不同基因型的香蕉葉片結(jié)構(gòu)與褐緣灰斑病發(fā)生的相關(guān)性研究

殷曉敏 連子豪 劉永霞 王麗霞 陳弟 何應(yīng)對(duì)

（中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院?？趯?shí)驗(yàn)站/海南省香蕉遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 海南海口 571101）

香蕉是芭蕉科（Musaceae）芭蕉屬（MusaL.）單子葉植物，脈序?yàn)闄M出平行脈，側(cè)脈與中脈近乎垂直，而側(cè)脈之間近于平行，該葉片類型有利于病原菌的侵入與擴(kuò)展蔓延，使得香蕉褐緣灰斑?。⊿igatoka diasease of banana）成為一種常發(fā)性重要病害[1]，并且在全球范圍內(nèi)流行危害[2]，其病原致病菌為香蕉生球腔菌（Mycosphaerella musicolaJ. L. Mulder.）[2]。香蕉在抽穗期間至少要保存有7～8片青綠無(wú)病的功能葉片，在采收時(shí)仍保存有4～5片功能葉片，才能獲得預(yù)期的產(chǎn)量和保證的果實(shí)質(zhì)量[3]。在海南5—10月高溫多雨季節(jié)病害盛發(fā)，受害葉片面積常占葉片總面積的20%～60%，造成產(chǎn)量大減、果實(shí)品質(zhì)下降，嚴(yán)重時(shí)減產(chǎn)50%以上，同時(shí)造成農(nóng)藥使用量劇增，環(huán)境污染加劇[3]。

香蕉的完全葉片由葉鞘、葉柄和葉片組成，葉片內(nèi)部組織結(jié)構(gòu)組成為表皮，葉肉和葉脈，葉肉組織由柵欄組織和海綿組織組成。在表皮細(xì)胞覆有角質(zhì)層和氣孔，氣孔以一定間隔散布于整個(gè)葉片，表皮氣孔是氣體交換與水分蒸騰的主要通道，同時(shí)也是植物病原菌侵染植物的重要通道。關(guān)于葉片氣孔密度、氣孔形態(tài)特征與病害抗性關(guān)系在臍橙[4-5]、柑橘[6]、桉樹[7]、楊樹[8]、大豆[9]、蠶豆[10]、黃瓜[11]等作物上有相關(guān)報(bào)道。關(guān)于葉片組織結(jié)構(gòu)與抗病性關(guān)系在蘋果[12]、獼猴桃[13]、木薯[14]、桉樹[15]、油桐[16]、大豆[17]、向日葵[18]、苦瓜[19]等作物上開展過(guò)相關(guān)的研究。各報(bào)道得出植物對(duì)病原菌的抗性取決于葉片氣孔的多少及解剖結(jié)構(gòu)，但是氣孔與抗病性之間的關(guān)系，不同作物和不同病害的研究之間結(jié)論各異，無(wú)關(guān)或密切相關(guān)[20]。鑒于不同基因型香蕉受葉斑病危害程度不同，而對(duì)于香蕉氣孔、葉片組織結(jié)構(gòu)與病害發(fā)生的相關(guān)性尚未見報(bào)道，本研究以不同基因型香蕉種類為研究對(duì)象，通過(guò)葉片氣孔和形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)特征的比較，分析其與病情指數(shù)的相關(guān)性，以期尋找抗性鑒定初選指標(biāo)，為篩選抗病品種（系）節(jié)約時(shí)間和成本，為選育優(yōu)質(zhì)抗病新型香蕉品種（系）提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

于2021年5月在海南省儋州市寶島新村紅洋隊(duì)基地（N 19°53′30″，E 110°04′52″）開展試驗(yàn)。土壤質(zhì)地為磚紅壤土，pH 4.40，有機(jī)質(zhì)14.4 g/kg，全氮0.053%，全磷929.91 mg/kg，全鉀3.29%，堿解氮156.60 mg/kg，有效磷200.10 mg/kg，速效鉀332 mg/kg。氣候條件為熱帶濕潤(rùn)季風(fēng)氣候，年平均氣溫為23.5℃，光熱充足年，年均光照時(shí)數(shù)在2 100 h以上。雨量適中，年均降雨量1 800 mm，5—10月為雨季，占年雨量的80%，為香蕉褐緣灰斑病高發(fā)病期。

