濃香型白酒發(fā)酵過(guò)程中氨基甲酸乙酯形成的關(guān)聯(lián)因子探究

田夏瓊，江華明，關(guān)統(tǒng)偉 *，楊 涵，彭 忠，林宜錦，張家旭，趙小林

（1.西華大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，四川 成都 610039；2.四川職業(yè)技術(shù)學(xué)院 食品與生物技術(shù)學(xué)院，四川 遂寧 629099；3.成都蜀之源酒業(yè)有限公司，四川 成都 611335）

白酒屬于世界六大蒸餾酒之一，是我國(guó)特有的傳統(tǒng)酒精飲料，已經(jīng)有數(shù)千年的文化歷史[1]。白酒文化的起源可以追溯到龍山文化時(shí)期，其多種微生物自然接種、長(zhǎng)時(shí)間、開(kāi)放式的固態(tài)發(fā)酵獨(dú)特工藝，造就了我國(guó)白酒不同于西方蒸餾酒純種液態(tài)發(fā)酵的風(fēng)格特征[2]。新中國(guó)成立后，白酒產(chǎn)業(yè)得到黨和政府的高度重視，從提高產(chǎn)量、質(zhì)量，改進(jìn)生產(chǎn)工藝與設(shè)備等方面組織了多次技術(shù)攻關(guān)，取得了豐碩成果。如20世紀(jì)60年代后的白酒微生物技術(shù)以及后來(lái)的現(xiàn)代微生物技術(shù)[3-4]；20世紀(jì)70-80年代的白酒機(jī)械化和低度白酒生產(chǎn)技術(shù)[5]；20世紀(jì)90年代的固液結(jié)合白酒生產(chǎn)技術(shù)[6]；21世紀(jì)初的“中國(guó)白酒169計(jì)劃”（白酒風(fēng)味及其微生物新技術(shù)）、“中國(guó)白酒158計(jì)劃”（白酒機(jī)械化、自動(dòng)化和智能化）和“中國(guó)白酒3C計(jì)劃”（品質(zhì)誠(chéng)實(shí)、服務(wù)誠(chéng)心、產(chǎn)業(yè)誠(chéng)信）[7]。這一系列的研究，使我國(guó)白酒產(chǎn)量從1949年的10.4萬(wàn)kL提高到2017年的1 200萬(wàn)kL；產(chǎn)值近6 000億元，約占國(guó)內(nèi)生產(chǎn)總值的0.5%左右。

隨著白酒產(chǎn)業(yè)的迅速發(fā)展，我國(guó)對(duì)白酒產(chǎn)品的質(zhì)量也提出了更高的要求。其中白酒生產(chǎn)全過(guò)程中的安全風(fēng)險(xiǎn)物質(zhì)是衡量白酒質(zhì)量安全的關(guān)鍵指標(biāo)，一般將其分為外源性和內(nèi)源性兩類[8]。內(nèi)源性風(fēng)險(xiǎn)物質(zhì)是指白酒在釀造發(fā)酵過(guò)程中生成的有害副產(chǎn)物，主要包括氨基甲酸乙酯（ethyl carbamate，EC）、氰化物、甲醇和生物胺等，其特點(diǎn)是無(wú)法完全避免，只能在了解物質(zhì)發(fā)酵生成機(jī)理的基礎(chǔ)上盡量減少白酒生產(chǎn)過(guò)程中相關(guān)副產(chǎn)物的產(chǎn)生，并控制該類副產(chǎn)物由原酒遷移到成品酒中的含量，從而降低內(nèi)源性風(fēng)險(xiǎn)物質(zhì)對(duì)人體健康的潛在危害[9]。

