枯草芽孢桿菌發(fā)酵豆渣制備多肽及其活性研究

尹樂斌，李樂樂，何 平，劉椏麗，楊學(xué)為，羅雪韻

（1.邵陽學(xué)院 食品與化學(xué)工程學(xué)院，湖南 邵陽 422000；2.豆制品加工與安全控制湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 邵陽 422000）

豆渣是豆制品加工中常見的副產(chǎn)物之一，富含大豆異黃酮、膳食纖維、低聚糖、有機(jī)酸等營養(yǎng)物質(zhì)[2-5]，常被用作動物飼料或廢棄物丟掉[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國每年會產(chǎn)生約200萬t濕豆渣，新鮮豆渣豆腥味重且容易腐敗變質(zhì)，處理成本較高[6-7]。大豆多肽是由大豆蛋白經(jīng)過酶解或發(fā)酵形成的肽基蛋白水解物，其具有抗氧化、抗疲勞、降血壓、降膽固醇等生物活性[8-13]。

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）作為一種益生菌，生長速度快，安全性較高，可分泌蛋白酶、淀粉酶等豐富的酶系[14-15]，常用于食品和動物飼料工業(yè)生產(chǎn)中?？莶菅挎邨U菌生長過程中會產(chǎn)生部分有顯著的抑菌活性的次級代謝產(chǎn)物（如脂肽類、抗菌蛋白等）[16-17]，曾國洪等[18]研究對枯草芽孢桿菌HS-A38進(jìn)行誘變篩選出高產(chǎn)抗菌脂肽菌株，并得到抗菌脂肽，其具有較好耐酸堿和熱穩(wěn)定性。

以經(jīng)纖維素酶酶解后的豆渣為原料，利用枯草芽孢桿菌液態(tài)發(fā)酵豆渣制備大豆多肽，通過單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面法優(yōu)化大豆多肽制備工藝，并測定其對1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）和2,2-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2'-azino-bis（3-ethylbenzoth iazoline-6-sulfonic acid），ABTS）自由基清除能力與抑制金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和大腸桿菌（Escherichia coli）生長的性能。以期為豆渣高值化利用和活性多肽產(chǎn)品的研究提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料與菌株

豆渣：豆制品加工與安全控制湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）：北海群林生物工程有限公司；金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大腸桿菌（Escherichia coli）：實(shí)驗(yàn)室保存菌種。

1.1.2 試劑

三氯乙酸（分析純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；胰蛋白胨（生化試劑）：北京陸橋技術(shù)股份有限公司；NaCl（分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；牛血清蛋白（生化試劑）：北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司；ABTS（分析純）：合肥巴斯夫生物科技有限公司；DPPH（分析純）：上海如吉生物科技有限公司；維生素C（vitamin C，VC）（分析純）：西隴科學(xué)股份有限公司；纖維素酶（8 000 U/g）：山東和眾康源生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SCIENTZ-10N冷凍干燥機(jī)：寧波新芝生物科技股份有限公司；VELOCITY 14R臺式冷凍離心機(jī)：美國Dynamica公司；IS-RDD3 恒溫?fù)u床：蘇州捷美電子有限公司；D-7型紫外分光光度計(jì)：南京菲勒儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化與培養(yǎng)

枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌及大腸桿菌的活化培養(yǎng)參考文獻(xiàn)[19-20]。

1.3.2 大豆多肽的制備

收集新鮮豆渣并利用精細(xì)磨濕法粉碎，調(diào)整豆渣干基為5.8%，纖維素酶水解（8 000 U/g，50 ℃水解6 h）豆渣得到豆渣酶解液，80 ℃滅酶10 min（調(diào)整pH 7.2）。將酶解液接種枯草芽孢桿菌液態(tài)發(fā)酵（接種量3%、發(fā)酵溫度37 ℃，發(fā)酵時(shí)間60 h）。發(fā)酵液10 000 r/min冷凍離心15 min后取上清液，經(jīng)冷凍干燥即得大豆多肽粗提物。多肽得率參考文獻(xiàn)[21]。

