檳榔種苗和采摘工具的植原體檢測

林兆威 宋薇薇 唐慶華 牛曉慶 王宇航,2 孟秀利

（1. 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院椰子研究所/海南省院士團隊創(chuàng)新中心/海南省檳榔產(chǎn)業(yè)工程研究中心 海南文昌571339；2. 海南大學植物保護學院 海南?？?570228）

檳榔（Areca cathecuL.）是棕櫚科檳榔屬多年生熱帶作物，也是中國的“四大南藥”（檳榔、砂仁、益智及巴戟天）之首。在我國，檳榔主要栽培于海南省、臺灣省及云南省等地，其中海南省檳榔種植面積占全國的95%以上，產(chǎn)量位居世界第二位[1]。目前，檳榔作為海南省重要的熱帶經(jīng)濟作物，是省政府重點發(fā)展的“六棵樹”（橡膠、椰子、檳榔、沉香、花梨及油茶）之一、省中東部地區(qū)230萬農(nóng)民經(jīng)濟收入的主要來源及省中部貧困地區(qū)脫貧的重要支柱產(chǎn)業(yè)[2]。由于當前檳榔經(jīng)濟效益的增長，種植面積不斷增加，檳榔病蟲害問題日益嚴重。其中，由植原體（Phytoplasma）侵染引起的檳榔黃化?。ˋreca palm yellow leaf disease, AYLD）是當前嚴重危害檳榔的致死系統(tǒng)性病害之一，可造成檳榔產(chǎn)量急劇下降；該病于1981年首次出現(xiàn)在我國海南省屯昌縣[3]，目前在全省絕大部分的檳榔種植區(qū)發(fā)生為害[4-5]。據(jù)不完全統(tǒng)計，每年因黃化病為害所造成的經(jīng)濟損失達20億元以上，嚴重影響海南省農(nóng)民脫貧致富和農(nóng)村經(jīng)濟增長[6]。因此，檳榔黃化病的防控是當前迫切需要解決的產(chǎn)業(yè)問題。

阻斷由人為因素介導的植物病害傳播途徑是防控的關鍵手段之一，而人為因素介導的傳播方式有感病種苗調(diào)動[7]、人工嫁接傳播[8-9]及摩擦創(chuàng)傷傳播[10]等。然而，在檳榔黃化病方面，攜帶植原體的檳榔種果出苗后植株是否仍存在植原體，且采摘工具在感病檳榔上采果后，金屬表面殘留汁液是否攜帶植原體，目前尚未證實。因此，本研究采用熒光定量PCR技術，待攜帶植原體的檳榔種果出苗后對其根、假莖及葉進行植原體檢測，并對苗圃幼苗及采摘工具表面進行植原體檢測，初步明確檳榔黃化病種果種苗的傳播及其采摘工具的帶毒情況，為檳榔黃化病的防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料 供試檳榔果（9個）采自儋州市蘭洋鎮(zhèn)田間表現(xiàn)黃化病癥狀的檳榔成熟果實；苗圃幼苗葉片樣品分別采自澄邁縣加樂鎮(zhèn)（10份）、定安縣嶺口鎮(zhèn)東升農(nóng)場（10份）及文昌市南陽鎮(zhèn)南陽農(nóng)場（10份），幼苗為12月齡，苗圃均為在售狀態(tài)且幼苗無癥狀；5年生感染植原體且?guī)в谢ò臋壚疲?株），種植于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院椰子研究所基地的隔離網(wǎng)室；檳榔采摘使用的割刀1把。

1.1.2 主要試劑與儀器 主要試劑：植物基因組DNA提取試劑盒、高效口腔拭子基因組DNA提取試劑盒、2×Taq PCR mix及實時熒光定量PCR試劑盒購于天根生物科技（北京）有限公司。主要儀器：5810R離心機、1～1 000 μL移液器、GD120恒溫水浴鍋及QuantStudio3 Real-time定量PCR儀等。