氨基甲酸乙酯（EC）俗稱尿烷、乙基尿烷，是酒精飲料（白酒、葡萄酒、啤酒、清酒、黃酒等）在生產(chǎn)和貯存過(guò)程中產(chǎn)生的一種天然副產(chǎn)物[10-11]。在日常生活中，酒精飲料是人體直接攝入EC的重要來(lái)源。（聯(lián)合國(guó)）食品添加劑法規(guī)委員會(huì)（Codex Committee on Food Additive，CCFA）指出[12]，人體從酒精飲品中攝入的EC含量平均為65 ng/（kg·d），約為通過(guò)食物攝入量的近5倍。EC在2007年已被世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（International Agency for Research on Cancer，IARC）歸為2A類致癌物[13]?？梢?jiàn)，飲料酒既是大多數(shù)人攝入EC最主要的途徑，也是危害人體健康的EC的最直接來(lái)源。發(fā)酵和蒸餾是白酒釀造的兩個(gè)重要環(huán)節(jié)[14]，此前已有大量關(guān)于黃酒或葡萄原酒以及成品酒中EC含量的研究報(bào)道，發(fā)現(xiàn)影響EC含量的因素是復(fù)雜多樣的，其中釀造的環(huán)境因素被認(rèn)為是影響EC含量的主要原因[15-16]。隨著研究的深入，越來(lái)越多的研究者發(fā)現(xiàn)微生物也是影響酒中EC含量的不可忽視的因素[17]。系統(tǒng)的研究中國(guó)白酒發(fā)酵過(guò)程中EC形成原因?qū)ξ覈?guó)白酒的飲用安全性以及白酒產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)健康發(fā)展是有利的。因此本研究以濃香型白酒發(fā)酵糟醅為主要研究對(duì)象，持續(xù)監(jiān)測(cè)發(fā)酵過(guò)程中的EC含量，環(huán)境因子以及微生物的群落變化，以確定濃香型白酒發(fā)酵過(guò)程中理化因素及微生物與EC含量的關(guān)系，為探索控制白酒中EC含量的措施提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酒醅樣本：中國(guó)四川省某知名白酒企業(yè)隨機(jī)選取三個(gè)平行窖池，分別于0 d、7 d、15 d、25 d、45 d、70 d、95 d這7個(gè)酒糟發(fā)酵節(jié)點(diǎn)，參照GUAN T W等[18]的方法，在窖池上、中層等距離取樣，每個(gè)窖池共6個(gè)平行樣，每個(gè)發(fā)酵時(shí)間節(jié)點(diǎn)樣本由18個(gè)樣本混合均勻而成。采用無(wú)菌袋運(yùn)輸樣本回實(shí)驗(yàn)室，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

實(shí)驗(yàn)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

PHS-320酸度計(jì)：上海儀電科學(xué)儀器有限公司；BZF-50真空干燥箱：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；BSA224S-CW萬(wàn)分之一天平：賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；2020NX氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）：日本島津公司；PowerSoil脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）Isolation Kit試劑盒：上海生工生物工程股份有限公司；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerasechain reaction，PCR）Purification Kit試劑盒：賽默飛世爾科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 氨基甲酸乙酯含量測(cè)定

參照參考文獻(xiàn)[15]的方法測(cè)定酒醅的EC含量：將20 g酒醅樣品與100 μL 1.0 g/L的d5-EC混勻，靜置過(guò)夜。次日添加蒸餾水稀釋混勻，超聲（功率60 W，超聲頻率40 kHz）浸提1 h后離心。取浸提液20 μL與0.1 g氯化鈉混合到離心管中。3 000 r/min旋轉(zhuǎn)1 min后，將混合物倒入硅藻土固相萃取柱中靜置10 min。使用10 mL正己烷進(jìn)行淋洗后，用10 mL 5%乙酸乙酯-乙醚溶液以約1 mL/min流速進(jìn)行洗脫。收集的洗脫液經(jīng)過(guò)濾、無(wú)水硫酸鈉脫水，收集于10 mL刻度試管中。室溫條件下用氮?dú)饩従彺抵良s0.5 mL，用甲醇定容至1 mL制成測(cè)定液，供GC-MS分析。進(jìn)樣口溫度為200 ℃，氦氣（He）流速為1 mL/min。

