WP1130通過抑制NLRP3炎癥小體活化緩解小鼠的感染性休克

陸 莉，劉迪迪，楊燕青，王鳳超

1蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗科，安徽 蚌埠 233004；2蚌埠醫(yī)學(xué)院慢性疾病免疫學(xué)基礎(chǔ)與臨床安徽省重點實驗室，安徽 蚌埠 233030

核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域受體蛋白3（NLRP3）炎癥小體是一類大的多聚蛋白復(fù)合物，由模式識別受體NLRP3蛋白、接頭蛋白凋亡相關(guān)斑點樣蛋白（ASC）以及效應(yīng)蛋白pro-caspase-1 組成。其功能主要是通過活化caspase-1促進白細胞介素1β（IL-1β）、白細胞介素18（IL-18）的成熟與分泌從而介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，維持機體免疫穩(wěn)態(tài)［1］。適度的炎癥反應(yīng)有助于減輕感染，清除受損細胞，但當炎癥反應(yīng)持續(xù)發(fā)生或NLRP3炎癥小體活化異常時則會引發(fā)多種炎癥性疾病和自身免疫病，如二型糖尿病、動脈粥樣硬化、帕金森病［2,3］等疾病。目前治療NLRP3炎癥小體相關(guān)疾病的方法主要是針對其活化產(chǎn)物IL-1β，但此方法與靶向NLRP3的抑制劑相比還存在非特異性、易影響其他細胞功能等局限性［4］。近年來，多種小分子化合物被報道對NLRP3炎癥小體表現(xiàn)出良好的抑制效果［5,7］，但仍未有一種化合物能夠直接應(yīng)用于臨床。因此，尋找一種高效且特異的NLRP3炎癥小體活化抑制劑對治療NLRP3炎癥小體相關(guān)炎性疾病尤為重要。

外源小分子化合物WP1130是一種針對USP9x［8］、USP24［9］、USP5［10］的部分選擇性去泛素化酶抑制劑［11］，能夠增加巨噬細胞的抗感染能力［12］，增強了對金黃色葡萄球菌［13］和單核細胞增生李斯特菌的殺滅［14］，抑制一些細菌和病毒病原體的細胞內(nèi)復(fù)制，如WP1130顯著降低了鼠巨噬細胞樣細胞系中鼠諾如病毒和其他RNA病毒的復(fù)制［15,16］。WP1130也具有強大的抗腫瘤活性，為胰腺癌［17］、T細胞急性淋巴細胞白血病［9］胰腺導(dǎo)管腺癌［10］、B細胞淋巴瘤［18］和非小細胞肺癌［19］的治療提供了新策略，然而其抗感染功能是否與NLRP3炎癥小體相關(guān)尚不明確。本研究擬通過在細胞水平和動物水平探究WP1130 對NLRP3 炎癥小體活化的作用，以期為NLRP3炎癥小體相關(guān)疾病的治療提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及細胞

6～10周齡，體質(zhì)量18～24g的SPF級C57BL/6雄性小鼠，購自江蘇集萃藥康生物科技股份有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK（蘇）2018-0008，小鼠飼養(yǎng)于無特定病原體（SPF）環(huán)境，溫度21～25 ℃，濕度50%～60%，保持12 h/12 h光照黑暗周期，給予輻照滅菌墊料、飼料和高壓滅菌水，保證小鼠自由飲水和攝食，動物實驗嚴格按照實驗動物管理規(guī)范進行。人急性單核細胞白血病THP-1細胞系，受贈于蚌埠醫(yī)學(xué)院汪洪濤教授課題組。本研究經(jīng)蚌埠醫(yī)學(xué)院倫理委員會審核批準（倫動科批字[2020]第057號）。

1.2 藥品與試劑

WP1130（上海陶素生化，純度＞99%）；巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF）（Novoprotein）；尼日利亞菌素（nigericin）、三磷酸腺苷（ATP）、尿酸單鈉晶體（MSU）、佛波酯（PMA）（Sigma）；脂多糖（LPS）、聚脫氧腺苷酸（poly A: T）、Pam3CSK4（Invivogen）；Lipofectamine2000（Invitrogen）；RPMI 1640培養(yǎng)基、高糖DMEM 培養(yǎng)基、OPTI-MEM 培養(yǎng)基、胎牛血清（Gibco）；ELISA 試劑盒（Mouse IL-1β、IL-6、TNF-α，Human IL-1β、TNF-α ELISA kit）（R&D）；人caspase-1（p20）、pro-caspase-1 抗 體（Human caspase-1）（Cell SignalingTechnology）；鼠caspase-1（p20）、pro-caspase-1抗體（Mouse caspase-1）（AdipoGen）；β-actin 抗體（Abmart）；辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗鼠IgG和山羊 抗 兔IgG（Jackson IR）；Mitotracker、DAPI（Thermo Fisher）。

1.3 動物分組及處理

SPF 級雄性C57BL/6 小鼠隨機分成空白對照組（Control組）、感染性休克組（LPS組）和WP1130治療組（WP1130+LPS組），每組6只，空白對照組不給予LPS造模，WP1130 治療組小鼠腹腔注射WP1130 溶液（10 mg/kg）1 h后，LPS組和治療組小鼠同時腹腔注射等劑量的LPS溶液（20 mg/kg），空白對照組腹腔注射等體積的PBS溶液。4 h后，眼球取血，頸椎脫臼法處死小鼠并收集小鼠腹腔液。

