基于Illumina MiSeq高通量測序分析清香型白酒酒糟微生物群落多樣性

羅愛國，郗鑫瑞，鄭同慶，楊兆艷，田艷花，馬曉麗，趙紅梅

（1.晉中學院 生物科學與技術系，山西 晉中 030619；2.山西省堡子酒業(yè)有限公司，山西 晉中 030600；3.山西藥科職業(yè)學院 食品工程系，山西 太原 030031）

中國白酒釀造具有悠久歷史，山西主產(chǎn)清香型白酒，其白酒產(chǎn)業(yè)已成為山西省釀造業(yè)的支柱產(chǎn)業(yè)[1-2]。據(jù)釀造產(chǎn)業(yè)協(xié)會報道，僅山西年產(chǎn)白酒近700萬t，按生產(chǎn)1 t的白酒產(chǎn)生3倍質(zhì)量的酒糟[3]，副產(chǎn)物酒糟達2 000萬t以上。酒糟中含有蛋白質(zhì)、氨基酸、脂肪、纖維素、鈣、磷、維生素等營養(yǎng)物質(zhì)[4]，其中粗蛋白17.15%、粗纖維素37.91%、淀粉12.35%[5-7]。過去利用酒糟主要作為動物飼料輔料[8-10]，利用價值較低，隨著節(jié)約型、生態(tài)型經(jīng)濟發(fā)展，副產(chǎn)物酒糟高值化利用已迫在眉睫[11-12]。

目前，國內(nèi)外對酒糟的研究多集中在探討酒糟生產(chǎn)蛋白飼料的微生物發(fā)酵工藝方面[13-16]，如白酒酒糟培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分的組成及配比研究、發(fā)酵菌種及菌種組合篩選研究等，而對白酒酒糟本身的微生物菌群結構分析研究甚少。Illumina MiSeq高通量測序技術分析微生物多樣性具有速度快、通量高、更具全面性的優(yōu)勢[17-20]，已被廣泛應用于土壤、水體及食品等微生物菌群多樣性研究[21-22]。黎江華等[23]采用高通量測序技術分析五倍子發(fā)酵用酒曲與酒糟微生物多樣性發(fā)現(xiàn)，濃香型白酒酒糟中共檢測出56個細菌屬和28個真菌屬；袁帥[24]以醬香型白酒酒糟為研究對象，檢測出酒糟樣本中細菌主要分屬11個門。但是目前針對清香型白酒酒糟中微生物菌群結構解析的研究鮮見報道。

因此，本研究通過Illumina MiSeq高通量測序技術對清香型白酒酒糟中微生物菌群結構進行解析，以期為后續(xù)建立清香型白酒酒糟的微生物體系指標以及進一步優(yōu)化其生產(chǎn)蛋白飼料等奠定基礎，為目前廣泛應用于白酒酒糟轉(zhuǎn)化利用方面的微生物發(fā)酵技術提供理論和技術依據(jù)，為深入了解清香型白酒發(fā)酵過程中的微生物菌群結構奠定基礎，對促進清香型白酒產(chǎn)業(yè)循環(huán)經(jīng)濟的發(fā)展具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

清香型堡子酒酒糟：山西堡子酒業(yè)有限公司；Qubit3.0脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）檢測試劑盒：美國Life公司；E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit：美國OMEGA公司聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）MasterMix、HieffNGSTMDNASelectionBeads：翌圣生物科技（上海）股份有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

ETC 811 PCR儀：北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司；熒光計：美國英杰生命技術有限公司；DYY-6C型電泳儀：北京市六一儀器廠；FR-1000凝膠成像系統(tǒng)：上海復日科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品預處理

取清香型堡子酒酒糟堆（堆積2～3 d）上部、中部、下部新鮮酒糟并混合，參考沈才萍等[25]的方法用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）對酒糟樣品進行預處理。

1.3.2 基因組DNA提取

采用E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit提取酒糟中微生物的基因組DNA。

1.3.3 PCR擴增

以基因組DNA為模板，采用引物341F（5'-CCTACGGGNGGCWGCAG-3'）/805R（5'-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3'）和ITS1F（5'CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'）/ITS2R（5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'）分別對細菌16S rDNA V3-V4區(qū)和真菌ITS1-ITS2區(qū)基因序列進行兩輪PCR擴增[26]。