1.2 方法

1.2.1 檳榔病果出芽后植原體檢測 參照植物基因組DNA提取試劑盒說明書，進行檳榔種果內(nèi)皮DNA提取，參照孟秀利等[11]的檳榔黃化植原體巢氏PCR檢測方法進行植原體檢測，將PCR擴增結(jié)果送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序；將植原體呈陽性的種果種植于花盆（土壤已121℃滅菌20 min），并置于高密度隔離網(wǎng)（200目）中，室內(nèi)日常栽培管理；待出苗且幼苗長出兩片葉后，參照植物基因組DNA提取試劑盒說明書對幼苗葉片、假莖及根進行DNA提取；使用熒光定量PCR檢測方法（熒光定量PCR引物探針組合另作發(fā)表），參照實時熒光定量PCR試劑盒說明書，反應體系（20 μL）：2×SuperReal PreMix（Probe）10 μL，正反向引物（10 μmol/L）各0.6 μL，熒光探針（10 μmol/L）0.4 μL，DNA模板2 μL，50×ROX Reference Dye3 0.2 μL，RNase-Free ddH2O 6.2 μL。實時熒光定量PCR反應程序參照說明書：95℃預變性 15 min；95℃變性3 s，60℃退火/延伸30 s，45個循環(huán)。健康樣品為陰性對照，無菌水為空白對照，每株苗重復檢測3次。

1.2.2 苗圃檳榔幼苗的植原體檢測 參照植物基因組DNA提取試劑盒說明書，進行苗圃檳榔幼苗葉片的DNA提取，參照1.2.1方法中的熒光定量PCR檢測方法進行植原體檢測。健康樣品為陰性對照，無菌水為空白對照，每份樣品重復檢測3次。

1.2.3 檳榔采摘工具表面殘留汁液的植原體檢測模擬田間采果的方式，在花苞柄處用割刀割5次，使用脫脂棉擦拭割刀上的汁液，將脫脂棉置于2 mL離心管內(nèi)，參照高效口腔拭子基因組DNA提取試劑盒說明書，提取割刀上殘留檳榔汁液的DNA，共模擬采果3次；參照1.2.1中的熒光定量PCR檢測方法進行植原體檢測，健康樣品為陰性對照，無菌水為空白對照，每份樣品重復3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 檳榔種果種苗植原體檢測

在種植前對9個檳榔種果進行巢氏PCR植原體檢測，僅4份種果表現(xiàn)植原體陽性（圖1），分別為4、5、7、及9號種果，擴增結(jié)果測序比對均為植原體。將陽性的種果種植于無菌土并置于高密度隔離網(wǎng)中，其中3份種果出芽，即4、5及9號種果，待成苗長出兩片葉后，采用熒光定量PCR技術對幼苗葉、假莖及根進行植原體檢測，如圖2～4所示，3份幼苗葉、假莖及根均檢測出植原體陽性，健康和空白對照未檢測出植原體。由此表明，攜帶植原體的檳榔種果出苗后，植原體在植株體內(nèi)呈系統(tǒng)性擴散。

圖1 檳榔種果種植前巢氏PCR植原體檢測

圖2 檳榔種果出苗后葉片熒光定量PCR植原體檢測

圖3 檳榔種果出苗后假莖熒光定量PCR植原體檢測

圖4 檳榔種果出苗后根部熒光定量PCR植原體檢測

2.2 苗圃幼苗的植原體檢測

使用熒光定量PCR檢測技術，對3個苗圃隨機采集的30份幼苗樣品進行植原體檢測，如表1所示，30份苗圃幼苗有8份檢測為植原體陽性。結(jié)果表明，苗圃中有部分的幼苗攜帶植原體，現(xiàn)市場上出售的幼苗存在檳榔黃化病擴散的風險。

表1 苗圃幼苗的植原體檢測結(jié)果

2.3 采摘工具表面的植原體檢測

通過模擬采果的方式，使用采摘工具對感染植原體檳榔花苞短柄進行切割，對采摘工具表面所殘留的檳榔汁液進行植原體檢測，如圖5所示，3份樣品均檢測出植原體陽性，健康和空白對照未檢測出植原體，表明利用采摘工具對感病植株進行采果后，金屬表面仍存在植原體，其殘留的感病檳榔汁液可能增加檳榔黃化病傳播的風險。