MS傳輸線溫度為250 ℃，MS源溫度為230 ℃。選擇m/z 64（氨基甲酸酯-d5）和m/z 62（氨基甲酸酯-d5）進(jìn)行定量分析。EC監(jiān)測(cè)離子為m/z 44、m/z 62、m/z 89，內(nèi)標(biāo)監(jiān)測(cè)離子為m/z 44、m/z 64、m/z 76。

1.3.2 環(huán)境因子的動(dòng)態(tài)變化

（1）溫度的測(cè)定

采用探針式溫度計(jì)檢測(cè)窖池中層酒糟的溫度，每個(gè)發(fā)酵節(jié)點(diǎn)在同一時(shí)段記錄三個(gè)平行窖池的溫度數(shù)據(jù)。

（2）水分的測(cè)定

在每個(gè)發(fā)酵節(jié)點(diǎn)稱取約10 g酒醅樣品（m），讀取質(zhì)量m1，在105 ℃條件下將樣品烘干至質(zhì)量恒定，隨后冷卻至室溫，再次稱質(zhì)量（m2）。水分含量計(jì)算公式如下：

（3）pH的測(cè)定

在每個(gè)發(fā)酵節(jié)點(diǎn)準(zhǔn)確稱取酒醅樣本10 g與50 mL去離子水混合均勻，靜置后用pH計(jì)測(cè)定酒醅樣品的pH值。

（4）乙醇含量的測(cè)定

在每個(gè)發(fā)酵節(jié)點(diǎn)準(zhǔn)確稱取酒醅50g置于500mL圓底燒瓶中，加入150 mL蒸餾水，加熱取餾出液。按照GB 5009.225—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)酒中乙醇濃度的測(cè)定》，檢測(cè)餾出液的酒精度。

1.3.3 發(fā)酵過(guò)程中微生物分析

準(zhǔn)確稱取酒醅樣品8 g，采用PowerSoil DNA Isolation Kit試劑盒提取酒醅DNA，具體操作按說(shuō)明書(shū)使用。PCR所用的引物為515F/806R以及ITS5-1737F/ITS2-2043R。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；（94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s）32 個(gè)循環(huán)；72 ℃保持5 min。PCR產(chǎn)物采用PCR Purification Kit試劑盒進(jìn)行純化[19]。純化后的PCR產(chǎn)物由上海生物工程股份有限公司完成高通量測(cè)序。所有原始數(shù)據(jù)保存在美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）數(shù)據(jù)庫(kù)，登陸號(hào)為PRJNA 622890。原始數(shù)據(jù)通過(guò)Qiime-pipeline（v.1.8.0）進(jìn)行處理。選取置信度為80%的閾值對(duì)每個(gè)操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）的代表序列進(jìn)行分類，得到每個(gè)OTU的屬水平分類。

2 結(jié)果與分析

2.1 濃香型白酒發(fā)酵過(guò)程中EC含量變化

濃香型白酒中EC含量在發(fā)酵期間的變化趨勢(shì)見(jiàn)圖1。

圖1 濃香型白酒發(fā)酵過(guò)程中氨基甲酸乙酯含量變化Fig.1 Changes of ethyl carbamate content during strong-flavor Baijiu fermentation

由圖1可知，EC含量隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)呈先緩升后快速增加，再達(dá)到穩(wěn)定的趨勢(shì)，EC的積累主要發(fā)生在白酒發(fā)酵的中后期。發(fā)酵前15 d，EC積累速率較慢，EC含量從85.12 μg/kg增至102.78 μg/kg；15 d之后，EC生成速率逐漸加快；至發(fā)酵70 d時(shí)，酒醅中EC含量達(dá)到188.34 μg/kg；此后（70～95 d）EC含量維持在相對(duì)穩(wěn)定的水平。此結(jié)果與梁晨[20]通過(guò)對(duì)醬香型白酒和芝麻香型白酒發(fā)酵30 d的追蹤得出的EC含量總體變化趨勢(shì)一致。