以貢蕉（Musaspp.，AA）的海貢蕉、HKXJ-1品種（系），香芽蕉（Musa acuminataL. Cavendish subgroup，AAA）的巴西蕉、紅香蕉品種，大蕉（Musa paradisiacaL.，AAB）的東莞中把大蕉、東莞高把大蕉品種，粉蕉（Musaspp. PisangAwak subgroup，ABB）的廣粉1號(hào)、西貢蕉品種，共計(jì)4種基因型8個(gè)品種（系）為供試材料，其中，HKXJ-1為香蕉供試品系，其余7個(gè)為香蕉供試品種。

香蕉褐緣灰斑病致病菌香蕉生球腔菌（Mycosphaerella musicolaJ. L. Mulder.）為本課題組田間自然分離保存。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在香蕉抽蕾期，以不同的品種（系）設(shè)定8個(gè)區(qū)組試驗(yàn)，每小區(qū)隨機(jī)調(diào)查20株，單株為試驗(yàn)重復(fù)，每株從頂葉向下調(diào)查10片葉，以香蕉褐緣灰斑病菌噴霧接種侵染為田間鑒定對(duì)象，記錄調(diào)查的總?cè)~片數(shù)、病葉數(shù)及病級(jí)，統(tǒng)計(jì)

發(fā)病率，計(jì)算病情指數(shù)[21]。病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)為[22]0級(jí)，無(wú)病斑；1級(jí)，病斑面積占整葉面積的5%以下；3級(jí)，病斑面積占整葉面積的6%～15%；5級(jí),病斑面積占整葉面積的16%～25%；7級(jí)，病斑面積占整葉面積的26%～50%；9級(jí)，病斑面積占整葉面積的50%以上。

1.2.2 組織觀察 葉片氣孔形態(tài)和氣孔密度的觀察和測(cè)定 在香蕉抽蕾期，取材方向盡量一致，從上至下第3個(gè)葉片，3次重復(fù)。采用 IAA 固定液固定后置于冰醋酸與過(guò)氧化氫各半的離析液中離析24～48 h，離析后分上、下表皮制片觀察。氣孔密度為在正置顯微鏡（NI/E）10倍鏡下14～16個(gè)視野氣孔數(shù)之和的每視野平均數(shù)[10]。計(jì)算葉片背面和腹面氣孔密度，測(cè)定氣孔長(zhǎng)度、寬度及保衛(wèi)細(xì)胞長(zhǎng)度、寬度。

葉片組織結(jié)構(gòu)的觀察和測(cè)定 用滅菌刀片切取大小為3 mm×6 mm葉片組織塊，用鑷子將其放入裝有清水的培養(yǎng)皿中，作為切片材料備用；采用改進(jìn)后的徒手切片法[23]，利用手搖式冷凍超薄切片機(jī)（CM1950）將試驗(yàn)材料置于冰臺(tái)上進(jìn)行切片。在正置顯微鏡（NI/E）下觀察葉片厚度、柵欄組織厚度、海綿組織厚度、背部和腹部表皮厚度及角質(zhì)層厚度。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析 利用Excel 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，SPSS 23.0軟件進(jìn)行方差多重比較分析，以及病情指數(shù)與氣孔密度、組織結(jié)構(gòu)的相關(guān)性分析[9,12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 香蕉葉片組織結(jié)構(gòu)形態(tài)學(xué)觀察