圖5 采摘工具表面殘留汁液的熒光定量PCR植原體檢測

3 討論

關于種傳病害的研究，在植物病毒方面，瓠瓜感染黃瓜綠斑駁花葉病毒(Cucumber green mottle mosaic virus，CGMMV)后，子一代150粒種子中傳毒率為84%，子二代種傳率為2%[12]。梁智玲等[13]使用收獲的攜帶小西葫蘆綠斑駁花葉病毒（Zucchini green mottle mosaic virus,ZGMMV）的葫蘆、西瓜和甜瓜種子，室溫放置10個月后播種仍具有傳毒能力，種傳率為1%。在植原體病害方面，無性繁殖材料和有性繁殖材料均可傳播植原體[14]。前人研究發(fā)現(xiàn)，云南省臨滄市的甘蔗白葉?。⊿ugarcane white leaf, SCWL）主要由蔗種傳播，5個品種的平均病株率11.7%～27.7%、宿根平均病株率23.6%～72.9%[15]；由于大部分蔗農(nóng)忽視甘蔗種莖質(zhì)量的重要性，缺乏對帶毒種莖危害的認識，導致白葉病疫情難以防控[16]。在本研究中，3顆經(jīng)鑒定的帶毒種果在隔離情況下種植，從3株幼苗的根、假莖及葉中均檢測到植原體，說明檳榔黃化病植原體可隨種果出苗，在植株體內(nèi)呈系統(tǒng)性分布，對于種果、種苗持續(xù)帶毒時間及種苗是否可多代傳播，將作進一步驗證。另外，本研究在3個不同市縣苗圃共采集的30份樣品存在部分幼苗攜帶植原體，因此，帶毒種苗調(diào)運將增加檳榔黃化病的傳播風險。在機械傳播方面，Coutts等[17]研究發(fā)現(xiàn)，小西葫蘆黃花葉病毒（zucchini yellow mosaic virus，ZYMV）可通過污染的刀片傳播；大多數(shù)植物細菌性病害也可通過刀口創(chuàng)傷傳播[18]。目前關于植原體機械傳播的報道較少，本研究在采摘工具表面殘留的檳榔汁液中檢測到植原體，關于采摘工具是否會對檳榔產(chǎn)生交叉感染、需要多少含量植原體才能感染，將作進一步研究。

檳榔黃化病是一種毀滅性病害，類似的植物毀滅性病害防控之鑒，如柑橘黃龍?。–itrus Huanglongbing，HLB），前人提出，“三板斧”措施中，應用無病種苗是當前有效的防控技術措施之一[19]。目前針對檳榔黃化病的防治尚未有特效藥，前人提出了“一養(yǎng)、二誘、三調(diào)、四治、五除”的檳榔黃化“五板斧”防控措施[20]。因此，就本研究結(jié)果提出相關建議：（1）制定嚴格的種苗生產(chǎn)許可審批制度，對種子來源嚴格管控，嚴禁使用疫區(qū)種果育苗，母株定期檢測，確保種子來源健康；（2）合理布局育苗圃，嚴禁在發(fā)病區(qū)設立育苗圃，做好育苗圃的病害防控設施，如防蟲網(wǎng)隔離；（3）定期對種苗進行黃化病抽樣檢測，尤其在出苗前要抽樣檢測，避免苗期無癥狀導致帶毒幼苗流入檳榔園；（4）加大宣傳對采摘工具的消毒處理，提高果農(nóng)對檳榔黃化病的防范意識；（5）加大科研投入，鼓勵相關的科研單位和企業(yè)參與檳榔種質(zhì)資源的收集、選育工作，采用雜交育種、分子標記輔助育種及基因編輯技術等加快抗、耐病品種的選育進度，確保檳榔產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展。