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    番茄果皮顏色的基因功能標(biāo)記開發(fā)及色差儀參數(shù)相關(guān)分析

    2022-02-03 02:49:26蔡錦玲姚文陳品品藍(lán)波妙林濤
    熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué) 2022年11期
    關(guān)鍵詞:色差果皮種質(zhì)

    蔡錦玲 姚文 陳品品 藍(lán)波妙 林濤

    (泉州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所 福建泉州 362200)

    野生番茄經(jīng)過幾百年的馴化已成為受世人喜愛的經(jīng)濟(jì)蔬菜之一[1]。番茄果實(shí)顏色是重要的外觀品質(zhì)性狀之一,果實(shí)越紅其營養(yǎng)品質(zhì)越好,在鮮食或加工方面更受市場(chǎng)的歡迎[2]。果實(shí)顏色由果皮和果肉顏色共同作用,其中果肉顏色受多基因控制,而果皮顏色的分子遺傳機(jī)制相對(duì)簡(jiǎn)單,但目前針對(duì)番茄果皮顏色開發(fā)分子標(biāo)記和精準(zhǔn)測(cè)量及分類方法的報(bào)道仍然較少,不利于果皮顏色分子選擇育種工作的開展。開發(fā)新的基因功能標(biāo)記并使用色差儀快速精準(zhǔn)地測(cè)量果皮顏色,為番茄果皮顏色的分子標(biāo)記輔助選擇育種提供技術(shù)支持,對(duì)加快番茄果實(shí)色澤的選育進(jìn)程具有重要意義。

    番茄果實(shí)顏色豐富,有紅色、粉色、黃色、綠色、紫色和橙色等[3]。果肉顏色受多個(gè)基因的控制,在類胡蘿卜素和花青素代謝途徑中,因r、nor、Gr、Cnr、Nr、hp、t、Del、Aft、atv、Abg等的突變或滲入使得番茄果實(shí)呈現(xiàn)出多種顏色[4-6]。番茄果皮顏色相對(duì)簡(jiǎn)單和易于分組,一般可分為有色和無色透明果皮2種,有色果皮對(duì)無色果皮呈顯性作用,受基因SIMYB12控制[7-8],在果實(shí)發(fā)育過程中,因SIMYB12基因無法表達(dá)而不能在果皮中積累類黃酮,從而使成熟果實(shí)的果皮為無色透明,但果皮無色透明的番茄風(fēng)味和口感更好。當(dāng)SIMYB12基因正常表達(dá)時(shí),成熟果實(shí)的果皮表現(xiàn)為有色,更耐儲(chǔ)藏和運(yùn)輸。

    果皮顏色的鑒定主要有直觀鑒定法或儀器測(cè)定法。直觀鑒定法,是經(jīng)典且使用方便、基礎(chǔ)簡(jiǎn)單的測(cè)色方法,僅適用易于分類顏色的分級(jí)工作,但植物種皮顏色變異范圍極為廣泛,多呈連續(xù)性分布,直觀鑒定法易受人為因素的影響,容易忽略一些中間的過渡色[9],不利于顏色的精確測(cè)量、分類和量化分析,儀器測(cè)定法是指通過運(yùn)用儀器(通常是色差儀)將顏色轉(zhuǎn)為精準(zhǔn)的數(shù)值,使顏色數(shù)值化、具體化和可視化,操作簡(jiǎn)單、耗時(shí)短,能夠?qū)︻伾珜?shí)現(xiàn)更精準(zhǔn)的測(cè)量和分類[10]。目前色差儀在許多作物的果皮顏色或者果色測(cè)量上均有應(yīng)用,如在櫻桃番茄[11]、黃瓜[12]和辣椒[13-14]等的應(yīng)用。