2.1.1 氣孔形態(tài)學(xué)的觀察 氣孔是氣體交換與水分蒸騰的主要通道，也是植物病原菌侵染植物的重要通道。從橫切片來(lái)看，氣孔以一定間隔分散于葉片腹部表皮和背部表皮，是由兩個(gè)半月形保衛(wèi)細(xì)胞構(gòu)成，保衛(wèi)細(xì)胞在氣孔兩側(cè)中央膨脹。不同品種的病情指數(shù)、背部氣孔密度（個(gè)/mm2）、腹部氣孔密度（個(gè)/mm2）、氣孔長(zhǎng)度（μm）、氣孔寬度（μm）和保衛(wèi)細(xì)胞寬度（μm）差異顯著（表1）。其中病情指數(shù)較低的是紅香蕉和廣粉1號(hào)，分別為7.05和8.09，較為抗??；其次是HKXJ-1和西貢蕉，病情指數(shù)分別是12.15和13.43，較為耐病。病情指數(shù)較高的為東莞高把大蕉和巴西蕉，分別是30.97和31.32，較為感病。病情指數(shù)越低抗病性越強(qiáng)，抗病性從高到底依次為紅香蕉>廣粉1號(hào)>HKXJ-1>西貢蕉>東莞中把大蕉>海貢蕉>東莞高把大蕉>巴西蕉。葉片背部氣孔密度最大是紅香蕉，為328.45個(gè)/mm2，其次是HKXJ-1，為298.93個(gè)/mm2，再次是東莞中把大蕉和巴西蕉，分別為203.51和114.23個(gè)/mm2。葉片腹部氣孔密度最大是紅香蕉，為98.75個(gè)/mm2；其次為西貢蕉和HKXJ-1，分別為72.88和70.37個(gè)/mm2；再次為東莞中把大蕉，為12.00個(gè)/mm2。氣孔寬度最大是HKXJ-1，為16.56 μm；其次為紅香蕉和東莞中把大蕉，分別為15.87和15.74 μm；最小是東莞高把大蕉，為13.46 μm。保衛(wèi)細(xì)胞寬度最大是西貢蕉，為33.49 μm；其次是HKXJ-1和海貢蕉，分別為31.58和30.75 μm；最小在紅香蕉，為24.67 μm。

表1 香蕉不同品種的葉片氣孔形態(tài)學(xué)指標(biāo)

2.1.2 葉片組織結(jié)構(gòu)的測(cè)定 不同品種葉肉組織間的葉片厚度、柵欄組織厚度、海綿組織厚度差異顯著（表2）。在葉片背部一側(cè)有海綿組織，為數(shù)層球狀或不規(guī)則的細(xì)胞稀疏連接，細(xì)胞間隙充分發(fā)達(dá)，在外部與氣孔相通，呼吸時(shí)進(jìn)行氣體交換。海綿組織厚度最大值在廣粉1號(hào)，為268.97 μm；其次是HKXJ-1和紅香蕉，分別為236.53和223.41 μm；最小在巴西蕉，為134.14 μm。在葉片腹面一側(cè)具有柵欄組織，為1層細(xì)胞，表面呈直角柱狀細(xì)胞，彼此稍微緊密相連，細(xì)胞間隙比較狹小，葉片柵欄組織細(xì)胞發(fā)達(dá)，能夠擴(kuò)大細(xì)胞表面積，擴(kuò)大與陽(yáng)光及空氣接觸面積，其光合作用效能也越大。柵欄組織厚度最大值廣粉1號(hào)，為63.82 μm；其次在西貢蕉東莞中把大蕉和HKXJ-1，分別為48.54和40.49 μm；最小在海貢蕉，為19.39 μm。葉片厚度最大是紅香蕉，為359.57 μm；其次為廣粉1號(hào)和HKXJ-1；分別為303.5和294.07 μm；最小在西貢蕉，為215.79 μm。

表2 香蕉不同品種的葉片組織結(jié)構(gòu)學(xué)指標(biāo)

