2 例3M 綜合征產(chǎn)前診斷的病例報(bào)道及文獻(xiàn)復(fù)習(xí)

王逾男 汪安石 熊盈 曾玉坤 余麗華 何天文★

3M 綜合征是一種罕見(jiàn)的常染色體隱性遺傳性疾病，發(fā)病率不明，目前全世界僅100 余例報(bào)道。其臨床表現(xiàn)為產(chǎn)前和產(chǎn)后生長(zhǎng)發(fā)育遲緩、特殊面容、頭圍增大和骨骼發(fā)育異常等，而智力水平和內(nèi)分泌功能通常正常，男性常伴有性腺功能減退，偶有尿道下裂［1］。1975 年，三位遺傳學(xué)家米勒、麥庫(kù)西克和馬爾沃首次發(fā)現(xiàn)并報(bào)道了本病，故其以三位遺傳學(xué)家名字的首字母命名［2］。根據(jù)2019 年修訂的遺傳性骨骼疾病分類(lèi)，3M 綜合征被歸類(lèi)為細(xì)長(zhǎng)骨發(fā)育不良組，其典型的骨骼改變?yōu)楣軤罟?，椎體縮短和骨齡延遲［3］。3M 綜合征的生長(zhǎng)障礙大多是由致病基因CCDC8、OBSL1、CUL7突變而引起的，占比分別為8%、23%、69%［4］。本病大多數(shù)于兒童期或成年后診斷，若無(wú)先證者，極難在產(chǎn)前明確診斷。本研究分析了兩例宮內(nèi)表現(xiàn)為嚴(yán)重宮內(nèi)生長(zhǎng)發(fā)育遲緩的3M 綜合征胎兒的產(chǎn)前超聲表現(xiàn)及產(chǎn)前診斷結(jié)果，以期豐富中國(guó)人群宮內(nèi)生長(zhǎng)發(fā)育遲緩的遺傳信息。提高大家對(duì)3M綜合征宮內(nèi)表現(xiàn)的認(rèn)識(shí)，有助于其早期宮內(nèi)診斷。

1 研究對(duì)象與方法

1.1 病例資料

病例1，孕婦鄒××，29 歲。孕18 周因“NT 增厚4.2 mm，超聲提示胎兒股骨徑小于孕周3 周”轉(zhuǎn)診到本院。G2P1A0，2015 年孕37 周因胎兒四肢短小，胸廓狹窄，雙肺發(fā)育不良，羊水過(guò)少外院引產(chǎn)1 次；夫妻雙方正常身高。孕婦于18 周接受了羊水染色體核型分析、染色體微陣列基因芯片檢測(cè)（chromosomal microarray，CMA）及FGFR3 基因測(cè)序檢查，結(jié)果均未見(jiàn)異常。孕婦于孕23+6周行Ⅲ級(jí)超聲檢查，結(jié)果提示胎兒四肢長(zhǎng)骨明顯小于孕周（4～5 周），為進(jìn)一步明確病因，擬采用高通量測(cè)序方法針對(duì)孕婦本人、孕婦丈夫以及胎兒進(jìn)行醫(yī)學(xué)外顯子組序列分析。胎兒孕期不同孕周生長(zhǎng)徑線情況。見(jiàn)表1。

表1 病例1 胎兒不同孕周生長(zhǎng)徑線情況Table 1 Growth diameter at different gestational weeks of Fetus 1

病例2，孕婦林××，34 歲，孕29+周因“胎兒四肢長(zhǎng)骨明顯小于孕周5～7 周”轉(zhuǎn)診到本院。孕期NT 檢查正常范圍。外院已行介入性產(chǎn)前診斷，檢查項(xiàng)目包括羊水染色體核型分析、CMA 及FGFR3基因測(cè)序檢查，結(jié)果均未見(jiàn)異常。孕產(chǎn)史無(wú)特殊。為進(jìn)一步明確病因，擬采用高通量測(cè)序方法針對(duì)孕婦本人、孕婦丈夫以及胎兒進(jìn)行醫(yī)學(xué)外顯子組序列分析。胎兒孕期不同孕周生長(zhǎng)徑線情況見(jiàn)表2。