    由于生活品質(zhì)的提高,市場(chǎng)上對(duì)無色透明果皮紅色果肉的粉果番茄需求不斷增加,而目前應(yīng)用于番茄果皮顏色的功能標(biāo)記及精準(zhǔn)測(cè)量的研究相對(duì)較少。祝光濤[15]研究發(fā)現(xiàn),在粉果番茄SIMYB12基因起始密碼子上游4 kbp處存在大小為603 bp的序列缺失,會(huì)影響基因的結(jié)構(gòu)和功能,對(duì)果皮顏色造成一定的影響。因此,本研究就該位點(diǎn)設(shè)計(jì)與番茄果皮顏色相對(duì)應(yīng)的分子功能標(biāo)記,并利用30份不同類型的番茄種質(zhì)資源進(jìn)行驗(yàn)證;對(duì)色差儀的Lab和Ch測(cè)量值與果皮顏色相關(guān)性進(jìn)行分析,快速準(zhǔn)確地區(qū)分不同果色番茄的果皮顏色,探索不同果皮顏色的分類閾值。雖然SIMYB12基因不同單倍型對(duì)果皮顏色的影響已有報(bào)道[15-16],但通過設(shè)計(jì)分子功能標(biāo)記對(duì)不同的大果番茄和櫻桃番茄種質(zhì)資源進(jìn)行鑒定和利用尚未見報(bào)道。本研究基于SIMYB12基因上對(duì)果皮顏色有影響的缺失位點(diǎn),開發(fā)可用于瓊脂糖電泳并且重復(fù)性好的分子功能標(biāo)記,并利用色差儀實(shí)現(xiàn)快速準(zhǔn)確的果皮顏色分類,為番茄果皮顏色的分子輔助選擇育種和表型鑒定奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 試材 選擇泉州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所收集的30份番茄種質(zhì)資源為供試材料,包括櫻桃番茄28份(其中黃色櫻桃番茄3份、紫色櫻桃番茄2份、紅色櫻桃番茄23份)和紅色大果番茄2份,命名從編號(hào)P1~P30,果型和果實(shí)顏色如圖1所示。

    圖1 三十份番茄種質(zhì)資源的果型和顏色

    1.1.2 試劑和儀器 分子實(shí)驗(yàn)試劑耗材均購自北京索萊寶科技有限公司;分子功能標(biāo)記引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成;INFINITE 200 PRO酶標(biāo)儀為Tecan公司生產(chǎn);水平電泳儀、Universal Hood PCR儀、GelDoc凝膠成像系統(tǒng)為BIO-RAD公司生產(chǎn);色差儀為漢潽公司生產(chǎn)的HP-C220精密色差儀。

    1.2 方法

    1.2.1 DNA提取及濃度測(cè)試 參照Saghai- Maroof等[17]方法,采用CTAB法提取番茄幼葉基因組總DNA。DNA的濃度使用酶標(biāo)儀進(jìn)行測(cè)試。根據(jù)測(cè)定結(jié)果,添加TE使得各試驗(yàn)材料的DNA濃度在50~100 ng/μL。

    1.2.2 果皮顏色SIMYB12基因分子功能標(biāo)記設(shè)計(jì) 祝光濤[15]基于番茄參考基因組SL2.40版本的研究結(jié)果顯示,番茄果皮顏色基因SIMYB12在1號(hào)染色體的SL2.40ch01: 70 935 936-70 938 394 bp上,在其上游4 kbp的位置上存在著603 bp的缺失。目前番茄參考基因組已更新到SL4.0版本,依據(jù)SIMYB12基因的最新注釋信息,從NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)網(wǎng)站下載番茄的最新組裝基因組,通過序列比對(duì)確定該基因和缺失片段的位置,并提取基因及其上下游10 kbp的序列區(qū)域(SL4.0ch01: 71 312 725-71 326 073 bp),用Oligo 7軟件(http://www.oligo.net/downloads.html)于缺失603 bp的兩側(cè)適當(dāng)位置進(jìn)行引物設(shè)計(jì),設(shè)計(jì)擴(kuò)增產(chǎn)物的大小滿足于在瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測(cè);接著將設(shè)計(jì)完成的引物在NCBI上與番茄的全基因組進(jìn)行Primer-Blast比對(duì),確定引物的特異性,篩選合格的引物交由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

    1.2.3 PCR擴(kuò)增及電泳檢測(cè) PCR反應(yīng)體系(15 μL):模板DNA 1 μL,10×buffer 1.5 μL,dNTPs 0.6 μL,前后引物各0.6 μL,Taq DNA聚合酶0.3 μL,ddH2O 10.4 μL。反應(yīng)在艾本德Universal Hood PCR儀上進(jìn)行。

    PCR反應(yīng)程序:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s,58.6℃退火30 s,72℃延伸90 s,35個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后4℃保存。為了確定不同引物最適合的退火溫度,不同引物PCR退火溫度均依據(jù)梯度結(jié)果進(jìn)行調(diào)整,梯度溫度范圍為43~59℃。

