組蛋白賴氨酸去甲基化酶家族在膀胱癌中的表達模式及其潛在作用：基于多組學(xué)分析

付小聰，余光創(chuàng)，郭艷芳

南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物信息學(xué)系，廣東 廣州 510515

膀胱癌是比較常見的一種惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率都呈上升趨勢［1,2］。膀胱癌的男性病例比女性病例更常見，男性的發(fā)病率和死亡率分別為9.5/10萬和3.3/10萬，大約是女性的4倍［3］。腫瘤基因組研究進展提示膀胱癌相比大多數(shù)其它癌癥具有更為明顯的表觀遺傳失調(diào)特征，這嚴重影響膀胱癌患者的預(yù)后，給治療帶來巨大挑戰(zhàn)［4］。

編碼蛋白質(zhì)的染色質(zhì)重塑基因常常是表觀遺傳學(xué)研究關(guān)注的焦點。賴氨酸組蛋白去甲基化酶（KDMs）家族，就是一類非常重要的表觀遺傳酶，它被定義為一組催化不同大分子（核酸和蛋白質(zhì)）賴氨酸殘基去甲基化的酶［5］，既能去除抑制性組蛋白標(biāo)志物，又能清除激活性組蛋白標(biāo)志物［6］。KDMs的失調(diào)通常與人類癌癥有關(guān)，例如，KDM6A［7,8］、KDM5C［9］被報道高度突變易促進腫瘤的發(fā)生；而KDM1A［10］、KDM3A［11］、KDM3B［12］、KDM4C［13］、KDM5B［14］和KDM7B［15］分別在相應(yīng)腫瘤中的過表達促進癌細胞生長，并導(dǎo)致較差的預(yù)后；相反，KDM5D［16］的過表達顯著抑制結(jié)直腸癌的生長和轉(zhuǎn)移。盡管有諸多研究發(fā)現(xiàn)單個KDMs家族基因在不同腫瘤類型中發(fā)揮重要作用，具有組織特異性，但尚未有相關(guān)研究報道整個KDMs基因家族在膀胱癌中的表達是否具有共性或者特殊模式，以及對膀胱癌的診斷和治療發(fā)揮著怎樣的潛在作用。

因此，本研究使用多種生物信息學(xué)分析方法來全面評估KDMs在BLCA患者中多組學(xué)的表達模式及其潛在的影響，旨在為KDMs在膀胱癌的腫瘤發(fā)生、進展、診斷和預(yù)后治療中的潛在作用提供理論參考。

1 材料和方法

1.1 材料

通過文獻獲取19個KDMs的相關(guān)信息：KDM1A/1B/2A/2B/3A/3B/4A/4B/4C/4D/5A/5B/5C/5D/6A/6B/7B/7C和UTY［5］；其次獲取來自TCGA 膀胱癌樣本數(shù)據(jù)集，包括臨床資料（n=404）和轉(zhuǎn)錄組（n=427）、甲基化（n=439）、體細胞變異（n=411）多組學(xué)高通量測序數(shù)據(jù)。

1.2 方法

本研究采用生物信息學(xué)分析方法以分析KDMs的表達模式，并構(gòu)建生存預(yù)后、免疫浸潤和藥物敏感性模型，具體如下。

1.2.1 KDMs在膀胱癌中的轉(zhuǎn)錄表達、甲基化水平、體細胞變異分析 本研究使用UALCAN分析KDMs的轉(zhuǎn)錄表達和甲基化水平，使用GSCALite分析BLCA樣本中KDMs的體細胞變異（包括單點突變和拷貝數(shù)變異）。UALCAN［17］（http://ualcan.path.uab.edu/）和GSCALite［18］（http://bioinfo.life.hust.edu.cn/web/GSCALite/）是兩個用于分析和可視化TCGA數(shù)據(jù)的生物信息學(xué)在線分析平臺。

1.2.2 KDMs在BLCA中的生存與預(yù)后價值分析 本研究使用Kaplan Meier-Plotter（http://www.kmplot.com/）探討KDMs的表達對BLCA樣本（n=404）的總生存率（OS）、無復(fù)發(fā)生存率（RFS）的影響［19］。利用每個KDMs家族基因表達水平的上下四分位數(shù)將患者樣本分為高表達組和低表達組，繪制Kaplan-Meier生存曲線，并進行l(wèi)og-rank顯著性檢驗，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