1.3.4 Illumina MiSeq高通量測序

PCR擴增結束后，用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測文庫，使用Qubit 3.0熒光定量儀進行文庫濃度測定，然后將PCR擴增產(chǎn)物委托生工生物工程（上海）股份有限公司進行Illumina MiSeq高通量測序。

1.3.5 Illumina MiSeq高通量測序數(shù)據(jù)處理

高通量測序得到的原始序列是雙端序列數(shù)據(jù)，且序列中含有起始加入的引物和接頭序列以及barcode標簽序列。使用cutadapt軟件、PEAR軟件、PRINSEQ軟件等處理數(shù)據(jù)。首先需要對引物的接頭序列進行去除，然后根據(jù)雙端序列之間的相互重復關系，將所有成對的單個序列拼接成一條序列，再根據(jù)barcode標簽序列區(qū)分酒糟樣品中真菌及細菌的各序列數(shù)據(jù)，之后對各序列數(shù)據(jù)進行質(zhì)量控制，最后得到各序列的有效數(shù)據(jù)。

1.3.6 Illumina MiSeq高通量測序數(shù)據(jù)分析

運用Usearch軟件對非重復序列進行操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）聚類分析，并對應相應的數(shù)據(jù)庫進行分類學分析。對聚類分析結果進行Alpha多樣性分析，使用R軟件繪制清香型堡子酒酒糟中微生物的稀釋性曲線、Rank abundance曲線、香農(nóng)指數(shù)曲線等。

2 結果與分析

2.1 Illumina Miseq高通量測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計結果與質(zhì)量分析

采用Illumina Miseq高通量測序平臺得到的清香型堡子酒酒糟樣本原始序列與其堿基長度見表1。

表1 酒糟樣本的高通量測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計結果Table 1 Statistics results of high-throughput sequence data of distiller's grains samples

由表1可知，清香型堡子酒酒糟樣品中得到的細菌原始序列數(shù)為58 470條，平均序列堿基長度為453.97 bp；經(jīng)拼接、質(zhì)控過濾后，細菌有效序列數(shù)為58 015條，平均序列堿基長度為417.38 bp。酒糟樣品中得到的真菌原始序列數(shù)為36 502條，平均序列堿基長度為327.13 bp；經(jīng)拼接、質(zhì)控過濾后，真菌有效序列數(shù)為36 459條，平均序列堿基長度為284.83 bp。細菌與真菌的有效序列占比均達到99%以上，這表明本次高通量測序得到的有效序列可以滿足后續(xù)對清香型堡子酒酒糟樣品中微生物菌群結構的研究。

隨機抽取一定數(shù)量的序列，與他們所代表的物種數(shù)目構建稀釋性曲線，結果見圖1。

圖1 酒糟樣品中細菌菌群（a）及真菌菌群（b）的稀釋性曲線Fig.1 Rarefaction curves of bacteria flora (a) and fungi flora (b) in distiller's grains samples

由圖1 可知，當測序序列數(shù)＞20 000時，曲線趨向平坦，說明即使增加測序數(shù)據(jù)，OTU數(shù)也不會再增加，說明本次的測序量合理，能夠覆蓋酒糟樣本中的絕大部分物種，數(shù)據(jù)量合理且足夠。

Rank-abundance曲線是分析多樣性的一種方式，用于反應樣品多樣性的兩個方面，即樣品所含物種的豐富程度和均勻程度[27]。酒糟樣品中細菌菌群及真菌菌群的Rankabundance曲線見圖2。由圖2可知，酒糟樣品中細菌和真菌菌群的豐富程度和均勻程度存在差異，其中細菌菌群的Rank-abundance曲線相對于真菌菌群較平緩，水平跨度較大，所以細菌菌群的物種組成較豐富，均勻程度較高；真菌菌群的Rank-abundance曲線陡峭，水平跨度小，微生物豐度較低，某一類或幾類微生物占了大部分比例，具有數(shù)量優(yōu)勢。

圖2 酒糟樣品中細菌（a）及真菌（b）的Rank-abundance曲線Fig.2 Rank-abundance curves of bacteria (a) and fungi (b) in distiller's grains samples