2.2 濃香型白酒發(fā)酵期間環(huán)境因子變化分析

濃香型白酒發(fā)酵期間溫度和pH變化見(jiàn)圖2，水分和乙醇含量的變化見(jiàn)圖3。

圖2 濃香型白酒發(fā)酵過(guò)程中溫度和pH值的變化Fig.2 Changes of temperature and pH during strong-flavor Baijiu fermentation

圖3 濃香型白酒發(fā)酵過(guò)程中水分和乙醇含量的變化Fig.3 Changes of moisture and ethanol content during strong-flavor Baijiu fermentation

由圖2可知，0～7 d是發(fā)酵微生物初適應(yīng)階段，在此過(guò)程中溫度變化緩慢，從19.09 ℃升至20.38 ℃；隨后發(fā)酵體系開(kāi)始迅速升溫，在發(fā)酵第25天時(shí)溫度達(dá)到最高（33.76 ℃）；在發(fā)酵的中后期（25～95 d），表現(xiàn)出降溫趨勢(shì)，但溫度仍高于初始發(fā)酵期間，最終（95 d）溫度為26.99 ℃。濃香型白酒發(fā)酵期間pH值呈現(xiàn)整體下降趨勢(shì)。在發(fā)酵0～25 d，pH值下降速率較快，從pH3.96降至3.51；此后，pH值下降速率緩慢，至發(fā)酵結(jié)束時(shí)，pH值為3.34。

由圖3可知，濃香型白酒發(fā)酵過(guò)程中水分含量在發(fā)酵前期（0～25 d）呈穩(wěn)定上升趨勢(shì)，在第25天時(shí)，水分含量為65.78%；之后水分含量維持基本恒定狀態(tài)，到發(fā)酵結(jié)束時(shí)，水分含量為64%。濃香型白酒發(fā)酵過(guò)程中乙醇含量變化趨勢(shì)與水分含量基本一致。發(fā)酵前25 d乙醇含量不斷提高，在第25天達(dá)到最大值，為7.46%vol；此后乙醇含量呈下降趨勢(shì)直至發(fā)酵結(jié)束（5.02%vol），數(shù)量變值在2%以內(nèi)。

2.3 濃香型白酒發(fā)酵期間微生物群落分析

本研究采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)濃香型白酒發(fā)酵過(guò)程中細(xì)菌、真菌類群構(gòu)成進(jìn)行了揭示，并對(duì)其在屬水平上的注釋結(jié)果進(jìn)行了分析，結(jié)果見(jiàn)圖4、圖5。

濃香型白酒發(fā)酵中屬水平上豐度較高的細(xì)菌群落分布見(jiàn)圖4。由圖4可知，與數(shù)據(jù)庫(kù)比較后，10個(gè)主要的高豐度細(xì)菌群落分別為乳桿菌屬（Lactobacillus）、魏斯氏菌屬（Weissella）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、片球菌屬（Pediococcus）、科薩克氏菌屬（Kosakonia）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、泛菌屬（Pantoea）、發(fā)酵單胞菌屬（Fermentimonas）以及未被培養(yǎng)的厭氧繩菌屬（Anaerolineaceae）和擬桿菌屬（Bac teroides）。乳桿菌屬是整個(gè)發(fā)酵期間的優(yōu)勢(shì)菌屬，占比為5.14%～87.79%。并且隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，Lactobacillus逐漸占據(jù)絕對(duì)主導(dǎo)地位。此外，魏斯氏菌屬在發(fā)酵前15 d占據(jù)優(yōu)勢(shì)（2.06～12.08%），此后相對(duì)豐度持續(xù)減小，到發(fā)酵后期僅為0.34%。芽孢桿菌屬、片球菌屬、科薩克氏菌屬以及泛菌屬在白酒發(fā)酵期間的相對(duì)豐度變化趨勢(shì)與Weissella基本一致，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，相對(duì)豐度都持續(xù)下降。值得注意的是，葡萄球菌屬在未發(fā)酵時(shí)（D0），其相對(duì)豐度占比（5.57%）較高，發(fā)酵期間豐度低（0.13%～0.79%），而發(fā)酵末期豐度有較大提升，達(dá)到2.18%。

