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    重組人血小板生成素對(duì)凝血酶誘導(dǎo)血小板凋亡的調(diào)節(jié)作用

    2022-02-03 03:37:06周先桃李瑜沈陽王正華
    實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志 2022年23期
    關(guān)鍵詞:孵育線粒體血小板

    周先桃 李瑜 沈陽 王正華

    1武漢血液中心(武漢 430030);2湖北省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院(武漢 430015)

    在炎癥應(yīng)激、傷口愈合、膿毒癥等疾病的進(jìn)展中,患者極易出現(xiàn)“血小板減少癥”[1]。研究[2]顯示血小板凋亡是導(dǎo)致“血小板減少癥”中的關(guān)鍵事件。研究[3]顯示血小板的核糖體能合成B淋巴細(xì)胞瘤?xl(B cell lymphoma?xl,Bcl?xl)、Bcl?2同源拮抗劑/殺傷劑蛋白(Bcl?2 homologous antagonist/killer,Bak)等凋亡相關(guān)蛋白。YADAV等[4]研究顯示血小板的線粒體的形態(tài)與“血小板減少癥”病癥的進(jìn)展關(guān)系密切。血小板生成素(thrombopoietin,TPO)是血小板生成重要的調(diào)控因子。隨著生化技術(shù)的進(jìn)步,重組人血小板生成素(recombinant human TPO,rhTPO)的應(yīng)用成為研究熱點(diǎn)之一。有研究[5]顯示皮下注射rhTPO對(duì)腦腫瘤患兒化療所致血小板減少癥的預(yù)防效果較好,且不良反應(yīng)發(fā)生率低,但是有關(guān)rhTPO在血小板凋亡中的作用報(bào)道較少。凝血酶(thrombin,TMB)是一種血小板激動(dòng)劑,ROKA?MOIIA 等[6]研究報(bào)道 TMB 能明顯抑制血小板中細(xì)胞色素 C(cytochrome c,Cyt?c)的轉(zhuǎn)錄與表達(dá),升高活性氧(reactive oxygen species,ROS)的水平,誘導(dǎo)其凋亡。本研究旨在探討rhTPO對(duì)TMB誘導(dǎo)血小板凋亡的作用機(jī)制,以為藥物的推廣應(yīng)用提供可靠的事實(shí)數(shù)據(jù)。

    1 資料與方法

    1.1 一般資料分別收集10例健康成年男性的空腹靜脈血10 mL,血型均為O型,年齡(20.35±6.66)歲。本研究已獲取研究對(duì)象的知情同意書,并獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)的審核批準(zhǔn)(編號(hào):2021?1207?QV03)。

    1.2 試劑與儀器TMB購自美國Invitrogen公司,2′,7′?二氯熒光素二乙酸酯(2,7?dichlorodihydro?fluoresceindiacetate,DCDHF?DA)染色試劑盒購自美國 Sigma?Aldrich 公司,兔抗大鼠分裂蛋白1(mi?tochondrial fission 1 protein,F(xiàn)is?1)、融合蛋白 2(mi?tofusin2,Mfn 2)、動(dòng)力相關(guān)蛋白 1(dynamin?related protein 1,Drp?1)、視神經(jīng)萎縮蛋白 1(optic atrophy 1,Opa 1)、Cyt?c、Bcl?xl、Bak 抗體購自英國 Abcam公司。

    定量反轉(zhuǎn)錄?聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative reverse transcription?polymerase chain reaction,qRT?PCR)擴(kuò)增儀、BD FACSCalibur流式細(xì)胞儀(美國Bio?Rad公司),光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)。

    1.3 血小板的制備參照SHPAKOVA等[7]介紹的方法將獲取的空腹靜脈血與檸檬酸葡萄糖緩沖液以7∶1稀釋比例混合,加入適量抗凝劑,300 μg離心15 min,留取上層,即為富含血小板的血漿,再以1 500×g離心5 min,棄掉上清,以預(yù)制緩沖液將細(xì)胞沉淀重懸,再次以1 500×g離心5 min,棄掉上清,以改良的臺(tái)式緩沖液重懸細(xì)胞沉淀,獲得血小板懸液,加入適量的氯化鈣和氯化鎂,室溫下避光靜置1 h后,即洗滌血小板制備成功。

    1.4 實(shí)驗(yàn)分組[8]將制備的洗滌血小板懸液分組如下:Normal組:在1 mL的洗滌血小板中加1 μL生理鹽水孵育30 min后添加5 μL生理鹽水刺激;TMB組:在1 mL的洗滌血小板中加1 μL生理鹽水孵育30 min后添加5 μL的200 U/mL TMB刺激;rhTPO低、中、高劑量組(TMB+10/50/100 ng/mL rhT?PO)組:在1 mL的洗滌血小板中加1 μL的rhTPO(濃度為10/50/100 ng/mL)孵育30 min后添加5 μL的200 U/mLTMB刺激。