2.2 酒糟樣品微生物菌群的Alpha多樣性分析

Alpha多樣性反映微生物群落的豐富度和多樣性[24]，酒糟樣品微生物菌群的α多樣性分析結果見表2。由表2可知，細菌菌群的超1（Chao1）指數(shù)、Ace指數(shù)均大于真菌菌群，說明酒糟樣本內(nèi)，細菌菌群的物種豐富度遠高于真菌菌群[28]。酒糟樣品中細菌菌群的香農(nóng)（Shannon）指數(shù)略大于真菌菌群，而細菌菌群的辛普森（Simpson）指數(shù)小于真菌菌群，從而表明清香型堡子酒酒糟中的細菌菌群多樣性略大于真菌菌群多樣性。另外，兩者的Coverage指數(shù)都接近1，說明對清香型堡子酒酒糟樣品文庫的覆蓋率很高[29]，進一步表明本實驗測序結果能很真實有效地反映清香型堡子酒酒糟的微生物多樣性，本研究有一定研究意義和研究價值。

表2 酒糟樣品中微生物群落的α-多樣性分析結果Table 2 Alpha diversity analysis results of microbial community in distiller's grains samples

2.3 酒糟樣品OTU物種統(tǒng)計

對酒糟樣品微生物在各分類水平上的菌群結構進行分析，結果見表3。由表3可知，清香型堡子酒酒糟樣品中的細菌菌群分布在10個門、18個綱、31個目、66個科、86個屬、124種上；真菌菌群分布在5個門、11個綱、20個目、33個科、49個屬、66個種上。細菌菌群在各分類水平的數(shù)量分布均高于真菌菌群，進一步說明清香型堡子酒酒糟中細菌菌群的多樣性高于真菌菌群。另外，未測出酒糟樣品中細菌菌群在種水平上的分類，分析原因可能是因為16S rDNA有很高的保守性，對親緣關系較近的物種種屬不容易分辨[30]。

表3 酒糟樣品中微生物在各分類水平上的菌群結構Table 3 Community structure of microbe in distiller's grains at different classification levels

2.4 酒糟樣品中微生物菌群結構分析

2.4.1 基于門水平酒糟樣品中細菌菌群結構分析

基于門水平清香型堡子酒酒糟樣品中的細菌菌群結構見圖3。由圖3可知，清香型堡子酒酒糟樣品中有4個優(yōu)勢細菌門（相對豐度≥1%），分別為變形菌門（Proteobacteria）（66.51%）、放線菌門（Actinobacteria）（26.21%）、厚壁菌門（Firmicutes）（4.40%）、擬桿菌門（Bacteroidetes）（1.67%）。

圖3 基于門水平酒糟樣品中的細菌菌群結構分析結果Fig.3 Bacterial community structure analysis results of distiller's grain samples based on phylum level

2.4.2 基于門水平酒糟樣品中真菌菌群結構分析

基于門水平清香型堡子酒酒糟樣品中的真菌菌群結構見圖4。由圖4可知，清香型堡子酒酒糟樣品中有3個優(yōu)勢真菌門，分別為子囊菌門（Ascomycota）（85.04%）、毛霉門（Mucoromycota）（11.45%）及擔子菌門（Basidiomycota）（2.77%），其中子囊菌門（Ascomycota）具有絕對優(yōu)勢。

圖4 基于門水平酒糟樣品中的真菌菌群結構分析結果Fig.4 Fungal community structure analysis results of distiller's grain samples based on phylum level

綜上，在門水平上，清香型堡子酒酒糟中細菌菌群較真菌菌群更為豐富，細菌群落中各菌門的相對豐度差異較小，真菌群落中相對豐度差異較大，主要集中在子囊菌門內(nèi)。

2.4.3 基于屬水平酒糟樣品中細菌菌群結構分析

基于屬水平清香型堡子酒酒糟樣品中的細菌菌群結構見圖5。由圖5可知，清香型堡子酒酒糟樣品中有12個優(yōu)勢細菌屬，分別為根瘤菌屬（Rhizobium）（20.43%）、拉烏爾菌屬（Raoultella）（18.96%）、谷氨酸桿菌屬（Glutamicibacter）（15.00%）、紅球菌屬（Rhodococcus）（9.07%）、短波單胞菌屬（Brevundimonas）（4.42%）、不動桿菌屬（Acinetobacter）（2.52%）、假單孢菌屬（Pseudomonas）（2.44%）、嗜冷桿菌屬（Psychrobacter）（1.58%）、Devosia（1.57%）、嗜鹽單胞菌屬（Halomonas）（1.19%）、未分類-鼠桿菌屬（unclassified-Murib-aculaceae）（1.15%）、乳桿菌屬（Lactobacillus）（1.14%）。