    瓊脂糖凝膠電泳:DNA擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠添加1%的gel red核酸染料進(jìn)行電泳,置于伯樂GelDoc凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照。統(tǒng)計(jì)各樣本的擴(kuò)增條帶,大片段帶型記為1,小片段帶型記為3,雜合帶型記為2,缺失數(shù)據(jù)記為0。

    1.2.4 果皮顏色色差儀測(cè)量 隨機(jī)選擇充分成熟番茄果實(shí),沿果面赤道一周均勻取3個(gè)點(diǎn),用色差儀測(cè)得L、a、b、C和h的數(shù)值后取平均值。每份材料測(cè)定3個(gè)果實(shí),每個(gè)果實(shí)重復(fù)測(cè)定3次。色差儀的5個(gè)測(cè)量值具有不同的涵義:L代表黑白通道,0表示黑色,100表示白色。a代表紅綠通道,a>0表示顏色偏紅,a<0表示顏色偏綠。b代表黃藍(lán)通道,b>0表示顏色偏黃,b<0表示顏色偏藍(lán)。C值反映色彩飽和度或純粹度,色度越大,顏色越鮮艷;h值為色調(diào)角,反映紅綠藍(lán)3個(gè)基本色及其之間的過渡顏色,0°表示純紅色,120°表示純綠色,240°表示純藍(lán)色。

    1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 數(shù)據(jù)的整理、分析和圖形繪制采用開源工具R(4.0.2,https://www.r-project.org/)完成。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 供試樣品DNA質(zhì)量檢測(cè)

    使用酶標(biāo)儀對(duì)提取的番茄種質(zhì)DNA進(jìn)行快速檢測(cè),結(jié)果(表1)表明,樣品濃度OD260nm/OD280nm范圍在1.81~1.99,比值小于1.9的樣品10份,比值大于1.9的樣品20份,平均值為1.92,可見供試的30份番茄種質(zhì)DNA提取質(zhì)量均滿足后續(xù)常規(guī)PCR擴(kuò)增。

    表1 三十份供試番茄種質(zhì)資源DNA的質(zhì)量

    2.2 功能標(biāo)記的設(shè)計(jì)及驗(yàn)證

    從NCBI網(wǎng)站下載最新的番茄基因組DNA序列,通過序列比對(duì)定位缺失的603 bp位置(圖2)。利用Oligo 7設(shè)計(jì)引物,基于基因SIMYB12上游缺失序列的區(qū)域設(shè)計(jì)的產(chǎn)物擴(kuò)增片段大小在200~2 000 bp,該標(biāo)記適合在瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測(cè),并且經(jīng)Oligo 7軟件檢驗(yàn)可知,其無發(fā)夾、引物二聚體等次級(jí)結(jié)構(gòu),所以設(shè)計(jì)的引物理論可行。

    圖2 缺失位置及A-10功能標(biāo)記的序列信息

    本研究基于SIMYB12基因共設(shè)計(jì)了16對(duì)引物(表2):3對(duì)引物(A-2、A-3和A-7)的擴(kuò)增產(chǎn)物未包括缺失的序列,擴(kuò)增產(chǎn)物的片段大小無差異,不可用于區(qū)分缺失的位點(diǎn);有5對(duì)引物(A-8、A-9、A-11、A-12和A-13)位于缺失內(nèi),可單顯性擴(kuò)增出缺失序列,為顯性標(biāo)記引物,除A-13擴(kuò)增片段大、效果較差,其他均能準(zhǔn)確地判斷出果皮是否有色,但無色透明果皮和缺失數(shù)據(jù)無法區(qū)分;有8對(duì)(A-1、A-4、A-5、A-6、A-10、A-14、A-15和A-16)跨越缺失區(qū)域的引物,其中4對(duì)引物(A-5、A-6、A-15和A-16)擴(kuò)增產(chǎn)物偏大、效果較差,另外4對(duì)引物(A-1、A-4、A-10和A-14)可以共顯性標(biāo)記出缺失和非缺失2種基因型。由于缺失區(qū)域的GC含量偏低(A-10產(chǎn)物的GC含量為23%),導(dǎo)致PCR擴(kuò)增困難,常規(guī)的反應(yīng)體系和退火溫度在該區(qū)域經(jīng)常無法擴(kuò)增。利用P1(千禧,無色果皮)、P9(夏日陽光,純合有色果皮)、P5(F1雜合,有色果皮)3個(gè)材料作為功能標(biāo)記測(cè)試的供試材料,通過不同的退火溫度測(cè)試4對(duì)共顯性標(biāo)記,A-10的擴(kuò)增效果最好,最適合的退火溫度為58.6℃,最終選取A-10作為SIMYB12基因的分子功能標(biāo)記(圖3)。