    1.5 血小板中線粒體的形態(tài)洗滌血小板的分組處理同1.4,在各組血小板接受TMB或生理鹽水刺激2 h后,按線粒體紅色熒光探針(MitoTracker Red CMXRos)染色試劑盒要求進(jìn)行染色,室溫下避光孵育30 min,中性甲醛固定,激光共聚焦顯微鏡觀察各組血小板中線粒體形態(tài)的改變,Image J圖像處理軟件統(tǒng)計(jì)分析細(xì)胞內(nèi)線粒體的完整性[9]。

    1.6 血小板的細(xì)胞的凋亡率實(shí)驗(yàn)分組同1.4,無菌操作臺(tái)上,加入200 μL的緩沖液,重懸后,加入5 μL膜聯(lián)蛋白V?異硫氰酸熒光素(Annexin V?FITC),室溫下避光孵育15 min,加入10 μL/碘化丙啶(PI),BD FACSCalibur流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)[10]。

    1.7 血小板中ROS的水平洗滌血小板的分組處理同1.4,在各組血小板接受TMB或生理鹽水刺激2 h后,添加適量DCDHF?DA染色液,37℃恒溫水浴鍋中避光孵育30 min,熒光顯微鏡下觀察,Image J圖像處理軟件統(tǒng)計(jì)分析視野中的綠色熒光強(qiáng)度均值[11]。

    1.8 血小板中相關(guān)基因的表達(dá)洗滌血小板的分組處理同1.4,在各組血小板接受TMB或生理鹽水刺激2 h后,按Trizol reagent試劑盒要求提取血小板中的總RNA,其完整性和濃度經(jīng)Q1AGEN RNeasy Mini Kit確定后,在逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明書的指導(dǎo)下合成cDNA,CFX96熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。以β?肌動(dòng)蛋白(β?actin)為參照物,目的基因的相對(duì)表達(dá)以 2?ΔΔCt進(jìn)行表示[12]。各基因的序列見表1。

    表1 各基因的引物序列Tab.1 Primer sequence of each gene

    1.9 血小板中Fis?1、Mfn 2、Drp?1、Opa 1、Cyt?c、Bcl?xl和Bak的表達(dá)常規(guī)提取樣本中的總蛋白,以50 μg進(jìn)行電泳,轉(zhuǎn)膜,封閉,加入一抗,孵育,加入二抗,化學(xué)發(fā)光后,顯影,掃描,統(tǒng)計(jì)分析各條帶的灰度值。

    1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 21.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用()進(jìn)行表示,多組間比較采用單因素方差分析,兩兩組間比較采用t檢驗(yàn),P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 血小板中線粒體分裂程度與Normal組相比,TMD組、rhTPO(低、中、高)組中血小板中完整線粒體的比例明顯下降,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=76.374,P<0.05),與TMD組相比,rhTPO(低、中、高)組中血小板中完整線粒體的比例明顯升高,并且具有明顯的劑量依賴性,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=53.129,P<0.05),見圖1。

    圖1 血小板中的線粒體分裂程度(MitoTracker Red CMXRos染色,×400)Fig.1 The comparison of the degree of mitochondrial fission in platelets(MitoTracker Red CMXRos staining,× 400)

    2.2 血小板的細(xì)胞的凋亡率與Normal組相比,TMD組、rhTPO(低、中、高)組血小板中的細(xì)胞凋亡率明顯升高,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=72.435,P<0.05);與TMD組相比,rhTPO(低、中、高)組血小板中的細(xì)胞凋亡率明顯降低,并且具有明顯的劑量依賴性,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=50.371,P< 0.05),見圖2。

    圖2 血小板中的細(xì)胞凋亡率Fig.2 The apoptosis rate in platelets

    2.3 血小板中ROS的水平與Normal組相比,TMD組、rhTPO(低、中、高)組血小板中ROS熒光強(qiáng)度明顯升高,ROS的水平明顯升高,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=47.028,P<0.05);與TMD組相比,rhTPO(低、中、高)組血小板中ROS熒光強(qiáng)度明顯降低,ROS的水平明顯下降,并且具有明顯的劑量依賴性,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=28.664,P<0.05),見圖3。

    圖3 血小板中ROS的水平(DCDHF?DA染色,×400)Fig.3 The comparison of the levels of ROS in platelets(DCDHF?DA staining,× 400)

    2.4 qRT?PCR檢測(cè)相關(guān)基因的表達(dá)與Normal組相比,TMD、rhTPO(低、中、高)組血小板中Opa1(F=10.124)、Bcl?xl(F=9.648)、Mfn2(F=9.771)的mRNA的表達(dá)明顯降低,F(xiàn)is?1(F=11.617)、Drp?1(F=9.258)、Cyt?c(F=10.035)和 Bak(F=9.884)的mRNA的表達(dá)明顯升高,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與TMD組相比,rhTPO(低、中、高)組血小板中 Opa1(F=7.229)、Bcl?xl(F=6.943)、Mfn2(F=6.872)的mRNA的表達(dá)明顯升高,F(xiàn)is?1(F=7.336)、Drp?1(F=6.058)、Cyt?c(F=6.948)和Bak(F=6.325)的mRNA的表達(dá)明顯降低,并且具有明顯的劑量依賴性,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖4。

