兩種檢測飼料中維生素A乙酸酯、維生素D3和維生素E測定方法的比較分析

司慧民，元雪湞，全曉萍，陳 薔，韓 立

（河南省獸藥飼料監(jiān)察所，河南 鄭州 450008）

維生素是維持生命活動(dòng)所必需的一類物質(zhì)。隨著營養(yǎng)生理學(xué)研究的深入，人們對維生素在動(dòng)物營養(yǎng)中的作用有了新的認(rèn)識，開始注意到維生素的重要作用[1-2]。維生素在生物體內(nèi)的含量很少，但不可或缺。當(dāng)動(dòng)物機(jī)體缺乏維生素時(shí)，動(dòng)物的生長發(fā)育以及繁殖機(jī)能就會受到影響，缺乏嚴(yán)重時(shí)甚至?xí)鹛厥饧膊?。雖然目前畜禽病臨床中典型的維生素缺乏癥并不多見[3-4]，但在生產(chǎn)實(shí)踐中添加維生素制劑可以提高動(dòng)物的飼料轉(zhuǎn)化效率，促進(jìn)發(fā)病畜禽康復(fù)。

維生素分為水溶性和脂溶性兩大類[5]。水溶性維生素因其在動(dòng)物體內(nèi)不能蓄積，所以短期超量危害甚微。但是脂溶性維生素能夠在動(dòng)物體內(nèi)蓄積，長期超量就會產(chǎn)生有害影響。維生素化學(xué)性質(zhì)極其不穩(wěn)定，容易受到金屬離子的影響從而發(fā)生氧化，在酸、堿和光照的環(huán)境中也易分解[6]，因此快速準(zhǔn)確地測定飼料中維生素的含量對防止維生素缺乏癥、維生素中毒、維生素的穩(wěn)定性以及制定合理的維生素加工工藝和儲存條件等具有重要意義。

維生素 A 乙酸酯（VA）、維生素 D3（VD3）和維生素E（VE）在飼料中被廣泛使用，其在飼料中的含量直接影響飼料的品質(zhì)。現(xiàn)行的國家標(biāo)準(zhǔn)[7]是3種維生素檢測的單獨(dú)標(biāo)準(zhǔn)。采用傳統(tǒng)處理方法，包括皂化破壁、有機(jī)溶劑萃取、濃縮、色譜凈化、正相分離及質(zhì)譜檢測等步驟[8-12]，涉及多次蒸發(fā)溶解，操作步驟復(fù)雜，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，容易造成待測組分損失，導(dǎo)致測定結(jié)果偏低且重現(xiàn)性不好。本試驗(yàn)旨在選擇可同時(shí)檢測出飼料中VA、VD3和VE的含量，并且具有靈敏度和準(zhǔn)確度高、檢測速度快等特點(diǎn)的定量檢測方法，從而為飼料中VA、VD3和VE含量的測定提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 飼料樣品。豬濃縮飼料1、2、3和豬預(yù)混合飼料1、2、3均系市場自購,樣品用鋼磨粉碎并過40目篩，置于塑料自封袋中，陰涼干燥保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要儀器。Waters UPLC超高效液相色譜儀（二極管矩陣檢測器）（美國Waters公司）；超聲波清洗器（可調(diào)溫度20～80℃）（昆山市超聲儀器有限公司）；PL403IC型電子分析天平 （梅特勒上海有限公司）；超純水儀（美國 Millipore公司）；0.22μm有機(jī)系濾膜（天津津滕公司）。

1.1.3 主要試劑。甲醇（色譜純，上海安譜）；氨水（分析純，天津科密歐）；乙醚（優(yōu)級純，天津科密歐）；L-抗壞血酸（優(yōu)級純，阿拉丁）；堿性蛋白酶（酶活力每克大于4000單位）；維生素A乙酸酯(純度≥99.0%，中國食品藥品檢定研究院)；膽鈣化醇（純度≥99.0%，F(xiàn)irst Standard）；dl-α-生育酚乙酸酯（純度≥99.0%，中國食品藥品檢定研究院）。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將處理好的豬濃縮飼料1、2、3和豬預(yù)混合飼料1、2、3分別按照快速測定法和國標(biāo)方法進(jìn)行樣品處理，并分別測定其中VA、VD3和VE的含量，每種飼料樣品在使用2種測定方法測定時(shí)分別設(shè)置3個(gè)平行。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 快速測定法。溶液的配制。氨水溶液：取水適量，用氨水調(diào)節(jié)pH值為8～10；標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液：分別準(zhǔn)確稱取VA（維生素A乙酸酯，純度≥99.0%）標(biāo)準(zhǔn)品34.4mg（精確至 0.00001g）、VD3（膽鈣化醇，純度≥99.0%）標(biāo)準(zhǔn)品 10.0mg（精確至 0.00001g）、VE（dlα-生育酚乙酸酯，純度≥99.0%）標(biāo)準(zhǔn)品50.0mg（精確至0.00001g）于100mL棕色容量瓶，用甲醇溶解并定容至刻度，-18℃避光保存，有效期為6個(gè)月；混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液：分別吸取VA、VD3和VE標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液0.2、0.1、1.0mL于10mL棕色容量瓶，用甲醇稀釋并定容，冷凍避光保存，有效期為2周。

