發(fā)酵對辣木飲料中營養(yǎng)成分的影響

李文杰 譚明璐 奚楚瑜 劉曉雪 田洋 宋爽

（1. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院 云南昆明 650201；2. 國家辣木加工技術(shù)研發(fā)專業(yè)中心云南昆明 650201；3. 云南省生物大數(shù)據(jù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 云南昆明 650201）

辣木(Moringa oleifera)也被稱為油辣木或鼓槌樹，具有明顯的辛辣味[1]。目前我國已引進(jìn)印度傳統(tǒng)辣木、印度改良辣木和非洲辣木。辣木成熟快，產(chǎn)量高，適應(yīng)性強(qiáng)，被廣泛種植于亞洲和非洲熱帶和亞熱帶地區(qū)，在我國海南、四川、廣東、廣西和云南等多地都有種植。

辣木營養(yǎng)豐富，富含蛋白質(zhì)、維生素A、礦物質(zhì)、必需氨基酸、類黃酮、異硫氰酸鹽[2]以及微量元素，并發(fā)現(xiàn)含有近50種抗氧化劑，以及多種人體所需維生素，具有抗癌、抗糖尿病、抗炎和抗氧化等藥理特性[3]；此外，辣木葉片中的鈣含量是牛奶的4倍，蛋白質(zhì)含量是牛奶的2倍。辣木資源豐富，采集方便，發(fā)育早，研究較多[4]。Olusanya等[5]在缺乏必需氨基酸和一些微量營養(yǎng)素的發(fā)酵玉米粉飲料中添加2%辣木葉粉后發(fā)現(xiàn)，其蛋白質(zhì)和礦物質(zhì)含量得到了提高。Elhadi等[6]在雞肉餅中加入5%的辣木葉粉，提高了雞肉餅的營養(yǎng)價(jià)值和貯藏穩(wěn)定性。

植物乳桿菌是研究最廣泛的乳桿菌物種之一，其可存在于各種環(huán)境中，功能性和代謝能力較強(qiáng)，在許多工業(yè)中得到廣泛應(yīng)用，具有生物屏障作用、降低心血管疾病的發(fā)病率等功能[7]。傳統(tǒng)的辣木飲料是粉末或顆粒的形式，是糖和香料的混合物，不添加其他食品成分和允許的食品添加劑[8]。本研究參考田洋等[9]的方法制作辣木飲料，研究辣木飲料在有無植物乳桿菌發(fā)酵的情況下營養(yǎng)物質(zhì)的變化情況，探索辣木葉營養(yǎng)粉新的應(yīng)用方法，以期為辣木資源的深度開發(fā)利用提供參考借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試材 辣木鮮葉，云南省德宏傣族景頗族自治州；白砂糖，云南滇王驛農(nóng)業(yè)科技開發(fā)有限公司；植物乳桿菌，中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；考馬斯亮藍(lán)G250、谷氨酸、三氯乙酸、Gly-Gly-Tyr-Arg 四肽標(biāo)準(zhǔn)溶液、茚三酮、氯化亞錫：上海源葉生物科技有限公司；硫酸、磷酸，重慶川東化工（集團(tuán)）有限公司；牛血清白蛋白，上海伯奧生物科技有限公司；酪胨、牛肉粉、酵母粉、葡萄糖、硫酸鎂、乙酸鈉、檸檬酸三銨、磷酸氫二鉀、硫酸錳、吐溫80、檸檬酸（食品級），阿拉丁試劑（上海）有限公司；辣木籽提取物(食品級)，云南力蓮生物有限公司；魔芋膠(食品級)：河北潤步生物科技有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備 TDZ5-WS多管架自動(dòng)平衡離心機(jī)，上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；JM-B6102電子天平，余姚市紀(jì)銘稱重校驗(yàn)設(shè)備有限公司；AR22N電子天平，奧豪斯儀器（常州）有限公司；SW-CJ-單人雙面超凈工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司；LRH-250生化培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；BCD-19HA冰箱，新飛；HWS24 電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；SX500高壓滅菌鍋，上海安亭科學(xué)儀器廠；A360紫外可見分光光度計(jì)，翱藝儀器（上海）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌種培養(yǎng)

1.2.1.1 菌種活化 乳酸細(xì)菌培養(yǎng)基（MRS）：酪胨10.0 g，牛肉粉8.0 g，酵母粉4.0 g，葡萄糖20.0 g，硫酸鎂0.2 g，乙酸鈉5.0 g，檸檬酸三銨2.0 g，磷酸氫二鉀2.0 g，硫酸錳0.05 g，吐溫80 1.0 g，蒸餾水1 000 mL。用檸檬酸將pH調(diào)至（6.2±0.2）。