圖4 濃香型白酒發(fā)酵過(guò)程中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬相對(duì)含量Fig.4 Relative contents of dominant bacteria genus during strongflavor Baijiu fermentation

由圖5可知，與數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，濃香型白酒發(fā)酵過(guò)程中有7個(gè)主要的真菌群相對(duì)豐度較高。包括哈薩克斯坦酵母屬（Kazachstania）、嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）、曲霉屬（Aspergillus）、釀酒酵母屬（Saccharomyces）、嗜熱酵母屬（Thermomyces）、德巴利酵母屬（Debaryomyces）和未分類的屬。其中哈薩克斯坦酵母屬占比為0.01%～74%，但是隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)其相對(duì)豐度呈持續(xù)下降的趨勢(shì)。嗜熱子囊菌屬以及曲霉屬的相對(duì)豐度都隨著發(fā)酵的進(jìn)行有所減少。此外，嗜熱酵母屬和德巴利酵母屬幾乎只存在于發(fā)酵末期。釀酒酵母屬（0～24%）在整個(gè)發(fā)酵期間也占據(jù)優(yōu)勢(shì)地位，并且在發(fā)酵中期其相對(duì)豐度呈上升趨勢(shì)。

圖5 濃香型白酒發(fā)酵過(guò)程中優(yōu)勢(shì)真菌屬相對(duì)含量Fig.5 Relative content of dominant fungi genus during strong-flavor Baijiu fermentation

2.4 EC含量與發(fā)酵環(huán)境因子的相關(guān)性分析

為揭示環(huán)境因子對(duì)發(fā)酵期間EC含量的影響，利用Pearson量化兩者之間的相關(guān)性，結(jié)果見(jiàn)圖6。由圖6可知，EC含量的變化主要由pH以及水分含量驅(qū)動(dòng)，兩者與EC含量的相關(guān)性系數(shù)分別為0.9和0.83，水分含量呈正相關(guān)，而pH值呈負(fù)相關(guān)。相比之下，溫度和乙醇含量對(duì)EC的形成起到一定的促進(jìn)作用，但效果并不顯著，相關(guān)系數(shù)分別為0.48和0.71。

圖6 濃香型白酒發(fā)酵過(guò)程中環(huán)境因子對(duì)氨基甲酸乙酯含量的影響Fig.6 Effects of environmental factors on ethyl carbamate content during strong-flavor Baijiu fermentation

之前的研究表明，較低的發(fā)酵溫度對(duì)減少EC的前體物質(zhì)與乙醇反應(yīng)速率上起到積極影響[21]，并有研究者認(rèn)為溫度是影響EC含量至關(guān)重要的原因，然而本研究得出相反的結(jié)論?？紤]到各研究選擇的發(fā)酵周期不一，推測(cè)溫度對(duì)于長(zhǎng)周期發(fā)酵下的EC含量并無(wú)顯著影響。pH對(duì)EC含量的影響可能在于pH對(duì)EC前體尿素的作用，pH值越高，尿素的去除率越高[22]，因此pH可通過(guò)對(duì)尿素的影響從而起到調(diào)控EC含量的作用。目前暫未發(fā)現(xiàn)發(fā)酵過(guò)程中水分含量和乙醇含量與EC的相關(guān)性研究，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明水分含量的增加會(huì)促進(jìn)EC的積累，因此可調(diào)節(jié)發(fā)酵窖池里的水分含量來(lái)控制EC的合成。