圖5 基于屬水平酒糟樣品中的細菌菌群結構分析結果Fig.5 Bacterial community structure analysis results of distiller's grain samples based on genera level

2.4.4 基于屬水平酒糟樣品中真菌菌群結構分析

基于屬水平清香型堡子酒酒糟樣品中的真菌菌群結構見圖6。由圖6可知，清香型堡子酒酒糟樣品中有6個優(yōu)勢真菌屬，分別為孢圓酵母屬（Torulaspora）（62.59%）、伊薩酵母屬（Issatchenkia）（12.79%）、橫梗霉屬（Lichtheimia）（7.08%）、根霉屬（Rhizopus）（4.29%）、曲霉屬（Aspergillus）（4.06%）、酵母屬（Saccharomyces）（3.78%）。

圖6 基于屬水平酒糟樣品中的真菌菌群結構分析結果Fig.6 Fungal community structure analysis results of distiller's grain samples based on genera level

黎江華等[23]對濃香型酒糟微生物多樣性進行了研究，檢測出濃香型白酒糟菌群優(yōu)勢菌屬主要包括魏斯氏菌屬（Weissella）（11%）、未定義藍細菌（unidentifiedCyanobacteria）（8%）等17個，而優(yōu)勢真菌屬主要包括絲孢酵母屬（Trichosporon）（34%）、伊薩酵母屬（Issatchenkia）（9%）等11個，與本文中檢測的細菌屬、真菌屬在豐度以及屬別上有較大差異，這可能與兩種酒型在發(fā)酵用曲、釀造工藝等不同有關。

3 結論

本研究采用Illumina MiSeq高通量測序技術對清香型堡子酒酒糟微生物菌群多樣性進行分析，得出酒糟中的細菌豐富度和多樣性均高于真菌，細菌菌群歸屬于10個門、18個綱、31個目、66個科、86個屬、124個種，真菌菌群歸屬于5個門、11個綱、20個目、33個科、49個屬、66個種。優(yōu)勢細菌門（相對豐度≥1.0%）為變形菌門（Proteobacteria）（66.51%）、放線菌門（Actinobacteria）（26.21%）、厚壁菌門（Firmicutes）（4.40%）、擬桿菌門（Bacteroidetes）（1.67%），優(yōu)勢細菌屬為根瘤菌屬（Rhizobium）（20.43%）、拉烏爾菌屬（Raoultella）（18.96%）、谷氨酸桿菌屬（Glutamicibacter）（15.00%）、紅球菌屬（Rhodococcus）（9.07%）、短波單胞菌屬（Brevundimonas）（4.42%）、不動桿菌屬（Acinetobacter）（2.52%）、假單孢菌屬（Pseudomonas）（2.44%）、嗜冷桿菌屬（Psychrobacter）（1.58%）、Devosia（1.57%）、嗜鹽單胞菌屬（Halomonas）（1.19%）、未分類-鼠桿菌屬（unclassified-Muribaculaceae）（1.15%）、乳桿菌屬（Lactobacillus）（1.14%）；優(yōu)勢真菌門為子囊菌門（Ascomycota）（85.04%）、毛霉門（Mucoromycota）（11.45%）及擔子菌門（Basidiomycota）（2.77%），優(yōu)勢真菌屬為孢圓酵母屬（Torulaspora）（62.59%）、伊薩酵母屬（Issatchenkia）（12.79%）、橫梗霉屬（Lichtheimia）（7.08%）、根霉屬（Rhizopus）（4.29%）、曲霉屬（Aspergillus）（4.06%）、酵母屬（Saccharomyces）（3.78%）。本研究為繼續(xù)深入研究酒糟的發(fā)酵轉(zhuǎn)化肥料及為動物飼料開發(fā)等提供了理論參考，同時，也為白酒釀造過程中菌群結構變化規(guī)律解析提供了理論依據(jù)。