    表2 分子功能標(biāo)記的編號(hào)及序列信息

    圖3 引物A-10不同退火溫度電泳結(jié)果

    2.3 番茄種質(zhì)資源的分子鑒定

    利用A-10分子功能標(biāo)記對(duì)30份種質(zhì)資源進(jìn)行基因型鑒定(圖4)。結(jié)果表明,30份番茄種質(zhì)資源中有18份(P1-P4、P10、P13、P16、P18、P19、P21-25、P27-P30)擴(kuò)增出約287 bp的特異性條帶,為純合隱性的缺失基因型,分子鑒定其果皮為無色透明果皮;3份材料(P9、P17和P20)擴(kuò)增出約890 bp的條帶,為純合顯性基因型,分子鑒定其果皮為有色果皮;還有9份(P5~P8,P11~P12,P14~P15,P26)同時(shí)擴(kuò)增出287和890 bp的條帶,說明控制果皮顏色的基因位點(diǎn)處于雜合的狀態(tài),為雜合基因型,分子鑒定為有色果皮。

    圖4 供試番茄材料A-10分子功能標(biāo)記電泳檢測(cè)

    2.4 果皮顏色測(cè)定及分析

    利用色差儀采集30份番茄種質(zhì)資源果實(shí)顏色的數(shù)據(jù),獲得L、a、b、C和h測(cè)量值。Lab和LCh代表2個(gè)顏色空間,可以相互轉(zhuǎn)化。通過對(duì)果皮顏色在這兩個(gè)顏色空間進(jìn)行分析,最終使用三維坐標(biāo)對(duì)Lab進(jìn)行分析(圖5-A),將b≥45的果分類為有色果皮,b<45的果歸類為透明果皮;Ch值采用二維坐標(biāo)分析(圖5-B),將色彩飽和度C≥60的分類為有色果皮,2種數(shù)據(jù)分析方法歸類結(jié)果一致。通過色差儀可以快速測(cè)出不同果皮顏色的測(cè)量值,并且使用Ch測(cè)量值即可區(qū)分大部分果皮的顏色。

    圖5 三十份種質(zhì)資源的果皮顏色分析

    2.5 功能標(biāo)記與目測(cè)法和儀器測(cè)試法的相關(guān)性分析

    供試的材料中(表3),通過目測(cè)鑒定法,共有無色透明果皮18份,有色果皮12份;依據(jù)分子功能標(biāo)記的鑒定,隱性純合的無色透明果皮材料18份,有色果皮12份,其中顯性純合材料3份,雜合材料9份;依據(jù)Ch測(cè)量值,色差儀鑒定法鑒定的透明無色果皮20份,有色果皮10份。分子功能標(biāo)記的基因型與目測(cè)法的果皮顏色完全相符(相符率:100 %),分子功能標(biāo)記的基因型與Ch鑒定法鑒定的果皮顏色相符的有28份(相符率93.3%),不相符的2份(6.67%),不相符的材料為P7和P8。P7和P8為紫色番茄,在SIMYB12基因的缺失位點(diǎn)上為雜合型,果皮為有色果皮,但由于花青素含量高,呈現(xiàn)紫黑色,故色差儀測(cè)得其顏色飽和度C值及黃綠色b值較低。