為探討多個KDMs的表達對BLCA患者的生存影響，進一步使用臨床生物信息學(xué)助理（www.aclbi.com）構(gòu)建綜合預(yù)后模型分析模塊研究KDMs對膀胱癌樣本的綜合預(yù)后影響［20］。分析針對408例BLCA患者數(shù)據(jù)進行降維，構(gòu)建包含多個KDMs基因的Risk Score模型，采用LASSO回歸與十倍交叉驗證最小lambda值獲得具有預(yù)后價值的基因，并利用模型對高風(fēng)險組（n=203）和低風(fēng)險組（n=204）樣本進行風(fēng)險評估預(yù)測生存期。

1.2.3 KDMs在膀胱癌中的免疫浸潤與耐藥分析 為探討KDMs 的表達與免疫浸潤的關(guān)系，我們利用Timer（http://timer.cistrome.org/）進行免疫浸潤分析［21］，探討每個KDMs家族成員在BLCA（n=427）中的表達與多種免疫細胞浸潤的相關(guān)性，包括B 細胞、CD8+T 細胞、CD4+T細胞、巨噬細胞、中性粒細胞和樹突狀細胞。

為進一步探索KDMs 的異常表達對膀胱癌患者（n=427）藥物治療的影響，我們對KDMs的耐藥性進行分析。使用GSCALite［18］的藥物敏感性分析模塊研究KDMs 家族成員與抗癌藥物敏感性的相關(guān)性，采用Pearson相關(guān)系數(shù)表征KDMs的表達與腫瘤藥物敏感性基因組學(xué)中265個小分子的線性相關(guān)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 KDMs在BLCA中的轉(zhuǎn)錄表達模式

KDMs在膀胱癌組織中并不是一致上調(diào)或者下調(diào)的表達模式（圖1），差異表達分析結(jié)果顯示，KDM1A（P=1.37×10-8）、KDM1B（P=4.74×10-3）、KDM2B（P=2.59×10-7）、KDM4A（P=3.24×10-4）、KDM4B（P=2.99×10-4）、KDM5B（P=1.59×10-4）、KDM5C（P=2.11×10-2）在BLCA中顯著性過表達，其中KDM1A/2B過表達最為突出，而KDM3B（P=9.10×10-3）、KDM6B（P=2.88×10-2）、KDM7C（P=1.28×10-2）的表達則明顯下調(diào)。

圖1 KDMs在BLCA中的轉(zhuǎn)錄表達箱線圖Fig.1 Box plots of KDMs transcription levels in BLCA.*P＜0.05,**P＜0.01.

2.2 KDMs在BLCA中的甲基化水平

KDMs在膀胱癌中的甲基化水平并非全都異常，但大部分KDMs具有明顯的表觀遺傳失調(diào)現(xiàn)象（圖2），其中KDM1A（P=5.45×10-9）、KDM3B（P=1.85×10-10）、KDM4A（P＜1×10-12）、KDM4B（P=2.24×10-5）、KDM4C（P=1.12×10-6）、KDM5A（P=4.82×10-3）、KDM5B（P=3.27×10-2）、KDM5C（P=6.17×10-7）和KDM7B（P=2.08×10-3）在BLCA組織中表達下調(diào)，KDM7C（P=9.45×10-4）的表達明顯上調(diào)。此外，相關(guān)分析顯示，19個KDMs成員中，有14個基因（KDM1A/1B/2A/2B/3A/3B/4A/4B/4C/5A/5B/5C/6A/6B）的甲基化水平與轉(zhuǎn)錄水平呈顯著性負相關(guān)（圖3），尤其在KDM1A/4A/5B/4B中表現(xiàn)明顯，它們在膀胱癌中甲基化水平程度較低，基因轉(zhuǎn)錄水平卻高。

圖2 KDMs在膀胱癌樣本中的甲基化水平箱線圖Fig.2 Box plots of KDMs methylation levels in BLCA.*P＜0.05,**P＜0.01.

圖3 KDMs在膀胱癌樣本中基因表達與甲基化水平之間的相關(guān)性Fig.3 Correlation between transcription and methylation levels of KDMs in bladder cancer samples.

2.3 KDMs在BLCA中的變異模式

單點突變分析結(jié)果顯示，KDMs基因的非同義突變集中在KDM6A/5A/3B/3A/5B/2B/4C/2A/4A 和UTY 10個基因（占KDMs總突變的91.26%），突變種類包括錯義突變、無義突變、移碼插入突變、框內(nèi)缺失、剪接位點突變、多次突變和移碼缺失突變（圖4）。其中，KDM6A非同義突變頻率最高（占總突變的25.79%），種類也最多，幾乎覆蓋了KDMs中所有突變種類，具有顯著標(biāo)志。并且，KDM6A與其他KDMs在BLCA樣本中突變具互補性特征，在發(fā)生KDM6A突變的105個樣本中，其它KDMs 基因突變相對較少；而在沒有發(fā)生KDM6A突變的78個BLCA樣本中，其它KDMs基因反而突變相對較多。

圖4 KDMs在BLCA中體細胞變異分析Fig.4 Genetic alterations in KDMs in BLCA.A: The plot displays the nonsynonymous mutation frequency of KDMs in BLCA.B:Waterfall plot of the distribution and classification of nonsynonymous mutations in KDMs in BLCA.C:Heterozygous CNV profile of KDMs.D:CNV Pie distribution of KDMs.