用75%的酒精對超凈工作臺進(jìn)行消毒，每個(gè)培養(yǎng)皿中倒入15 mL左右MRS培養(yǎng)基，打開紫外燈及風(fēng)機(jī)，待培養(yǎng)基凝固。接種梯度從10–4至10–6，每個(gè)梯度接種2個(gè)培養(yǎng)皿，編號。將培養(yǎng)皿倒置于恒溫培養(yǎng)箱中，以30℃培養(yǎng)72 h[10]。

1.2.1.2 菌種純化 從活化菌種的培養(yǎng)基中選擇一個(gè)菌落，做劃線培養(yǎng)，培養(yǎng)基為MRS固體培養(yǎng)基，置于恒溫培養(yǎng)箱中，以30℃培養(yǎng)72 h。

1.2.1.3 擴(kuò)繁 往250 mL錐形瓶中加入7.2 g MRS肉湯+150 mL純水，以121℃高壓滅菌15 min，備用。從純化后的菌種中挑取生長最好的一個(gè)菌落接種于盛裝150 mL MRS液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，以30℃培養(yǎng)72 h。取1 mL生長好的菌種接種于新的裝有150 mL MRS液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，以30℃培養(yǎng)72 h。

1.2.2 工藝流程 辣木鮮葉→洗凈、護(hù)色→榨汁→過濾→滅菌→冷卻→接種→發(fā)酵→調(diào)味→密封→成品→4℃冷藏

1.2.3 操作要點(diǎn)

1.2.3.1 洗凈、護(hù)色 稱取新鮮的辣木葉600 g，用純凈水清洗兩遍，然后在沸水中煮10 min。

1.2.3.2 榨汁、過濾 將洗凈、護(hù)色后的辣木葉置于榨汁機(jī)中，加入3 L純凈水榨汁；然后用800目的濾網(wǎng)過濾，得到辣木葉汁，備用。

1.2.3.3 滅菌、冷卻 準(zhǔn)備20個(gè)三角瓶，每個(gè)三角瓶中放入10 g白砂糖和150 mL辣木汁，用封口膜蓋好，再用橡皮筋密封于105℃下滅菌15 min；滅菌后取出，冷卻的過程中要確保密封性，避免外界微生物進(jìn)入。

1.2.3.4 接種 將裝有辣木汁的三角瓶編號處理，其中18瓶用于培養(yǎng)。剩下2瓶作為空白對照，一瓶接種等量植物乳桿菌，不培養(yǎng)；另一瓶不接菌種，與其他樣品一同培養(yǎng)。將每瓶樣品中的45 mL培養(yǎng)基離心后，加入1 mL生理鹽水稀釋，接種，蓋上封口膜，用橡皮筋固定，搖勻，放入恒溫培養(yǎng)箱。

1.2.3.5 發(fā)酵 將接種后的辣木汁，分別在28、29、30、31、32℃條件下發(fā)酵0、60、64、68、72、76、80 h，其中發(fā)酵0 h為對照組。

1.2.3.6 調(diào)味 于每份辣木汁中加入魔芋膠0.3 g、辣木籽提取物0.3 g和檸檬酸0.9 g，測定營養(yǎng)物質(zhì)含量。

1.2.3.7 密封 將1.2.3.6中的辣木汁密封后置于4℃的條件下冷藏。

1.2.4 項(xiàng)目測定 乳酸菌計(jì)數(shù)，參照GB 4789.35—2016[11]，采用菌落計(jì)數(shù)測定；水溶性蛋白含量，參照南亞等[12]采用考馬斯亮G-250法測定；鈣含量，參照林利民等[13]使用鈣試劑盒測定；多肽含量，參照劉揚(yáng)等[14]采用雙縮脲法測定；游離氨基酸含量，先配制標(biāo)準(zhǔn)液，準(zhǔn)確稱取0.100 g谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)品，加水稀釋，并定容，參照周國蘭等[15]采茚三酮比色法測定。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 所有測定均平行重復(fù)3次，對比標(biāo)準(zhǔn)曲線和公式得出結(jié)果。采用PRISM對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同發(fā)酵時(shí)間和溫度對植物乳桿菌菌落數(shù)目的影響

由圖1可見，所有對照組與試驗(yàn)組差異均顯著，試驗(yàn)組在不同發(fā)酵溫度與時(shí)間條件下差異不顯著。28和29℃的樣品發(fā)酵76 h時(shí)菌落數(shù)目達(dá)到最大值，分別為8.880×106和9.240×106CFU/mL，之后趨于平緩；30～32℃的樣品發(fā)酵72 h時(shí)活菌落數(shù)目達(dá)到最大值，分別為9.840×106、9.540×106、9.480×106CFU/mL，之后逐漸下降。