    表3 三十份番茄種質(zhì)資源分子鑒定法與目測(cè)鑒定法和儀器鑒定法的比較分析

    3 討論與結(jié)論

    在SIMYB12基因上游區(qū)域存在著影響功能的603 bp缺失序列[15-16],是設(shè)計(jì)InDel分子功能標(biāo)記的理想?yún)^(qū)域。王仁漢等[18]參照祝光濤[15]設(shè)計(jì)的InDel分子標(biāo)記,對(duì)32份普通番茄材料進(jìn)行驗(yàn)證,有2份無法擴(kuò)增,并且對(duì)16份櫻桃番茄進(jìn)行檢測(cè),其準(zhǔn)確率為62.5%。筆者在使用該InDel標(biāo)記時(shí),也容易出現(xiàn)無法擴(kuò)增的情況。經(jīng)過序列分析,PCR反應(yīng)無法擴(kuò)增是該缺失區(qū)域的GC含量偏低所導(dǎo)致。因此,本研究的主要目的是在該位點(diǎn)重新設(shè)計(jì)新的分子功能標(biāo)記,并優(yōu)化其PCR反應(yīng)體系,以期提高其檢出率和準(zhǔn)確性。該缺失區(qū)域的GC含量偏低,約為23%,PCR產(chǎn)物擴(kuò)增較難,本研究設(shè)計(jì)的A-10分子功能標(biāo)記,最初利用15 μL常規(guī)的反應(yīng)體系也經(jīng)常出現(xiàn)材料無法擴(kuò)增的情形,后通過增加dNTPs的濃度到0.6μL,并嘗試調(diào)整不同的退火溫度。在使用退火溫度53℃時(shí),雖然其結(jié)果的正確率提高到66.7%,但由于退火溫度較低,容易出現(xiàn)較多的副帶,產(chǎn)生假陽性的雜合帶型。最后通過調(diào)整退火溫度為58.6℃,使A-10分子功能標(biāo)記檢測(cè)準(zhǔn)確性提高到100%,解決缺失區(qū)域擴(kuò)增困難的問題。

    紫色番茄P7和P8由于受到花青素代謝途徑合成基因的影響,花青素在其果皮上的積累,因此果實(shí)顏色呈現(xiàn)出紫色[19]。除了紫色番茄果皮顏色的分子檢測(cè)與色差儀采集數(shù)據(jù)存在不一致的情況外,其它顏色的番茄檢測(cè)結(jié)果均相符。本試驗(yàn)供試的2份紫色番茄材料的果皮為有色果皮,但色差儀的Lab或者Ch測(cè)量值均在無色透明果皮的標(biāo)定范圍內(nèi),是花青素使果實(shí)呈現(xiàn)紫色[20],紫色為紅色色相,導(dǎo)致色差儀顯示其b值偏向紅色;測(cè)量值小于45,或C值小于60,判斷為無色。在紫色番茄果皮顏色的測(cè)量中,色差儀的有色和無色果皮的閾值范圍,可使用有色果皮與無色果皮的紫色番茄材料作進(jìn)一步的測(cè)定和分類。但因目前本課題組收集的紫色番茄種質(zhì)資源僅有有色果皮的材料,故不能完成這部分對(duì)比試驗(yàn)。因此,對(duì)于紫色番茄的果皮顏色測(cè)定分類僅能通過傳統(tǒng)的目測(cè)鑒定法來完成。

    傳統(tǒng)的番茄果皮顏色一般通過目測(cè)法簡(jiǎn)單進(jìn)行區(qū)分和歸類,但是果皮顏色變異范圍極為廣泛,多呈連續(xù)性分布,直觀鑒定法易受人為因素的影響,不利于顏色的精確測(cè)量和分類,容易忽略一些中間的過渡;而儀器測(cè)定法中使用的色差儀自帶光源,不易受外界環(huán)境條件變化影響,能準(zhǔn)確測(cè)量有細(xì)微差別的2種顏色,而且具有操作便利、無損的特點(diǎn)。通過比較目測(cè)法和色差儀鑒定法測(cè)定結(jié)果與基因型的相符度可知,除了紫色番茄存在基因型與儀器測(cè)定法不一致外,其余的供試番茄材料中目測(cè)法和儀器測(cè)定法測(cè)定結(jié)果與基因型的檢測(cè)結(jié)果均一致,表明儀器測(cè)定法可用于非紫色番茄的測(cè)定,且能夠更精準(zhǔn)地測(cè)定不同果皮的顏色并進(jìn)行歸類。由于SIMYB12基因存在著多個(gè)突變的位點(diǎn),不同的單倍型對(duì)果皮顏色的影響不盡相同,本研究?jī)H在603 bp缺失位點(diǎn)開發(fā)的功能標(biāo)記A-10雖不能完全代表不同的果皮顏色,但可用于大部分種質(zhì)資源的鑒定。因此,在針對(duì)番茄果皮顏色的分子標(biāo)記輔助育種方面,本研究結(jié)果具有一定的參考價(jià)值。

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