樣品前處理。稱取適量試樣（復(fù)合預(yù)混合飼料3g，維生素預(yù)混合飼料0.3g，濃縮飼料5～10g）精確至0.0001g，置于150mL的棕色錐形瓶中，加入15mL氨水溶液（pH值為8～10）（必要時(shí)加入吡咯啶二硫代甲基羧酸銨0.5g）振搖2min，再加入0.2g堿性蛋白酶于55～65℃水浴中超聲溶解20min（其間搖動(dòng)3～5次），取出放入冷水浴中降溫，待降至室溫后加入25mL甲醇（分析純），常溫超聲提取15min（其間搖動(dòng)2～3次），取出，轉(zhuǎn)移至50mL離心管中，10000r/min離心5min，將上清液轉(zhuǎn)移至100mL棕色容量瓶中，殘?jiān)?0mL甲醇（分析純）重復(fù)提取1次，合并2次上清液，用甲醇定容至刻度。過0.22μm濾膜，上機(jī)測試。

色譜測定。色譜條件：色譜柱：C18柱（柱長100mm；內(nèi)徑 1.7mm；粒度 1.7 μm）；流動(dòng)相：甲醇+水=95+5；流速：0.3mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：5 μL；檢測波長：325nm（0～4.0min）；265nm（4.1～7.0min）；280nm（7.1～12min）。

定量測定。在儀器正常工作條件下，取試樣溶液和相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液上機(jī)進(jìn)樣，作單點(diǎn)或多點(diǎn)校準(zhǔn)，以色譜峰面積定量。標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和試樣溶液中VA、VD3和VE的峰面積均應(yīng)在儀器檢測的線性范圍內(nèi)。在試樣液進(jìn)樣過程中應(yīng)參考標(biāo)準(zhǔn)工作液，以便定性定量準(zhǔn)確。

1.3.2 國標(biāo)方法。VA、VD3和VE的國標(biāo)方法測定、試劑配制和樣品處理及色譜條件詳見對應(yīng)國家標(biāo)準(zhǔn)[13-15]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

對測定結(jié)果使用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，每種樣品2種測定方法間的比較采用數(shù)據(jù)樣本t檢驗(yàn)法，6種樣品整體間的比較采用配對數(shù)據(jù)的t檢驗(yàn)法，數(shù)據(jù)以"平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差"表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

圖1為快速測定法測定飼料中VA、VD3及VE定量測定過程中混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖；圖2、圖3和圖4為國標(biāo)方法測定飼料中VA、VD3、VE的圖譜。由上圖可以看出，快速測定法可以實(shí)現(xiàn)液相色譜上機(jī)1次測定出飼料中VA、VD3、VE的含量，國標(biāo)方法液相色譜上機(jī)3次才能測定出飼料中VA、VD3、VE的含量。

圖1 VA、VD3、VE混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

圖2 VA標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

圖3 VD3標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

圖4 VE標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

2.2 VA、VD3及VE的含量測定

使用2種方法對6種預(yù)混合飼料和濃縮飼料進(jìn)行檢測，所得VA、VD3和VE含量結(jié)果見表1～表4。由表可知，6種飼料中VA、VD3及VE的含量使用快速測定法所得結(jié)果均高于國標(biāo)方法；利用快速提取法測得3號豬濃縮飼料中VA和VE含量以及3號豬預(yù)混合飼料中VD3和VE含量均顯著高于國標(biāo)方法（P<0.05）；整體比較分析結(jié)果顯示，利用快速測定法測定豬濃縮飼料中VA的含量顯著高于國標(biāo)方法（P<0.05），豬預(yù)混料使用2種測定方法所得3種維生素含量差異均不顯著（P>0.05）。

表1 豬濃縮飼料中VA、VD3及VE含量的測定

表2 豬預(yù)混合飼料中VA、VD3及VE含量的測定

表3 豬濃縮飼料VA、VD3及VE含量測定結(jié)果的整體比較

表4 豬預(yù)混合飼料VA、VD3及VE含量測定結(jié)果的整體比較

3 討論

采用傳統(tǒng)國標(biāo)方法測定飼料中VA、VD3和VE時(shí)，需按照3種維生素對應(yīng)的國標(biāo)方法[13-15]分別提取3次，再使用高效液相色譜儀在不同的色譜條件下進(jìn)行3次上機(jī)測定，該方法耗時(shí)長，步驟復(fù)雜，容易造成被測組分的損失，影響準(zhǔn)確度。快速測定法可在15min內(nèi)完成3種維生素的提取，并且VA、VD3和VE的含量在高效液相色譜儀上上機(jī)1次即可測得?？焖贉y定法優(yōu)化了提取步驟，使得飼料中VA、VD3和VE在提取的過程中損失減少。因此，快速測定法更加高效便捷。

從快速測定法和國標(biāo)方法提取飼料中VA、VD3和VE的結(jié)果來看，快速測定法比國標(biāo)方法測得結(jié)果的平均值大，可能是因?yàn)榭焖贉y定法提取步驟的優(yōu)化減少了提取過程中被測組分的損失，從而獲得比國標(biāo)方法更準(zhǔn)確、更可信的數(shù)據(jù)，故快速測定法較國標(biāo)方法具有更高的靈敏度和準(zhǔn)確度。

4 結(jié)論

快速測定法具有快速、準(zhǔn)確和靈敏的特點(diǎn)，適合對飼料中VA、VD3和VE多組分一次性定量檢測。