1.3.3 發(fā)酵豆渣制備大豆多肽工藝優(yōu)化

單因素試驗(yàn)：以50 mL豆渣酶解液為原料接種枯草芽孢桿菌進(jìn)行發(fā)酵，探究接種量（1%、3%、5%、7%、9%）、發(fā)酵時(shí)間（24 h、36 h、48 h、60 h、72 h）、發(fā)酵溫度（23 ℃、30 ℃、37℃、44℃、51℃）、搖床轉(zhuǎn)速（120r/min、130r/min、140r/min、150 r/min、160 r/min）對大豆多肽得率的影響。

響應(yīng)面試驗(yàn)：在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以大豆多肽得率（Y）為響應(yīng)值，選擇對多肽得率影響較大的接種量（A）、發(fā)酵溫度（B）、發(fā)酵時(shí)間（C）進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，確定最佳的發(fā)酵豆渣制備大豆多肽工藝，因素與水平見表1。

表1 發(fā)酵豆渣制備大豆多肽工藝優(yōu)化因素與水平Table 1 Factors and levels for soybean polypeptide preparation process optimization of fermented soybean dregs

1.3.4 多肽的抗氧化性

在最佳發(fā)酵工藝下條件發(fā)酵豆渣，冷凍干燥得到大豆多肽。以VC為陽性對照，通過ABTS溶液和DPPH溶液[22]測定大豆多肽粗提物的抗氧化活性。

1.3.5 多肽的抑菌活性

利用平板計(jì)數(shù)法將兩個(gè)指示菌（金黃色葡萄球菌、大腸桿菌）制備成107CFU/mL菌懸液，利用牛津杯法測抑菌圈直徑大小[23]。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用SPSS22.0、Design-Expert8.0.6.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵豆渣制備大豆多肽工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 接種量的確定

由圖1可知，隨著接種量在1%～3%范圍內(nèi)的增加，大豆多肽的得率呈增加趨勢。當(dāng)接種量為3%，大豆多肽的得率達(dá)到最高，為84.79%，繼續(xù)增加接種量至9%，大豆多肽的得率開始下降。其原因可能是，起初接種量較低，產(chǎn)生的蛋白酶量少，不足以分解豆渣中的蛋白質(zhì)，故而使得多肽得率較低。隨著接種量增加，產(chǎn)生的蛋白酶量較充足，多肽得率逐漸提高。接種量過高，而發(fā)酵體系中營養(yǎng)物質(zhì)有限，會抑制菌體生長，進(jìn)而降低其產(chǎn)酶能力[24]，導(dǎo)致多肽得率下降。因此，選擇最佳的菌種接種量為3%。

圖1 接種量對多肽得率的影響Fig.1 Effect of inoculum on polypeptide yield

2.1.2 發(fā)酵時(shí)間的確定

由圖2可知，隨著發(fā)酵時(shí)間在24～60 h范圍內(nèi)的增加，大豆多肽得率呈增加趨勢。當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為60 h時(shí)，大豆多肽得率達(dá)到85.02%。當(dāng)發(fā)酵時(shí)間＞60 h，大豆多肽得率下降。其原因可能是，發(fā)酵初期菌種處于適應(yīng)期，菌種生長緩慢，產(chǎn)酶量不足，多肽得率處在較低水平，隨著發(fā)酵時(shí)間延長，菌種生長逐漸平穩(wěn)，產(chǎn)酶量飽和，蛋白酶水解豆渣大分子蛋白形成多肽[25]。然而繼續(xù)延長發(fā)酵時(shí)間，體系中代謝廢物較多，導(dǎo)致溶氧量不足而影響酶的合成。同時(shí)，蛋白酶會過度水解導(dǎo)致多肽得率降低，這與李景等[26]的研究結(jié)果相似。因此，選擇最佳發(fā)酵時(shí)間為60 h。