2.5 EC含量與發(fā)酵微生物的相關(guān)性分析

如圖7所示，總體來(lái)說(shuō)，大部分白酒發(fā)酵過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)微生物菌屬對(duì)EC的積累無(wú)顯著影響作用。Pearson分析表明，乳酸菌屬（Lactobacillus）以及芽孢桿菌屬（Bacillus）是響應(yīng)EC變化的主要細(xì)菌屬（圖7A），其中Lactobacillus的豐度與EC含量呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.97。與之相反的是芽孢桿菌屬，其豐度越高，發(fā)酵體系中產(chǎn)生的EC越少，相關(guān)系數(shù)為0.78。在真菌群落中，釀酒酵母菌屬（Saccharomyces）是唯一能顯著推動(dòng)EC形成的菌屬（圖7B），兩者之間的相關(guān)系數(shù)高達(dá)0.96。

圖7 濃香型白酒發(fā)酵過(guò)程中細(xì)菌（A）和真菌（B）群落變化對(duì)氨基甲酸乙酯含量的影響Fig.7 Effects of bacterial (A) and fungal (B) community changes on ethyl carbamate content during fermentation of strong-flavor Baijiu fermentation

本研究結(jié)果符合眾多學(xué)者對(duì)微生物和EC相關(guān)性的研究。EC 的前體瓜氨酸可以被乳酸菌通過(guò)精氨酸脫亞胺酶途徑代謝，而釀酒酵母通過(guò)鳥(niǎo)氨酸循環(huán)積累尿素，導(dǎo)致EC增加[23]，因此，乳酸菌屬以及芽孢桿菌屬與發(fā)酵過(guò)程中EC含量呈顯著正相關(guān)。值得注意的是，本研究發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌屬與EC含量呈顯著正相關(guān)，這可能歸因于芽孢桿菌屬產(chǎn)脲酶能力較強(qiáng)[24-25]，從而分解尿素，減少前體對(duì)積累EC的貢獻(xiàn)，然而具體原因仍然需要更深入的探究。此外，未來(lái)可著手于添加芽孢桿菌屬對(duì)白酒EC含量以及風(fēng)味影響的研究。

3 結(jié)論

本研究對(duì)濃香型白酒發(fā)酵過(guò)程中氨基甲酸乙酯（EC）的含量、環(huán)境因子及微生物群落進(jìn)行了連續(xù)追蹤監(jiān)測(cè)，分析了環(huán)境因子及微生物群落與EC含量之間的相關(guān)性。發(fā)現(xiàn)EC含量隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)呈先緩升后快速增加，再達(dá)到穩(wěn)定的趨勢(shì)，EC的積累主要發(fā)生在白酒發(fā)酵的中后期。發(fā)酵過(guò)程中，pH和水分含量是影響EC含量的顯著因素，其中pH與EC呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.9，而水分則與EC的積累呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.83；溫度和乙醇含量對(duì)EC的形成有一定的促進(jìn)作用，但效果并不顯著，相關(guān)系數(shù)分別為0.48和0.71。此外，發(fā)酵體系中乳桿菌屬（Lactobacillus）和和釀酒酵母屬（Saccharomyces）與EC含量的相關(guān)系數(shù)為0.97和0.96，兩者的豐度越高，EC越容易積累；芽孢桿菌屬（Bacillus）則對(duì)EC的合成起到反作用，與EC含量的相關(guān)系數(shù)為0.78，隨著芽孢桿菌屬（Bacillus）的相對(duì)豐度增加，EC的形成受到抑制。由此可見(jiàn)，在白酒的發(fā)酵期間可通過(guò)人為調(diào)控pH值及水分含量以控制EC含量，此外上調(diào)芽孢桿菌屬在發(fā)酵微生物中的比例，可達(dá)到降低EC含量的目的。