h處理后亞磁場(chǎng)組GPT活力升至111%±0.1%，而強(qiáng)磁場(chǎng)和超強(qiáng)磁場(chǎng)組的GPT分別降至80%±0.1%和91%±0.1%。如圖2C、2D所示，SOD和2,3-DPG指標(biāo)經(jīng)磁場(chǎng)處理后分別呈現(xiàn)下降和上升趨勢(shì)，亞磁、強(qiáng)磁、超強(qiáng)磁場(chǎng)組SOD分別為地磁場(chǎng)組的100%±0.4%、96%±1%、98%±0.3%，2,3-DPG指標(biāo)則分別為111%±0.1%、109%±0.3%、107%±0.03%。但相較GOT和GPT而言，變化幅度更低，各組間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。

2.3 低溫下不同磁場(chǎng)強(qiáng)度短時(shí)間處理對(duì)血液的影響 低溫4 ℃條件下，不同磁場(chǎng)條件對(duì)血液指標(biāo)的影響不同。如圖2A所示，與低溫下的地磁場(chǎng)組相比，2 h處理后亞磁場(chǎng)組的GOT活性提升為122%±0.4%，強(qiáng)磁場(chǎng)和超強(qiáng)磁場(chǎng)組的GOT活力均有降低趨勢(shì)，降為其89%±0.1%和81%±0.2%。各磁場(chǎng)組GPT活性在低溫下都有下降趨勢(shì)，但不顯著(圖2B)。如圖2C所示，低溫下各個(gè)磁場(chǎng)組2 h處理后SOD均沒(méi)有明顯變化。如圖2D所示，低溫下超強(qiáng)磁場(chǎng)2 h處理后的2,3-DPG與低溫下其他各磁場(chǎng)組相比均顯著降低(超強(qiáng)磁場(chǎng)組/地磁場(chǎng)組=75%±0.2%，超強(qiáng)磁場(chǎng)組/亞磁場(chǎng)組=68%±1.6%，超強(qiáng)磁場(chǎng)組/強(qiáng)磁場(chǎng)組=68%±0.3%，P<0.001),而亞磁場(chǎng)和強(qiáng)磁場(chǎng)使2,3-DPG活性有升高的趨勢(shì)(亞磁場(chǎng)組/地磁場(chǎng)組=108%±0.3%，強(qiáng)磁場(chǎng)組/地磁場(chǎng)組=110%±0.4%)。

2.4 不同溫度下各磁場(chǎng)強(qiáng)度短時(shí)間處理對(duì)血液的影響 如圖2A所示，在低溫環(huán)境下各磁場(chǎng)的GOT活力均顯著低于室溫下的地磁場(chǎng)組；低溫環(huán)境下亞磁場(chǎng)、超強(qiáng)磁場(chǎng)組GOT活力相較室溫下同磁場(chǎng)環(huán)境有下降趨勢(shì)；強(qiáng)磁場(chǎng)組GOT活力相對(duì)于室溫下強(qiáng)磁場(chǎng)組顯著下降(P<0.01)。如圖2B所示，低溫環(huán)境下亞磁場(chǎng)組2 h處理使GPT活力明顯低于室溫下的亞磁場(chǎng)組(P<0.05)；地磁場(chǎng)和超強(qiáng)磁場(chǎng)作用下GPT活力相對(duì)于室溫條件下相同磁場(chǎng)環(huán)境活力均有下降趨勢(shì)。如圖2C所示，低溫下各磁場(chǎng)2 h處理后SOD相對(duì)于室溫環(huán)境均沒(méi)有明顯變化。如圖2D所示，低溫下超強(qiáng)磁場(chǎng)組的2,3-DPG活力顯著低于室溫下的各磁場(chǎng)。另外，相對(duì)于室溫地磁場(chǎng)、亞磁場(chǎng)和強(qiáng)磁場(chǎng)組來(lái)說(shuō)，低溫下同磁場(chǎng)環(huán)境中血液的2,3-DPG活力出現(xiàn)了升高的趨勢(shì)。