圖2 發(fā)酵時(shí)間對多肽得率的影響Fig.2 Effect of fermentation time on polypeptide yield

2.1.3 發(fā)酵溫度對多肽得率的影響

由圖3可知，隨著發(fā)酵溫度在23～37 ℃范圍內(nèi)的升高，大豆多肽的得率呈增加趨勢。當(dāng)發(fā)酵溫度為37 ℃時(shí)，大豆多肽的得率達(dá)到最高值，為86.22%。發(fā)酵溫度高于37 ℃時(shí)，大豆多肽的得率下降。其原因可能是，溫度較低時(shí)，枯草芽孢桿菌處于遲緩期的時(shí)間延長，菌種生長緩慢，產(chǎn)酶不足使得多肽得率較低，隨著發(fā)酵溫度升高，菌種生長加速，產(chǎn)生大量蛋白酶，多肽得率也隨之提高，而過高的溫度會抑制菌體生長，從而導(dǎo)致多肽得率下降，由此看出枯草芽孢桿菌生長需要適宜的溫度。因此，選擇最佳發(fā)酵溫度為37 ℃。

圖3 發(fā)酵溫度對多肽得率的影響Fig.3 Effect of fermentation temperature on polypeptide yield

2.1.4 搖床轉(zhuǎn)速對多肽得率的影響

由圖4可知，隨著搖床轉(zhuǎn)速在120～150 r/min范圍內(nèi)的增加，大豆多肽得率呈增加趨勢。當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速為150 r/min時(shí)，大豆多肽得率達(dá)到85.75%。搖床轉(zhuǎn)速＞150 r/min時(shí)，大豆多肽得率下降。其原因可能是，枯草芽孢桿菌是一種好養(yǎng)型細(xì)菌，當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速過低時(shí)，發(fā)酵體系中溶氧量不足，致使菌種生長緩慢[26]，產(chǎn)酶量低，不足以分解豆渣中的蛋白質(zhì)，使得多肽得率較低，而搖床轉(zhuǎn)速過快時(shí)，其產(chǎn)生的高剪切力會破壞菌體細(xì)胞，抑制了菌體生長，進(jìn)而導(dǎo)致多肽得率下降。因此，選擇最佳搖床轉(zhuǎn)速為150 r/min。

圖4 搖床轉(zhuǎn)速對多肽得率的影響Fig.4 Effect of shaking speed on polypeptide yield

2.2 大豆多肽制備工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以多肽得率（Y）為響應(yīng)值，選擇對多肽得率影響較大的菌種接種量（A）、發(fā)酵溫度（B）發(fā)酵時(shí)間（C）進(jìn)行3因素3水平的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。

表2 大豆多肽制備工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of response surface tests for soybean polypeptide preparation process optimization

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

利用Design-Expert V 8.0.6.1軟件對大豆多肽得率進(jìn)行回歸擬合后，得到大豆多肽的二次多項(xiàng)回歸方程為：

對模型進(jìn)行顯著性分析，由表3可知，模型P=0.000 9＜0.01，模型極顯著；失擬項(xiàng)P=0.124 7＞0.05，失擬不顯著；決定系數(shù)R2=0.949 6，說明此模型擬合度較好，校正決定系數(shù)R2adj=0.884 8，可用該模型來預(yù)測發(fā)酵體系中多肽得率的實(shí)際情況。一次項(xiàng)C對大豆多肽得率的影響顯著（P＜0.05），二次項(xiàng)A2、B2、C2均對大豆多肽得率的影響極顯著（P＜0.01），其他項(xiàng)對結(jié)果影響不顯著（P＞0.05）。由F值得出影響多肽得率的3個(gè)因素的主次順序?yàn)榘l(fā)酵時(shí)間＞發(fā)酵溫度＞接種量。

2.2.2 響應(yīng)面結(jié)果驗(yàn)證性試驗(yàn)

根據(jù)響應(yīng)面試驗(yàn)?zāi)Ｐ徒Y(jié)果計(jì)算可知，大豆多肽制備的最佳工藝條件為接種量3.02%，發(fā)酵溫度37.35 ℃，發(fā)酵時(shí)間59.63 h。在此優(yōu)化條件下，枯草芽孢桿菌發(fā)酵豆渣得到的多肽得率為86.70%。為實(shí)際操作考慮，3個(gè)因素修正為接種量3%，發(fā)酵溫度37 ℃，發(fā)酵時(shí)間60 h，重復(fù)3次，多肽得率的平均值為88.12%，與預(yù)測值接近。說明該回歸模型可以為實(shí)際操作提供指導(dǎo)。

