布拉氏酵母菌益生性和功能性的體外評(píng)價(jià)

回 晶，白琦琦，楊 瑩，張業(yè)崎

(遼寧大學(xué) 生命科學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110036)

0 引言

益生菌是一類(lèi)定殖于動(dòng)物口腔、腸道或生殖道內(nèi)，對(duì)宿主有益的活性微生物.益生菌既有細(xì)菌類(lèi)又有真菌類(lèi)，主要分為乳桿菌類(lèi)、雙歧桿菌類(lèi)、鏈球菌類(lèi)以及酵母菌類(lèi)4種類(lèi)型.益生菌應(yīng)用十分廣泛，在人類(lèi)生活的方方面面都起著重要的作用，它既可以作為治療腹瀉的藥物和促進(jìn)腸道健康的保健食品，又可以作為畜禽飼料來(lái)提高動(dòng)物生產(chǎn)性能.近年來(lái)，人們發(fā)現(xiàn)益生菌可替代抗生素且不產(chǎn)生副作用，其中雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌目前已被廣泛使用，但它們的耐熱性和抗逆性較差，在產(chǎn)品中更難以長(zhǎng)時(shí)間存活，因此繼續(xù)尋找新的益生菌菌株以滿(mǎn)足實(shí)際的使用需要顯得尤為重要.

不同于市面上大多數(shù)的益生菌，布拉氏酵母菌(S.Boulardii)是一種真菌類(lèi)益生菌，該菌屬于釀酒酵母益生菌的亞種，具有釀酒酵母益生菌特性的同時(shí)卻比釀酒酵母益生菌具有更高的耐酸耐熱性.布拉氏酵母菌作為微生態(tài)制劑的一種，具有天然、無(wú)毒副作用、安全可靠、無(wú)殘留等多重優(yōu)點(diǎn)，可與抗生素同時(shí)使用，并能有效預(yù)防抗生素濫用導(dǎo)致的腸道菌群失調(diào)[1].雖然布拉氏酵母菌具有十分廣闊的應(yīng)用前景，但人體環(huán)境十分苛刻，布拉氏酵母菌只有在胃膽環(huán)境中具備穩(wěn)定的耐受能力，才能夠在進(jìn)入人體后順利抵達(dá)腸道并發(fā)揮其功能，可見(jiàn)深入開(kāi)展布拉氏酵母菌益生性和功能性的研究，對(duì)于其功能和安全的后續(xù)探究是不可缺少的前提.

1 材料與試劑

1.1 主要試劑

本文的主要試劑：胃蛋白酶、牛膽鹽、無(wú)菌生理鹽水、稀鹽酸、膽固醇、冰乙酸、巰基乙酸鈉、鄰苯二甲醛、氫氧化鉀、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、正己烷、鐵氰化鉀、濃硫酸、三氯化鐵(FeCl3)、鄰二氮菲、硫酸亞鐵、過(guò)氧化氫、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、鄰苯三酚.

1.2 培養(yǎng)基

本文所用培養(yǎng)基如下：酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基(YPD)，MRS培養(yǎng)基，膽鹽培養(yǎng)基和高膽固醇培養(yǎng)基.膽鹽培養(yǎng)基的制備方法：取牛膽鹽于液體培養(yǎng)基中，使膽鹽濃度(g/mL)為0.3%、0.5%，121 ℃滅菌15 min，冷卻備用；高膽固醇培養(yǎng)基的制備方法：向培養(yǎng)基中加入0.2%巰基乙酸鈉、0.3%牛膽鹽及100 μg/mL膽固醇.

1.3 儀器與設(shè)備

本文所使用的儀器為V7000D型紫外分光光度計(jì)(上海美譜達(dá)儀器有限公司)和LC-RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海力辰邦西儀器科技有限公司).