表2 病例2 胎兒不同孕周生長(zhǎng)徑線情況Table 2 Growth diameter at different gestational weeks of Fetus 2

1.2 方法

1.2.1 DNA 提取

采用血液基因組DNA 提取試劑盒（廈門(mén)致善生物科技股份有限公司）提取外周血基因組DNA；利用柱提法對(duì)產(chǎn)前診斷標(biāo)本（羊水/臍血）進(jìn)行基因組DNA 提?。≦iamp DNA Blood Mini Kit）。提取完成后，用NanoDrop 2000 超微量分光光度計(jì)DNA 進(jìn)行純度和濃度的測(cè)定，合格DNA 保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 醫(yī)學(xué)外顯子組序列分析

通過(guò)快速Q(mào)F-PCR（Quantitative Fluorescent Polymerase Chain Reaction）法對(duì)D13S252、D18S386、D21S11 等26 個(gè)STR 位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，分析胎兒染色體非整倍體情況，及排除所采集的胎兒標(biāo)本無(wú)母體DNA 污染。將提取的孕婦及丈夫外周血全基因組DNA 及產(chǎn)前診斷標(biāo)本（羊水/臍血）DNA各100 μL，送至廣州嘉檢醫(yī)學(xué)檢測(cè)有限公司進(jìn)行與人類(lèi)疾病相關(guān)的4 000 個(gè)已知基因編碼外顯子區(qū)域及側(cè)翼區(qū)的序列分析。測(cè)序后獲得的原始數(shù)據(jù)通過(guò)使用BWA 軟件進(jìn)行序列比對(duì)，采用GATK 和Var Scan 軟件對(duì)變異進(jìn)行識(shí)別，包括單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）、插入與缺失等進(jìn)行檢測(cè)、注釋和統(tǒng)計(jì)分析。利用Annovar 軟件從外部數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行變異位點(diǎn)注釋?zhuān)栽u(píng)估給定的序列變異的影響。根據(jù)數(shù)據(jù)分析結(jié)果，參考db SNP 數(shù)據(jù)庫(kù)和HGMD 數(shù)據(jù)庫(kù)找出可能的致病突變。并對(duì)致病變異進(jìn)行Sanger 測(cè)序驗(yàn)證。通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)查找具有代表性的不同物種間該位點(diǎn)氨基酸保守性分析，以期揭示突變區(qū)域是否高度保守。

1.2.3 Sanger 測(cè)序驗(yàn)證

根據(jù)經(jīng)醫(yī)學(xué)外顯子組高通量測(cè)序后分析結(jié)果，使用Sanger 測(cè)序方法對(duì)胎兒及父母變異位點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證。采用Primer5 軟件設(shè)計(jì)引物，用聚合 酶 鏈 反 應(yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）技 術(shù) 擴(kuò) 增CUL7基 因（NM_014780）變異位點(diǎn)c.2416C＞T（R806*）、c.3489delG（W1163Cfs*44）、CUL7基因（NM_001168370）c.5011C＞T（p.Q1671*）、c.4585C＞T（p.R1529*）相應(yīng)外顯子及其側(cè)翼序列，引物由天一輝遠(yuǎn)廣州基因科技，有限公司合成，引物序列如下表3。按以下條件進(jìn)行進(jìn)行PCR擴(kuò) 增：LATaq 預(yù) 混 液12.5 μL，甜 菜 堿5 μL，正、反向引物各1 μL，樣本DNA 1 μL，無(wú)核酸水至25 μL；PCR 反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，62℃退火30 s，72℃延伸40 s，進(jìn)行40 個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。PCR 產(chǎn)物送至天一輝遠(yuǎn)廣州基因科技有限公司進(jìn)行Sanger 測(cè)序。