2.3 大豆多肽的抗氧化能力

由圖5（a）可知，VC質(zhì)量濃度在0～0.008 mg/mL范圍內(nèi)增加，VC對DPPH自由基清除率顯著上升，當(dāng)VC質(zhì)量濃度≥0.008 mg/mL時(shí)，DPPH自由基清除率趨于穩(wěn)定，當(dāng)VC質(zhì)量濃度為0.016 mg/mL時(shí)，DPPH自由基清除率接近100%；當(dāng)多肽樣品質(zhì)量濃度在0～6.250 mg/mL之間時(shí)，樣品對DPPH自由基清除率顯著上升，多肽樣品質(zhì)量濃度＞6.250 mg/mL時(shí)，DPPH自由基清除率趨于穩(wěn)定，并且在樣品質(zhì)量濃度為25mg/mL時(shí)，對DPPH自由基清除率達(dá)到91.71%。

由圖5（b）可知，隨著VC質(zhì)量濃度在0～0.008 mg/mL范圍內(nèi)增加，對ABTS自由基清除率顯著上升。當(dāng)VC質(zhì)量濃度≥0.008 mg/mL時(shí)，ABTS自由基清除率趨于穩(wěn)定，對ABTS自由基清除率接近100%；當(dāng)多肽樣品質(zhì)量濃度在0～6.250 mg/mL范圍內(nèi)增加時(shí)，多肽樣品對ABTS自由基清除率顯著上升，樣品質(zhì)量濃度≥6.250 mg/mL時(shí)，對ABTS自由基的清除率緩慢提高，在樣品質(zhì)量濃度為25 mg/mL時(shí)，對ABTS自由基清除率為89.68%。

圖5 VC及大豆多肽樣品對DPPH自由基（a）和ABTS自由基（b）的清除率Fig.5 Scavenging rates of VC and soybean polypeptides samples on DPPH radical (a) and ABTS radical (b)

VC和樣品對DPPH自由基清除能力的半效應(yīng)濃度（median effect concentration，EC50）分別為0.001 5 mg/mL，（2.36±0.05）mg/mL時(shí)，VC和大豆多肽樣品對ABTS自由基清除率EC50分別為0.001 7 mg/mL，（2.97±0.03）mg/mL，說明樣品對DPPH自由基和ABTS自由基均具有一定清除能力，但與VC相比，其抗氧化能力較弱。

2.4 大豆多肽的抑菌活性

以無菌水作空白對照，發(fā)酵豆渣制備的多肽抑菌效果見圖6。由圖6可知，其對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌沒有抑制效果，大豆多肽作用兩菌后出現(xiàn)明顯的抑菌圈，當(dāng)多肽質(zhì)量濃度為25 mg/mL時(shí)，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌抑菌圈直徑分別為（27.65±0.32）mm、（23.18±0.14）mm，且大豆多肽對大腸桿菌的抑菌活性強(qiáng)度高于金黃色葡萄球菌。

圖6 大豆多肽樣品的抑菌效果Fig.6 Antibacterial effect of soybean polypeptide samples

3 結(jié)論

枯草芽孢桿菌發(fā)酵豆渣制備大豆多肽的最佳工藝條件為：接種量3%，發(fā)酵溫度37 ℃，發(fā)酵時(shí)間60 h。在此優(yōu)化條件下，枯草芽孢桿菌發(fā)酵豆渣得到的多肽得率為88.12%?？寡趸瘜?shí)驗(yàn)結(jié)果表明，多肽樣品對DPPH自由基和ABTS自由基清除能力的EC50分別為（2.36±0.05）mg/mL、（2.97±0.03）mg/mL，抑菌性能實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，大豆多肽質(zhì)量濃度為25 mg/mL時(shí)，對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑分別為（27.65±0.32）mm、（23.18±0.14）mm。本研究對減少豆渣的浪費(fèi)，降低環(huán)境污染，提高豆渣高值化利用提供了一定的理論基礎(chǔ)。