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 耐模擬胃液實(shí)驗(yàn)

本實(shí)驗(yàn)取4.5 mL現(xiàn)配現(xiàn)用的模擬胃液與0.5 mL的布拉氏酵母菌懸液混合，37 ℃培養(yǎng)6 h，在培養(yǎng)過(guò)程中，分別于0、1、3和6 h無(wú)菌取出0.1 mL混合液并作適當(dāng)稀釋?zhuān)?0 ℃培養(yǎng)48 h，采用平板計(jì)數(shù)法測(cè)定活菌數(shù)[2]，計(jì)算存活率[3-4].

(1)

2.2 耐膽鹽實(shí)驗(yàn)

本實(shí)驗(yàn)將布拉氏酵母菌懸液按3%的接種量接種于5 mL不同濃度的膽鹽培養(yǎng)基中，于37 ℃培養(yǎng)6 h，在培養(yǎng)過(guò)程中，分別于0、3和6 h無(wú)菌取出培養(yǎng)液并作適當(dāng)稀釋?zhuān)?0 ℃培養(yǎng)48 h，測(cè)定活菌數(shù)[2]，計(jì)算存活率[5].

(2)

2.3 體外降膽固醇能力

本實(shí)驗(yàn)以膽固醇濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)，OD550為縱坐標(biāo)，繪制膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線[6-7].通過(guò)鄰苯二甲醛(OPA)法進(jìn)行測(cè)定[8]膽固醇去除率，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣本中膽固醇含量.

(3)

式中：C0為未接種培養(yǎng)液離心上清液中膽固醇實(shí)測(cè)質(zhì)量濃度，μg/mL；C為接種后發(fā)酵液離心上清液中膽固醇實(shí)測(cè)質(zhì)量濃度，μg/mL.

比特幣是最具有代表性的密碼貨幣之一，后續(xù)的密碼貨幣在一定的程度上是延續(xù)比特幣的技術(shù)原理。當(dāng)然后續(xù)的密碼貨幣在共識(shí)機(jī)制、交易匿名性以及數(shù)據(jù)隱私保護(hù)方面都取得了較大突破。例如：以太坊[1]利用權(quán)益證明（PoS）機(jī)制，大幅度縮減挖礦開(kāi)銷(xiāo)的計(jì)算資源；門(mén)羅幣利用可鏈接環(huán)簽名技術(shù)[2]，為發(fā)送者提供匿名保護(hù)，同時(shí)可以檢測(cè)雙重支付；零幣[3]采用非交互零知識(shí)證明機(jī)制[4]進(jìn)一步提高了匿名性，實(shí)現(xiàn)了發(fā)送者和接收者匿名以及數(shù)據(jù)隱私，但是計(jì)算和存儲(chǔ)開(kāi)銷(xiāo)增大。本節(jié)主要介紹比特幣的生成背景和研究意義。

2.4 布拉氏酵母菌的抗氧化能力

2.4.1 DPPH·清除率

本文參考Kandi[9]的方法，采用分光光度法[10-11]，將0.2 mmol/L DPPH 乙醇溶液與待測(cè)菌懸液按1∶1體積比混合，振蕩，室溫下暗反應(yīng)30 min后，3 500 r/min離心10 min，收集上清液，于517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定上清液的吸光值，并以乙醇溶液調(diào)零，清除率按下式計(jì)算：

(4)

式中：Ai為1 mL待測(cè)菌懸液加1mL DPPH乙醇溶液的吸光值；Aj為1 mL待測(cè)菌懸液加1 mL無(wú)水乙醇的吸光值；Ac為1 mL磷酸鹽緩沖液(PBS)加1 mL DPPH乙醇溶液的吸光值.

2.4.2 ·OH清除率

本文參考畢秋蕓[12]的方法并略作改動(dòng)[13]，測(cè)定羥自由基清除率.清除率按下式計(jì)算：

(5)

式中：Am為含有樣品和H2O2的吸光值；An為不含樣品但含H2O2的吸光值；A0為不含樣品和H2O2的吸光值.