進一步的拷貝數(shù)變異分析檢測到KDMs家族基因幾乎都有顯著的結(jié)構(gòu)突變，主要體現(xiàn)為雜合子擴增和缺失，除KDM1B外，沒有檢測到純合子的擴增和缺失（檢測標(biāo)準CNV＞5%）（圖4）。KDM6A的雜合子擴增率和缺失率大約為10%，與其他KDMs相比并沒有顯示出獨特的特征，這與體細胞突變分析結(jié)果不同。

2.4 KDMs在BLCA中的預(yù)后價值

生存分析顯示（圖5），僅有少數(shù)幾個KDMs對膀胱癌患者生存期具有顯著影響，其中KDM3A/4C/5D/6A/7B對BLCA患者的總生存期具有保護作用（KDM3A：HR=0.72，95%CI: 0.54～0.97，P=0.029；KDM4C：HR=0.62，95%CI:0.46～0.83，P=0.0013；KDM5D：HR=0.69，95%CI:0.5～0.94，P=0.0165；KDM6A：HR=0.73，95%CI:0.54～1，P=0.0489；KDM7B：HR=0.65，95%CI: 0.47～0.89，P=0.0065），而KDM3B/5B/5C對BLCA患者無復(fù)發(fā)生存期具有危險影響（KDM3B：HR=2.8，95%CI:0.97～8.07，P=0.0463；KDM5B：HR=2.52，95%CI:1.03～6.16，P=0.0359；KDM5C：HR=2，95%CI: 0.99～4.06，P=0.049），只有KDM4C在總生存期和無復(fù)發(fā)生存期分析中一致表現(xiàn)為保護性因素（KDM4C：HR=0.47，95%CI:0.23～0.96，P=0.0332）。

圖5 KDMs在BLCA中的預(yù)后價值Fig.5 Prognostic value of KDMs in BLCA.A:OS curves for KDM3A/4C/5D/6A/7B in BLCA.B:RFS curves for KDM3B/4C/5B/5C in BLCA.

進一步分析構(gòu)建的綜合預(yù)后模型結(jié)果顯示，KDM4C/6A/7B在BLCA患者中都是保護性基因，樣本的KDM4C/6A/7B表達較低，它們的風(fēng)險分數(shù)卻較高（圖6），預(yù)后情況較不理想。

圖6 KDMs在BLCA中的預(yù)后模型Fig.6 Prognostic model constructed by KDMs in BLCA.A:LASSO coefficient profiles of KDM genes.B: LASSO regression with tenfold cross-validation to obtain the prognostic genes.C:Scatter plot of risk scores.Different colors represent different risk groups.D:Scatter plot distribution of survival time and survival state corresponding to different sample risk scores.E:Expression heatmap of the 3 genes contained in the risk score model.F:Kaplan-Meier overall survival curves in high-and low-risk groups.G: ROC curves showing the efficiency of the model for predicting 1-,3-and 5-year survival rates of the patients.

2.5 KDMs在BLCA中的免疫浸潤分析

免疫浸潤分析結(jié)果顯示，B 細胞的豐度與除KDM1A/4C/5C/5D/7C 外的大多數(shù)KDM 家族成員的表達呈正相關(guān)（表1）。CD8+細胞與KDM1B/2A/3A/4C/5A/5C/6A的表達呈正相關(guān)，與KDM4B的表達呈負相關(guān)（P＜0.05）。此外，CD4+細胞的豐度與KDM2A/4C/7C的表達呈正相關(guān)，與KDM1A的表達呈負相關(guān)。巨噬細胞的豐富程度與KDM1A/2B/4A/4D/5A/5B/5C/6A/7B/7C 的表達呈正相關(guān)，中性粒細胞的豐度與KDM1B/2A/2B/3A/4C/4D/5A/5C/6A/7C 呈正相關(guān)（P＜0.05）。樹突細胞的豐度與KDM1B/2A/4C/4D/5A/5C/7B的表達呈正相關(guān)，與KDM4A/4B/6B的表達呈負相關(guān)（P＜0.05）。