表3 CUL7 基因各變異位點(diǎn)引物序列Table 3 Primer sequences of each variant locus of CUL7 gene

1.2.4 隨訪

追蹤妊娠結(jié)局，包括出生孕周，分娩方式，出生體重等信息，對(duì)引產(chǎn)標(biāo)本進(jìn)行尸檢，包括大體檢查和顯微鏡檢查等。

2 結(jié)果

2.1 醫(yī)學(xué)外顯子組測(cè)序結(jié)果

2.1.1 高通量測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)控參數(shù)

基因包檢測(cè)區(qū)間覆蓋有人類(lèi)基因組中致病機(jī)制明確的4 000 個(gè)相關(guān)基因，74 566 個(gè)編碼區(qū)總共含有12 424 088 個(gè)堿基。平均覆蓋深度256+/-180X，大于10X 覆蓋區(qū)間占97.4%，大于20X 覆蓋區(qū)間占94.4%，參考序列版本號(hào)：GRCh37/hg19。

2.1.2 醫(yī)學(xué)外顯子檢測(cè)突變及Sanger測(cè)序驗(yàn)證結(jié)果

通過(guò)數(shù)據(jù)分析后發(fā)現(xiàn)病例一中胎兒CUL7基因存在復(fù)合雜合變異位點(diǎn)c.2416C＞T（p.R806*）（父親雜合）和c.3489delC（p.F1164Sfs*61）（母親雜合）。發(fā)現(xiàn)病例二中胎兒CUL7基因存在復(fù)合雜合變異位點(diǎn)c.5011C＞T（p.Q1671*）（父親雜合）、CUL7基 因c.4585C＞T（p.R1529*）（母 親 雜 合）。Sanger 測(cè)序結(jié)果與高通量測(cè)序結(jié)果一致。

2.2 隨訪

兩對(duì)夫妻經(jīng)遺傳咨詢(xún)后，均決定放棄本次妊娠。病例1 胎兒于33+周順產(chǎn)娩出，男胎，重1 365 g。大體表現(xiàn)為：前額突出、頭圍相對(duì)偏大、三角臉、鼻梁低平、肉的朝天鼻、唇部飽滿、尖下頜、四肢明顯短小、后跟突出。解剖結(jié)果與產(chǎn)前超聲基本吻合：四肢短粗。鏡下：取脛骨干骺端，見(jiàn)軟骨細(xì)胞增多，交界線整齊。全身X 光提示：前額突出，唇部飽滿，四肢長(zhǎng)骨明顯短小，管型骨。病例2胎兒于30 周順產(chǎn)娩出，為男胎，孕婦及家屬拒絕進(jìn)一步尸檢及大體檢查。

3 討論

3M 綜合征是一種罕見(jiàn)的遺傳性疾病，迄今為止，僅有約100 余例3M 綜合征的報(bào)道，中國(guó)僅報(bào)道了4 例病例［5-6］，而關(guān)于3M 綜合征胎兒產(chǎn)前診斷研究報(bào)道更少［7］。3M 患者的典型面部特征往往直到青春期才出現(xiàn)，一些臨床表型并非僅限于3M綜合征，故對(duì)3M 綜合征的診斷，臨床表型往往缺乏特異性，容易漏診。本研究中病例1 中引產(chǎn)胎兒有嚴(yán)重生長(zhǎng)遲緩，特征性面容（相對(duì)頭大、三角臉、鼻尖多肉、長(zhǎng)人中、嘴寬唇厚、尖下巴），影像學(xué)表現(xiàn)（長(zhǎng)骨細(xì)，明顯短小，管型骨），與3M 綜合征的臨床診斷基本是符合的。大多數(shù)3M 綜合征患者于兒童期或成年后診斷，若無(wú)先證者，極難在產(chǎn)前明確診斷。其產(chǎn)前超聲無(wú)特異表現(xiàn)，部分文獻(xiàn)報(bào)道宮內(nèi)有NT 增厚表現(xiàn)［3］，在本研究中，病例一胎兒在妊娠12+1周發(fā)現(xiàn)NT 增厚4.2 mm，病例2 中胎兒NT 正常范圍。還有一些文獻(xiàn)報(bào)道了另外一個(gè)非特異性超聲表現(xiàn)是宮內(nèi)發(fā)育遲緩［3，8-9］，本研究中2例胎兒都呈現(xiàn)隨著孕周進(jìn)行性加重的胎兒四肢長(zhǎng)骨小于孕周，而雙頂徑，頭圍和腹圍都大致正常。由于目前產(chǎn)前報(bào)道的3M 綜合征較少，目前宮內(nèi)報(bào)道的超聲表現(xiàn)——宮內(nèi)生長(zhǎng)發(fā)育遲緩和NT 增厚并不特異，不是3M 綜合征所特有的，故本病的確診還需要進(jìn)一步的分子診斷。