圖1 不同發(fā)酵時(shí)間和溫度下植物乳桿菌菌落數(shù)目

2.2 不同發(fā)酵時(shí)間和溫度對辣木飲料蛋白質(zhì)含量的影響

由圖2可見，辣木飲料中的蛋白質(zhì)含量在16.24～16.98 mg/mL，經(jīng)植物乳桿菌發(fā)酵后，辣木飲料的蛋白質(zhì)含量提高一倍，其中28℃的樣品發(fā)酵76 h時(shí)蛋白質(zhì)含量最高；29～32℃的樣品均是發(fā)酵72 h達(dá)到峰值，為34.62～35.90 mg/mL。辣木葉中蛋白質(zhì)含量豐富，但是其溶于水的蛋白很少，經(jīng)植物乳桿菌發(fā)酵后會(huì)產(chǎn)生一定量的菌體蛋白，蛋白質(zhì)含量提高。

圖2 不同發(fā)酵時(shí)間和溫度下辣木飲料蛋白質(zhì)含量

2.3 不同發(fā)酵時(shí)間和溫度對辣木飲料鈣含量的影響

由圖3可見，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，辣木飲料的鈣含量呈升高的趨勢，試驗(yàn)組不同時(shí)間點(diǎn)的差異顯著，且對照組含量明顯低于試驗(yàn)組。試驗(yàn)組普遍在發(fā)酵70 h后含量較高，76 h后變化較小，趨于平緩。辣木飲料中的鈣含量在0.764～0.785 mg/mL，除28℃外，其他溫度發(fā)酵72 h時(shí)鈣含量達(dá)到最高，為1.016～1.202 mg/mL；發(fā)酵76 h后，含量幾乎不變；溫度為30℃、發(fā)酵時(shí)間為72 h時(shí)鈣含量最高。

圖3 不同發(fā)酵時(shí)間和溫度下辣木飲料鈣含量

2.4 不同發(fā)酵時(shí)間和溫度對辣木飲料多肽含量的影響

由圖4可見，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，辣木飲料多肽含量顯著升高，提高4～5 mg/mL。多肽含量與發(fā)酵時(shí)間、溫度呈正相關(guān)。發(fā)酵0～72 h增幅較大；發(fā)酵72 h后，增幅減小，趨于平緩。植物乳桿菌具有分泌蛋白酶的能力，可以將蛋白質(zhì)進(jìn)一步分解為多肽類物質(zhì)，導(dǎo)致辣木飲料多肽含量的增加。

圖4 不同發(fā)酵時(shí)間和溫度下辣木飲料多肽含量

2.5 不同發(fā)酵時(shí)間和溫度對辣木飲料氨基酸含量的影響

由圖5可見，發(fā)酵過程中氨基酸含量的變化不大，發(fā)酵68 h后差異顯著，氨基酸含量總體略有上升。發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間變化區(qū)間太小，對飲料中氨基酸的含量影響較小。28、32℃的樣品發(fā)酵80 h時(shí)含量最高；29℃的樣品發(fā)酵76 h時(shí)氨基酸含量最高；30、31℃的樣品發(fā)酵72 h時(shí)氨基酸含量最高；發(fā)酵后氨基酸含量約提高0.2 mg/mL。植物乳桿菌發(fā)酵過程中多肽會(huì)繼續(xù)分解成各種氨基酸，導(dǎo)致氨基酸含量增加，但溫度過高會(huì)引發(fā)美拉德反應(yīng)，從而降解和消耗少量氨基酸[16]。

圖5 不同發(fā)酵時(shí)間和溫度下氨基酸含量

3 結(jié)論

本研究表明，與未發(fā)酵的辣木飲料相比，發(fā)酵后辣木飲料部分營養(yǎng)成分明顯增加，其中發(fā)酵后蛋白質(zhì)含量提高一倍，為16～19 mg/mL；鈣含量約提高0.3 mg/mL；多肽含量隨發(fā)酵溫度升高和發(fā)酵時(shí)間延長而增加；氨基酸含量變化較小，提高約0.2 mg/mL。

辣木在植物乳桿菌的發(fā)酵下形成辣木飲料，同時(shí)擁有辣木和植物乳桿菌二者的營養(yǎng)價(jià)值；該飲料在口感和營養(yǎng)方面都得到了提升，是一款風(fēng)味獨(dú)特、營養(yǎng)健康的新型發(fā)酵飲料。本研究為進(jìn)一步研究該飲料的最佳制備工藝提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)，同時(shí)為研究辣木的深加工提供一定的參考，有利于強(qiáng)化辣木飲品研究體系，建立相應(yīng)的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，推動(dòng)辣木產(chǎn)業(yè)高值化發(fā)展。