2.4.3 總還原力

本文參考林祥娜等[13]、黃麗等[14]的鐵氰化鉀法，向15 mL離心管中加入0.5 mL待測(cè)菌懸液，0.5 mL 1%鐵氰化鉀，0.5 mL 0.2 mol/L pH 6.8 PBS，充分混勻后，50 ℃保溫20 min；迅速冷卻后，加入0.5 mL 10% 三氯乙酸(TCA)，沉淀蛋白后，3 500 r/min離心10 min并收集上清液.取1 mL上清液，加入1 mL 0.1%的FeCl3溶液，于700 nm處測(cè)定吸光值，以抗壞血酸為標(biāo)準(zhǔn)品，測(cè)定總還原力.

本文參考何美書(shū)[15]的方法并略作改動(dòng)[16]，測(cè)定超氧陰離子自由基清除率.清除率按下式計(jì)算：

(6)

式中：A11為含樣品和鄰苯三酚的吸光值；A10為含樣品但不含鄰苯三酚的吸光值；A01為不含樣品但含鄰苯三酚的吸光值；A00為不含樣品和鄰苯三酚的吸光值.

3 結(jié)果與討論

3.1 耐模擬胃液實(shí)驗(yàn)

益生菌在抵達(dá)腸道環(huán)境之前，需要以活菌的形式通過(guò)胃部酸性環(huán)境，因此，益生菌在酸性胃液里仍需要有較高的存活率是發(fā)揮其功能的前提之一[17-18].在正常pH值下(見(jiàn)表1)，布拉氏酵母菌的存活率不低于100%，模擬胃液pH=4時(shí)(見(jiàn)表2)，布拉氏酵母菌幾乎不受影響，能夠很好存活.模擬胃液pH=3時(shí)(見(jiàn)表3)，隨著時(shí)間的增加存活率略有降低，6 h后的存活率仍高達(dá)96.27%，優(yōu)于對(duì)照組鼠李糖乳桿菌(LGG).因此可知，在模擬胃液實(shí)驗(yàn)中，布拉氏酵母菌的存活情況良好，能夠耐受胃液環(huán)境.

表1 布拉氏酵母菌對(duì)空白模擬胃液的耐受能力

表2 布拉氏酵母菌對(duì)pH=4模擬胃液的耐受能力

表3 布拉氏酵母菌對(duì)pH=3模擬胃液的耐受能力

3.2 耐膽鹽實(shí)驗(yàn)

正常情況下，人體腸道中膽鹽濃度變化范圍是0.03%～0.3%，益生菌只有能夠抵抗膽鹽的拮抗作用才有可能在腸道中定殖發(fā)揮益生作用[19-20].所設(shè)置的不加膽鹽空白對(duì)照組環(huán)境下(見(jiàn)表4)，布拉氏酵母菌在6 h后存活率維持在100%左右.布拉氏酵母菌在0.3%濃度膽鹽環(huán)境下(見(jiàn)表5)，布拉氏酵母菌生存受到影響，3 h存活率為89.98%，6 h存活率為78.15%，對(duì)照菌鼠李糖乳桿菌在作用了6 h后存活率為83.69%，與布拉氏酵母菌存活率相近.在0.5%濃度膽鹽環(huán)境下(見(jiàn)表6)，布拉氏酵母菌在經(jīng)過(guò)3 h的膽鹽反應(yīng)后，其活菌數(shù)量下降，存活率為78.55%，低于同等時(shí)長(zhǎng)0.3%濃度膽鹽實(shí)驗(yàn)，在0.5%濃度膽鹽作用6 h時(shí)，已檢測(cè)不到活菌.由此可知，布拉氏酵母菌對(duì)于0.3%濃度膽鹽環(huán)境具有良好耐受能力，但對(duì)于0.5%的膽鹽環(huán)境不具有耐受能力.