表1 KDMs在BLCA中的表達與免疫細胞豐度的相關(guān)性Table 1 Correlation between the expression of KDMs and the abundance of immune cells in BLCA

2.6 KDMs在BLCA中的藥物敏感性分析

藥物敏感性分析結(jié)果顯示，KDM2B/3B/4B/4C/5A表達對大部分抗癌藥物的敏感性呈負相關(guān)，它們在高表達的時候，對大部分抗癌藥物沒有耐藥性（圖7）。其中，KDM2B/4B表達對17-AAG（坦螺旋霉素）、多烯紫杉醇、曲美替尼、司美替尼、RDEA119（瑞法替尼）、PD-0325901（考比替尼）呈正相關(guān)，而KDMs表達分析結(jié)果顯示KDM2B/4B在BLCA患者中是顯著性高表達。

圖7 KDMs藥物敏感性分析中的作用Fig.7 Role of KDMs in drug sensitivity analysis.

3 討論

KDMs是一類具有相似功能的非常重要的表觀遺傳酶，它們可以去除核小體組蛋白尾部賴氨酸甲基化標(biāo)記，導(dǎo)致基因表達異常變化，進而影響腫瘤進展和治療效果［22］。KDMs表達的改變與許多疾病呈正相關(guān)，例如腫瘤發(fā)生、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、炎癥和免疫疾病、代謝疾病和再生疾?。?］。但是，它們在膀胱癌多組學(xué)中的表達情況及其潛在作用還不清楚。因此，本研究利用生物信息學(xué)分析方法對BLCA中KDMs的轉(zhuǎn)錄水平、甲基化水平、體細胞變異、生存分析、預(yù)后分析、免疫浸潤情況、藥物敏感性分析進行了探討。本研究結(jié)果顯示KDMs 在BLCA中的轉(zhuǎn)錄水平、甲基化水平、體細胞變異的整體表達模式并沒有因為它們功能相似而具有一致的模式，各組學(xué)的表達模式各具特點且相互關(guān)聯(lián)，并且有部分KDMs在膀胱癌中顯示出預(yù)后價值影響治療效果。

我們對KDMs在BLCA患者中的表達情況進行整體分析發(fā)現(xiàn)KDM1A/1B/2B/4A/4B/5B/5C在BLCA患者中表達顯著上調(diào)，而KDM3B/6B/7C表達顯著下調(diào)。這些基因表達的顯著改變同樣發(fā)生在不同腫瘤中，對腫瘤的發(fā)生發(fā)展都有著不同程度的潛在影響。在以往的研究中，KDM1A/1B已被證明在許多癌癥類型中的表達都有顯著性的改變，包括乳腺癌［23］、前列腺癌［24］、肝癌［25］、肺癌［26］和結(jié)直腸癌［27］；KDM2B的過表達與幾種癌癥（例如B細胞和T細胞急性淋巴細胞白血病、乳腺癌和胰腺癌等）和精原細胞增殖受損有因果關(guān)系［28］。KDM4A/4B的過表達主要見于乳腺癌［29］、髓母細胞瘤［30］、淋巴瘤易位［31］、食道癌［32］和周圍神經(jīng)鞘瘤［33］。KDM5B的過度表達與肺癌、胃癌、乳腺癌、肝癌等［34］相關(guān)。

KDMs的異常轉(zhuǎn)錄表達可能與其DNA甲基化水平有關(guān)，這是因為DNA甲基化可通過直接抑制轉(zhuǎn)錄起始因子與啟動子的結(jié)合，從而降低基因的表達［35］。我們進一步對KDMs的甲基化水平進行分析，發(fā)現(xiàn)KDM1A/3B/4A/4B/4C/5A/5B/5C/7B在BLCA患者中甲基化水平顯著性降低，而KDM7C甲基化水平顯著性提高。在轉(zhuǎn)錄水平與甲基化水平呈顯著性負相關(guān)的14個KDMs中，最為顯著的KDM1A是第一個被發(fā)現(xiàn)的組蛋白去甲基酶，其主要功能是作為轉(zhuǎn)錄抑制因子。有研究發(fā)現(xiàn)KDM1A 可以調(diào)節(jié)腫瘤細胞的代謝模式，通過增加H3K4甲基化抑制線粒體代謝酶的表達，促進葡萄糖攝取，并維持缺氧誘導(dǎo)的HIF-1α促進糖酵解［36］。