2.2 香蕉葉片結(jié)構(gòu)形態(tài)學(xué)與病情指數(shù)的相關(guān)性分析

2.2.1 氣孔形態(tài)與病情指數(shù)相關(guān)性分析 用SPSS 23.0對(duì)病情指數(shù)、葉片氣孔形態(tài)各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)分析，得出各數(shù)據(jù)間的相關(guān)系數(shù)矩陣（表3）.結(jié)果表明，病情指數(shù)與氣孔密度、氣孔形態(tài)各項(xiàng)指標(biāo)的相關(guān)程度依次為背面氣孔密度>腹面氣孔密度>氣孔寬度>保衛(wèi)細(xì)胞寬度>氣孔長(zhǎng)度>保衛(wèi)細(xì)胞長(zhǎng)度。其中，氣孔各形態(tài)指標(biāo)間存在極顯著正相關(guān)，氣孔長(zhǎng)度與保衛(wèi)細(xì)胞長(zhǎng)度、氣孔寬度的相關(guān)系數(shù)分別為0.567和0.412。病情指數(shù)與氣孔長(zhǎng)度、氣孔寬度、保衛(wèi)細(xì)胞長(zhǎng)度和保衛(wèi)細(xì)胞寬度相關(guān)性不顯著，而病情指數(shù)與葉片背面氣孔密度、腹面氣孔密度呈極顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為–0.874和–0.757。另外，背面氣孔密度和腹面氣孔密度間呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.891，表明同一品種背面氣孔密度越多，腹面氣孔密度隨之增加，表明葉片氣孔密度越大，病情指數(shù)越低，抗病性越強(qiáng)。葉片腹面氣孔密度、背面氣孔密度可作為香蕉種質(zhì)抗病性鑒定的初選指標(biāo)。結(jié)合植株病情指數(shù)鑒定結(jié)果得出，紅香蕉抗病性最強(qiáng)，廣粉1號(hào)次之，巴西蕉抗病性最弱，抗病性順序依次為紅香蕉>廣粉1號(hào)>HKXJ-13>西貢蕉>東莞中把大蕉>海貢蕉>東莞高把大蕉>巴西蕉。

表3 香蕉葉片氣孔形態(tài)與病情指數(shù)的相關(guān)性

2.2.2 組織結(jié)構(gòu)與病情指數(shù)相關(guān)性分析 用SPSS 23.0對(duì)病情指數(shù)、葉片組織結(jié)構(gòu)各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析，得出各數(shù)據(jù)間的相關(guān)系數(shù)矩陣（表4）。結(jié)果表明，病情指數(shù)與葉片組織結(jié)構(gòu)各項(xiàng)指標(biāo)的相關(guān)程度依次為海綿組織厚度>葉片厚度>柵欄組織厚度>背部皮層厚度>腹部皮層厚度>角質(zhì)層厚度。其中病情指數(shù)與柵欄組織厚度、背部皮層厚度、腹部皮層厚度、角質(zhì)層厚度相關(guān)性不顯著，而與葉片厚度、海綿組織厚度呈極顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為–0.544和–0.591。另外，葉片厚度與海綿組織厚度間呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.550，表明海綿組織厚度和葉片厚度數(shù)值越高，病情指數(shù)越低，抗病性越強(qiáng)。因此抗病性最強(qiáng)分別為廣粉1號(hào)、HKXJ-1及紅香蕉。葉片厚度和海綿組織厚度也可作為香蕉種質(zhì)抗病性鑒定的輔助參考指標(biāo)。