表4 布拉氏酵母菌對(duì)空白膽鹽的耐受能力

表5 布拉氏酵母菌對(duì)0.3%濃度膽鹽的耐受能力

表6 布拉氏酵母菌對(duì)0.5%濃度膽鹽的耐受能力

3.3 布拉氏酵母菌對(duì)膽固醇的降解能力

在硫酸存在的條件下，由于膽固醇及其酯與鄰苯二甲醛作用會(huì)產(chǎn)生紫紅色的物質(zhì)，該物質(zhì)在550 nm有最大吸收值，因此可以用比色法測(cè)定膽固醇含量[21].由圖1可知，布拉氏酵母菌的膽固醇清除率為25.05%，清除量為16.37 μg/mL，與對(duì)照的鼠李糖乳桿菌相比，布拉氏酵母菌的體外膽固醇清除率略低于鼠李糖乳桿菌，具有較好的膽固醇降解能力.

圖1 布拉氏酵母菌對(duì)膽固醇的降解能力

3.4 布拉氏酵母菌的抗氧化能力

3.4.1 DPPH·清除能力

DPPH·是一種相對(duì)比較穩(wěn)定的自由基，當(dāng)DPPH溶液中加入抗氧化劑時(shí)DPPH·吸收能力將會(huì)減弱，DPPH·的清除能力經(jīng)常用于評(píng)價(jià)物質(zhì)抗氧化的能力[22-23].由圖2(a)可以看出，布拉氏酵母菌在106～108CFU/mL均具有清除DPPH·的能力，且隨著菌體濃度的增大，清除能力隨之增強(qiáng).與對(duì)照組相比，布拉氏酵母菌對(duì)DPPH·的清除能力比鼠李糖乳桿菌略低，但差異不大，仍有較好的清除DPPH·的能力.

3.4.2 ·OH清除能力

鄰二氮菲-Fe2+是一種氧化還原指示劑，它的顏色改變可反映溶液中氧化還原狀態(tài)的變化.通過(guò)Feton反應(yīng)體系，產(chǎn)生的·OH可使鄰二氮菲水溶液氧化成鄰二氮菲-Fe3+，通過(guò)測(cè)定536 nm處的吸光值變化反映系統(tǒng)中·OH的變化[24].由圖2(b)可以看出，布拉氏酵母菌菌體濃度為106CFU/mL時(shí)，·OH的清除能力較弱，但當(dāng)菌體濃度達(dá)到108CFU/mL時(shí)可達(dá)到41.26%，略低于鼠李糖乳桿菌，但差異不顯著，具有較好的·OH清除能力.

3.4.3 總還原力

鐵氰化鉀在弱酸性的環(huán)境下能夠還原生成黃血鹽[K4Fe(CN)6]，之后再與FeCl3提供的Fe3+作用生成普魯士藍(lán).還原能力的強(qiáng)弱常以普魯士藍(lán)的生成量為指標(biāo)，通過(guò)測(cè)定其在700 nm處的吸光值(A700)的大小來(lái)判定物質(zhì)的還原能力強(qiáng)弱[25].A700越大，其還原能力越大，還原能力是通過(guò)轉(zhuǎn)化為抗壞血酸的量來(lái)表示的.結(jié)果如圖2(c)所示，不同菌體濃度的總還原能力差異顯著.隨著菌體濃度增加，布拉氏酵母菌的還原能力比鼠李糖乳桿菌略強(qiáng)，當(dāng)菌體濃度達(dá)到108CFU/mL時(shí)，布拉氏酵母菌轉(zhuǎn)化為抗壞血酸的濃度高達(dá)25.79 μmol/L.由此可知，布拉氏酵母菌具有較強(qiáng)的還原能力.

圖2 布拉氏酵母菌的抗氧化能力(不同小寫(xiě)字母代表布拉氏酵母菌菌體濃度對(duì)清除能力差異顯著性；不同大寫(xiě)字母代表鼠李糖乳桿菌菌體濃度對(duì)清除能力差異顯著性)