KDMs在BLCA中不僅在轉(zhuǎn)錄和甲基化水平變化明顯，其在體細胞突變水平的顯著變化也呈現(xiàn)出獨特景象。KDM6A作為非同義突變頻率最高、種類最多的基因與其他KDMs突變基因存在互補性，在發(fā)生KDM6A突變的BLCA樣本中，其它KDMs基因卻突變相對較少，而在沒有發(fā)生KDM6A突變的BLCA樣本中，其它KDMs基因卻突變相對較多。研究表明KDM6A在多種癌癥中也高度突變，包括B細胞淋巴瘤、肺鱗狀細胞癌、頭頸部鱗狀細胞癌、胰腺癌和腎乳頭狀細胞癌［37］，但這種高突變率并未顯示出一一對應(yīng)的顯著表達差異。我們猜測該基因的突變位點并沒有影響到基因的表達水平，亦或這種表達差異在現(xiàn)有的樣本和分析方法中暫未被檢測出來。據(jù)相關(guān)實驗研究表明KDM6A的失活或缺失是膀胱癌進展的強有力的驅(qū)動因素［7］。同時，本研究結(jié)果提示除KDM6A以外的其他KDMs基因的突變對膀胱癌的影響亦不能忽視。因此，KDM6A頻繁突變以及其與KDMs突變基因的互補性的識別或許有望用于膀胱癌的早期檢測和治療后疾病檢測的尿液和血液檢測，以及促進新的治療方法。

以往有研究發(fā)現(xiàn)，KDMs的表達對腫瘤患者的預(yù)后影響似乎可以發(fā)揮雙重作用［38］。同樣，本研究也發(fā)現(xiàn)在BLCA 患者KDMs 的總生存期方面，KDM3A/4C/5D/6A/7B 具有保護性作用，而在無復(fù)發(fā)生存期方面，KDM3B/5B/5C具有危險性影響，KDM4C是保護性影響。綜合預(yù)后模型進一步表明KDM4C/6A/7B可以作為膀胱癌的預(yù)后生物標(biāo)志物。從上述的結(jié)果看，KDMs這個基因家族的成員在不同的腫瘤中既有保護性因素也有危險性因素，在膀胱癌中也不例外，同樣顯示出雙重作用。值得注意的是，KDM5C/6A/7B 位于X 染色體，KDM5D位于Y染色體，這4個基因的改變都顯著性的影響總生存率，并且都在性染色體上，或許這有助于解釋導(dǎo)致膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展和治療過程中都表現(xiàn)出存在性別差異的現(xiàn)象。

本研究還揭示了KDMs的轉(zhuǎn)錄水平與免疫細胞浸潤的關(guān)系，大部分的KDMs表達都與BLCA患者免疫浸潤呈顯著性正相關(guān)。關(guān)于KDMs家族和免疫浸潤之間的聯(lián)系的研究非常有限，需要更多的科學(xué)實驗去探索和驗證。目前有研究證明KDM1A的低表達可增強CD8+T細胞在不同腫瘤中的浸潤，從而刺激T細胞免疫抑制腫瘤生長［39］。此外，KDM6A可以促進T細胞向腫瘤微環(huán)境募集，抑制腫瘤生長［40］。如果KDMs會影響免疫微環(huán)境，應(yīng)用它們的抑制劑或聯(lián)合免疫治療可能更有利于膀胱癌的治療。在進一步的藥物敏感性分析中，本研究發(fā)現(xiàn)KDM2B/3B/4B/4C/5A與大多數(shù)抗癌藥物是呈負相關(guān)的，沒有耐藥性；但是KDM2B/4B 與6 種抗癌藥物（Tanespimycin、Docetaxel、Trametinib、Selumetinib、RDEA119、PD-0325901）呈正相關(guān)，高表達KDM2B/4B的患者對它們具有一定的耐藥性。

綜上所述，KDMs在膀胱癌患者中的轉(zhuǎn)錄水平、甲基化水平和體細胞變異這3種組學(xué)層面大部分都呈現(xiàn)出不同程度的變化，而且這些異常變化與免疫浸潤非常密切相關(guān)，也影響著膀胱癌患者的免疫治療以及預(yù)后。結(jié)合KDMs的研究現(xiàn)狀，不難發(fā)現(xiàn)KDMs存在組織特異性。不同的KDMs家族基因在人類不同組織的表達水平不一樣，所以在不同的腫瘤中KDMs的表達也存在差異，而這些差異對腫瘤的發(fā)生發(fā)展和患者的治療產(chǎn)生不同程度的影響。當(dāng)然，這些都還需要更多的科學(xué)實驗來研究證實，為不同腫瘤患者的差異化治療提供理論依據(jù)。