表4 香蕉葉片組織結(jié)構(gòu)與病情指數(shù)的相關(guān)性

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

香蕉葉片扁平、薄而寬，由葉片、葉柄和葉鞘組成完全葉，葉片長(zhǎng)達(dá)2 m以上，為巨大葉型，有地下莖長(zhǎng)出的葉鞘，形成彼此重疊的地上莖。氣孔以一定間隔散布于整個(gè)葉片，一般是50～300個(gè)/mm2[24]。本研究發(fā)現(xiàn)，不同香蕉基因型葉片腹部氣孔密度為12～98個(gè)/mm2，背部氣孔密度為114～328個(gè)/mm2（表1），表明不同基因型香蕉種類葉片氣孔密度分布均較多，這一研究結(jié)果與旱地和濕地植物氣孔分布較少，中生植物氣孔分布較多的報(bào)道相一致[24]。關(guān)于氣孔密度與植物抗病性的相關(guān)性，許多學(xué)者持有不同的觀點(diǎn)。楊樹對(duì)黑斑病的抗病性[8]和華山松對(duì)皰銹病的抗病性研究[25]認(rèn)為，氣孔密度與抗病性不存在相關(guān)性。有研究結(jié)果指出，氣孔密度與抗病性呈負(fù)相關(guān)，如大豆對(duì)灰斑病抗性[9]、蠶豆對(duì)銹病抗病[10]和黃瓜對(duì)霜霉病抗[11]，表明抗病品種提供菌絲從氣孔侵入的機(jī)會(huì)少，也是抗病品種抵抗病菌侵入的第一結(jié)構(gòu)屏障。也有研究表明，獼猴桃葉片氣孔密度與潰瘍病抗性成正相關(guān)[13]，這一研究結(jié)果與本研究結(jié)果一致，葉片氣孔密度與不同基因型香蕉種類抗病性呈正相關(guān)，即氣孔密度越大，病情指數(shù)越低，抗病性越強(qiáng)。不同基因型香蕉種類病原菌侵染位置有所不同，香蕉背部氣孔密度顯著多于腹部表皮氣孔密度，其背部氣孔密度大優(yōu)點(diǎn)在于既利于減少葉片蒸騰作用，又利于氣體交換，這與蠶豆、桉樹葉片氣孔密度分布特點(diǎn)一致[7，10]，也契合了關(guān)于香蕉褐緣灰斑病在葉片病斑腹面產(chǎn)孢豐盛的報(bào)道[3]。

葉斑病潛育期較長(zhǎng)（1～2月），最長(zhǎng)的可達(dá)115 d，較老的葉片不容易受到侵染，第3片或第4片葉上看到的病痕，其實(shí)是它們剛展開時(shí)受到侵染的結(jié)果[3]。有報(bào)道指出，病原菌直接穿透寄主組織時(shí)，角質(zhì)層起到增強(qiáng)抗病性的作用[14]。本研究指出，葉片角質(zhì)層厚度與抗病性相關(guān)性不顯著，與木薯[14]的研究結(jié)果相一致；但海綿組織厚度與抗病性相關(guān)性不顯著，與木薯對(duì)細(xì)菌性枯萎病抗性[14]的研究結(jié)果不同。本研究結(jié)果表明，葉片厚度與海綿組織厚度相關(guān)性極顯著，因此，葉肉組織結(jié)構(gòu)與香蕉葉片葉斑病抗性的關(guān)系有待進(jìn)一步研究。

本研究以不同基因型香蕉種類為研究對(duì)象，通過(guò)葉片結(jié)構(gòu)特征比較，分析其與香蕉葉斑病抗病相關(guān)性。葉片背部氣孔密度增加，病情指數(shù)降低，抗病性增強(qiáng)。葉片海綿組織厚度和葉片厚度數(shù)值越高，病情指數(shù)越低，抗病性越強(qiáng)。綜上所述，結(jié)合病情指數(shù)田間鑒定結(jié)果，香蕉抗病性鑒定順序依次為紅香蕉>廣粉1號(hào)>HKXJ-1>西貢蕉>東莞中把大蕉>海貢蕉>東莞高把大蕉>巴西蕉。

3.2 結(jié)論

不同基因型香蕉葉片結(jié)構(gòu)特征存在著抗葉斑病的差異，葉片腹面氣孔密度、背面氣孔密度可作為葉斑病抗性的初步鑒定參考標(biāo)準(zhǔn)，葉片厚度、海綿組織厚度可作為抗病性鑒定的輔助參考指標(biāo)，為高抗品種的引種栽培，以及選育優(yōu)質(zhì)抗病新型香蕉品種（系）提供依據(jù)，同時(shí)將為篩選抗病品種節(jié)約大量的時(shí)間和成本。