文獻(xiàn)研究表明，CUL7基因是3M 綜合征的主要致病基因［4］，它位于6p21.1，包含26 個(gè)外顯子，編碼包含1 698 個(gè)氨基酸的CUL7 蛋白［10］。CUL7蛋白屬于cullin 家族一員，它與SKP1-FBX29（FBXW8）和ROCl 構(gòu)成泛素連接酶E3，且在泛素連接酶E3 的組裝中起骨架作用［11-12］。CUL7基因的突變可導(dǎo)致CUL7 蛋白功能失調(diào)，使其不能招募ROC1，從而阻止了底物在體內(nèi)的泛素化、降解和積累，這可能在胎兒宮內(nèi)生長(zhǎng)遲緩的機(jī)制中發(fā)揮重要作用。CUL7基因敲除小鼠胚胎也表現(xiàn)出宮內(nèi)生長(zhǎng)遲緩的現(xiàn)象，可能因?yàn)镃UL7 蛋白可以與p53 結(jié)合，抑制p53 的轉(zhuǎn)錄激活效應(yīng)，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖，在CUL7基因敲除小鼠胚胎成纖維細(xì)胞中，p53 的活性顯著增加，導(dǎo)致了小鼠的宮內(nèi)生長(zhǎng)發(fā)育遲緩［13］。綜上CUL7基因變異可能是導(dǎo)致3M 綜合征的原因。本研究的變異位點(diǎn)中，其中c.2416C＞T（p.R806*）、c.4585C＞T（p.R1529*）與c.5011C＞T（p.Q1671*）變異使得原編碼氨基酸突變?yōu)榻K止密碼子，使得編碼蛋白提前終止（PVS1）；c.3489delC（p.F1164Sfs*61）為缺失變異，堿基的缺失使得后續(xù)閱讀框發(fā)生了移碼改變，同樣致使編碼蛋白提前終止，正常合成的功能蛋白發(fā)生截短而影響蛋白發(fā)揮正常功能（PVS1）。查詢(xún)clinvar 數(shù)據(jù)庫(kù)可知，CUL7基因的致病和疑似致病變異中，主要以無(wú)義變異（28：67）和移碼變異（24：67）為主；查詢(xún)gnomAD 數(shù)據(jù)庫(kù)得知上述變異人群頻率極低（PM2_Supporting），采用varcards（http：//varcards.biols.ac.cn/）在線針對(duì)上述變異位點(diǎn)進(jìn)行生物信息學(xué)致病性分析，預(yù)測(cè)為致病的可能性較大。綜合分析按照ACMG 指南的致病性分析評(píng)級(jí)為L(zhǎng)P（疑似致病變異）。

本研究利用高通量測(cè)序技術(shù)成功鑒定了兩例CUL7基因復(fù)合雜合變異導(dǎo)致的中國(guó)人3M 綜合征的新變異，新變異的發(fā)現(xiàn)豐富了中國(guó)人群的胎兒宮內(nèi)生長(zhǎng)發(fā)育遲緩的遺傳信息。