    圖4 血小板中 Fis?1、Mfn 2、Drp?1、Opa 1 、Cyt?c、Bcl?xl和Bak的mRNA的表達(dá)Fig.4 The mRNA expression of Fis?1,Mfn 2,Drp?1,Opa 1,Cyt?c,Bcl?xl and Bak in platelets

    2.5 洗滌血小板中 Fis?1、Mfn 2、Drp?1、Opa 1、Cyt?c、Bcl?xl和 Bak 的表達(dá)與 Normal組相比,TMD、rhTPO(低、中、高)組血小板中 Opa1(F=11.032)、Bcl?xl(F=10.255)、Mfn2(F=10.682)的表達(dá)明顯降低,F(xiàn)is?1(F=11.967)、Drp?1(F=9.875)、Cyt?c(F=10.524)和 Bak(F=10.147)的表達(dá)明顯升高,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與TMD組相比,rhTPO(低、中、高)組血小板中Opa1(F=8.246)、Bcl?xl(F=7.559)、Mfn2(F=7.127)的表達(dá)明顯升高,F(xiàn)is?1(F=8.539)、Drp?1(F=7.691)、Cyt?c(F=7.484)和 Bak(F=6.724)的表達(dá)明顯降低,并且具有明顯的劑量依賴性,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖5。

    圖5 血小板中 Fis?1、Mfn 2、Drp?1、Opa 1、Cyt?c、Bcl?xl和Bak的表達(dá)Fig.5 The expression of Fis?1,Mfn 2,Drp?1,Opa 1,Cyt?c,Bcl?xl and Bak in platelets

    3 討論

    臨床上將rhTPO用于實(shí)體腫瘤放化療誘導(dǎo)的血小板減少癥以及過敏性紫癜引起的血小板減少的輔助治療中[11],取得了較為滿意的療效,但是rhTPO如何調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá),抑制血小板的凋亡,尚未有定論[12]。因此深入揭示血小板凋亡的分子機(jī)制,對(duì)于血小板生成類藥物的開發(fā)、推廣都具有重大意義。

    輸注血小板是治療重度血小板減少癥的常用方法,療效明顯,但維持時(shí)間短,且易出現(xiàn)過敏、高熱、感染等副反應(yīng),而TPO是特異性的調(diào)控血小板生成的因子,可直接增加血小板的分泌量[13]。但因其儲(chǔ)存、來源等限制了其臨床應(yīng)用,而基于基因重組技術(shù)誕生的rhTPO,能更好的彌補(bǔ)TPO的不足,在各種原因引起的血小板減少癥中發(fā)揮作用[14]。MEI等[15]研究顯示將rhTPO用于治療成年免疫性血小板減少癥時(shí),療效顯著,不良反應(yīng)較少。YAO等[16]研究顯示rhTPO能明顯安全、有效的促進(jìn)造血干細(xì)胞移植患者術(shù)后的血小板恢復(fù),不良反應(yīng)低。本研究結(jié)果顯示rhTPO能明顯抑制TMD誘導(dǎo)的血小板凋亡,并且具有良好的劑量依賴性。

    線粒體是血小板的“動(dòng)力源”,消除ROS的重要武器[17]。研究顯示[18-19]細(xì)胞內(nèi)的線粒體處于動(dòng)態(tài)的平衡中,Drp?1、Fis?1以及 Mfn2、Opa1 基因分別是線粒體膜裂解與融合的關(guān)鍵調(diào)控因子。XU等[20]研究顯示在血小板減少癥患者中的血清中,血小板的線粒體呈現(xiàn)碎片化狀態(tài),凋亡率明顯升高。XIANG等[21]研究顯示及時(shí)清除ROS后,能明顯維系血小板線粒體膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定,抑制其細(xì)胞凋亡。在病理狀態(tài)中,凋亡信號(hào)被炎癥等激活,Bak的轉(zhuǎn)錄與翻譯驟增,Bcl?xl的活性受限,誘導(dǎo)血小板的細(xì)胞凋亡[22]。MIAO等[23]研究報(bào)道對(duì)免疫性血小板減少癥進(jìn)行抗Bak治療,能明顯升高Bcl?xl的表達(dá)。本研究結(jié)果顯示經(jīng)rhTPO干預(yù)后Opa1、Bcl?xl、Mfn2、Fis?1、Drp?1、Cyt?c和 Bak 基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)對(duì)rhTPO具有明顯的劑量依賴性。

    綜合上述,rhTPO能明顯抑制TMD誘導(dǎo)的血小板的細(xì)胞凋亡,這可能與抑制ROS的富集,改善線粒體的形態(tài)有關(guān),但如何更為有效的將rhTPO用于臨床相關(guān)疾病的治療,仍需考慮患者體質(zhì)的特異性。

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