圖2 不同磁場(chǎng)處理2 h對(duì)室溫或低溫環(huán)境下血清GOT、GPT、SOD、2,3-DPG水平的影響

3 討論

磁場(chǎng)是一種存在于我們生存環(huán)境中的一種特殊的場(chǎng)，與地球上的各種生命活動(dòng)息息相關(guān)。按照古人的觀點(diǎn)，世界的本原是精氣，《管子·內(nèi)業(yè)》中提出：“凡物之精，此則為生。下生五谷，上為列星。”指出了精氣是萬(wàn)事萬(wàn)物生機(jī)的本原，精氣彌散而運(yùn)動(dòng)。在我們的世界中，這種無(wú)形之氣與有形實(shí)體之間時(shí)刻都進(jìn)行各種形式的交換，奠定了萬(wàn)物之間的聯(lián)系性和統(tǒng)一性?！饵S帝內(nèi)經(jīng)·靈樞·歲露論》提出：“人與天地相參也，與日月相應(yīng)也?！贝艌?chǎng)作為一種自然之氣，不斷地與我們相互作用、相互影響。隨著科技的發(fā)展，磁場(chǎng)的認(rèn)識(shí)及應(yīng)用也逐漸廣泛，開(kāi)始以輔助手段應(yīng)用于疾病治療及抗氧保鮮。血液的儲(chǔ)存與檢測(cè)對(duì)于臨床及實(shí)驗(yàn)應(yīng)用意義重大，且已有研究探索了不同磁場(chǎng)條件對(duì)于血液的影響，但由于不同實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建磁場(chǎng)強(qiáng)度、檢測(cè)指標(biāo)不同且磁場(chǎng)種類有限難以對(duì)血液儲(chǔ)存檢測(cè)提供系統(tǒng)性意見(jiàn)。本文針對(duì)血液儲(chǔ)存造成的檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確和低溫保存的血液制品的“儲(chǔ)存損傷”問(wèn)題，設(shè)置不同的磁場(chǎng)梯度及溫度環(huán)境，針對(duì)GOT、GPT、SOD、2,3-DPG 4個(gè)指標(biāo)，探索短時(shí)間不同強(qiáng)度磁場(chǎng)處理對(duì)血液的影響。

GOT和GPT是科研和臨床的血液檢測(cè)中經(jīng)常出現(xiàn)的2個(gè)指標(biāo)，另外它們也是肝功能檢查時(shí)的重要指標(biāo)。SOD作為一種機(jī)體內(nèi)的抗氧化酶，具有很強(qiáng)的催化超氧陰離子自由基(O2-)發(fā)生歧化反應(yīng)的功能，在維持血液的動(dòng)態(tài)平衡中起著重要作用。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于地磁場(chǎng)來(lái)說(shuō)，低溫和磁場(chǎng)處理對(duì)血清酶活指標(biāo)GOT、GPT和SOD呈現(xiàn)不同的影響，其中，GOT變化最顯著，SOD水平則相對(duì)穩(wěn)定。在室溫環(huán)境下，超強(qiáng)磁場(chǎng)能顯著降低血清GOT的活性，亞磁場(chǎng)和強(qiáng)磁場(chǎng)使其活性呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，而在低溫條件下，相對(duì)于地磁場(chǎng)，亞磁場(chǎng)可挽回這種低溫儲(chǔ)存損傷。對(duì)于GPT而言，強(qiáng)磁場(chǎng)及超強(qiáng)磁場(chǎng)都對(duì)GPT活力有降低趨勢(shì)。此外，室溫下亞磁場(chǎng)使GPT有升高趨勢(shì)，這與Ciorba和Morariu[23]的結(jié)果不同，推測(cè)與亞磁場(chǎng)構(gòu)建方法有關(guān)，相較于前者使用的線圈補(bǔ)償法，本文使用的金屬屏蔽法對(duì)同時(shí)減弱環(huán)境中的交變磁場(chǎng)更有效。不同溫度、磁場(chǎng)處理2 h對(duì)SOD均沒(méi)有顯著影響，與先前的報(bào)道結(jié)果不同[21]，我們推測(cè)與暴露時(shí)間短有關(guān)，說(shuō)明SOD在短時(shí)間內(nèi)受環(huán)境影響較小。2,3-DPG是紅細(xì)胞糖代謝的產(chǎn)物和調(diào)節(jié)血紅蛋白對(duì)氧親和力的重要因素，也是體現(xiàn)紅細(xì)胞釋氧能力的一個(gè)重要指標(biāo)[28]。值得注意的是，低溫環(huán)境下超強(qiáng)磁場(chǎng)能夠使血清中2,3-DPG活力明顯下降。血清2,3-DPG的降低意味著紅細(xì)胞代謝功能和(或)輸氧的損傷，其效應(yīng)是否也涉及代謝和氧合相關(guān)蛋白的變化還有待進(jìn)一步驗(yàn)證[29]。

血液儲(chǔ)存與檢測(cè)對(duì)臨床醫(yī)療及實(shí)驗(yàn)檢測(cè)有重要意義，因此，需要開(kāi)發(fā)一種盡可能減少血液儲(chǔ)存損傷的輔助儲(chǔ)存方法。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，短時(shí)間亞磁場(chǎng)將保護(hù)體外血液蛋白酶活性，同時(shí)，血樣運(yùn)輸中應(yīng)避免強(qiáng)磁場(chǎng)、超強(qiáng)磁場(chǎng)對(duì)樣品的影響。本文為揭示磁場(chǎng)效應(yīng)機(jī)制以及臨床和科研中血樣的保存技術(shù)開(kāi)發(fā)提供了必要的基礎(chǔ)依據(jù)和線索，具有一定的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。

致謝：感謝中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所腦與認(rèn)知國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室赫榮喬課題組及北京磁共振成像中心為本文實(shí)驗(yàn)中提供的磁場(chǎng)條件，以及赫榮喬、卓彥研究員對(duì)本實(shí)驗(yàn)的幫助；感謝中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院汪德清教授對(duì)本文的幫助和指導(dǎo)。