1.4 細胞刺激分化

BMDM細胞誘導(dǎo)分化：頸椎脫臼法處死小鼠，剝離出小鼠的脛骨和股骨，無菌條件下用20 mL注射器吸取20 mL DMEM細胞培養(yǎng)基沖洗小鼠骨髓細胞，離心，加入2～3 mL 紅細胞裂解液吹打，用含有M-CSF 的DMEM完全培養(yǎng)基重懸細胞，5%CO2、37 ℃條件下分化4～6 d可獲得貼壁生長的BMDM細胞。分化后的細胞呈細長梭形，通過流式細胞術(shù)鑒定巨噬細胞表面標志物（F4/80+CD11b+細胞亞群）。人THP-1細胞誘導(dǎo)分化：1×106/mL THP-1細胞中加入含有400 ng/mL PMA的RPMI 1640完全培養(yǎng)基刺激過夜，細胞貼壁分化成梭形并用流式細胞術(shù)鑒定。

1.5 炎癥小體活化刺激

分化完成的小鼠BMDM和人THP-1細胞按每孔5×105個細胞分別接種于12孔板中培養(yǎng)過夜，加入LPS（100 ng/mL）預(yù)刺激4 h后，分別加入多種經(jīng)典的NLRP3炎癥小體活化劑，其中nigericin、ATP活化細胞30 min，MSU活化細胞3 h。加入Pam3CSK4（200 ng/mL）預(yù)刺激4 h后，胞內(nèi)轉(zhuǎn)染LPS活化非經(jīng)典NLRP3炎癥小體。加入LPS（100 ng/mL）預(yù)刺激4 h后，轉(zhuǎn)染poly A:T（1 μg/mL）刺激4 h，活化黑色素瘤缺乏因子2（AIM2）炎癥小體。

1.6 蛋白免疫印跡實驗（Western blotting）

檢測caspase-1（p20）、pro-caspase-1（Pro-casp1）蛋白表達。收集細胞培養(yǎng)上清，利用甲醇氯仿法提取上清中的蛋白，加入裂解液；12孔板中直接加入裂解液裂解細胞，轉(zhuǎn)至1.5 mL EP管中，與上清蛋白裂解液一同金屬浴100 ℃煮10 min。將收集的蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳，恒壓90V轉(zhuǎn)膜1 h，5%BSA室溫封閉2 h，加入一抗抗體，4 ℃搖床上孵育過夜，PBST洗膜3次，10 min/次，隨后加入二抗抗體（1∶10 000）室溫孵育1 h 30 min，PBST洗膜3次后凝膠成像儀顯影。

1.7 酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）

收集細胞培養(yǎng)上清及小鼠血清和腹腔液，離心去沉淀，按照ELISA試劑盒說明書檢測IL-1β、白細胞介素6（IL-6）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）的分泌水平，主要步驟包括稀釋捕獲抗體包被至96孔酶標板，室溫靜置過夜，10%FBS封閉30 min，加入標準品和樣本2 h，加入檢測抗體1 h，加入HRP孵育20 min，加入底物TMB顯色5～10 min，1 mol/L H2SO4終止反應(yīng)，酶標儀450 nm測定吸光度值，繪制標準曲線計算樣品濃度。

1.8 線粒體損傷檢測

將細胞按2×105/mL接種于提前放置了細胞爬片的12孔細胞培養(yǎng)板中，置于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜；LPS（100 ng/mL）預(yù)刺激4 h 后，加入WP1130 處理細胞30 min 后，加入Nigericin 活化細胞，細胞活化結(jié)束前30 min各組加入線粒體染料Mitotracker（200 nmol/L）；孵育結(jié)束后，棄去上清，加入PBS洗3次，4%多聚甲醛室溫固定15 min；隨后PBST洗3次，10 min/次；DAPI染色并封片，室溫避光過夜；利用激光共聚焦顯微鏡觀察并拍照。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

采用GraphPad Prism 8軟件進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學(xué)分析，所用數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差表示。兩組之間的比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 WP1130 抑制Nigericin 誘導(dǎo)的NLRP3 炎癥小體活化

Western blot 檢測結(jié)果顯示，WP1130 劑量依賴性地抑制了caspase-1 的分泌（P＜0.05，圖1A、B），對pro-caspase-1（Pro-casp1）的表達無顯著抑制（P＞0.05，圖1A、C）。ELISA檢測結(jié)果顯示，WP1130劑量依賴性地抑制了細胞培養(yǎng)上清液中IL-1β的分泌水平（P＜0.001，圖1D），對核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF-κB）信號通路活化產(chǎn)生的非炎癥體依賴性細胞因子TNF-α、IL-6的分泌無明顯影響（P＞0.05，圖1E、F）。

圖1 WP1130抑制nigericin誘導(dǎo)的NLRP3炎癥小體活化Fig.1 WP1130 suppresses Nigericin-induced NLRP3 inflammasome activation in mouse bone marrow-derived macrophages(BMDM).A:Western blotting of cleaved caspase-1(p20)in the culture supernatants(SN)and pro-caspase-1(Pro-casp1)in the cell lysate(Input)of BMDM.B,C:Quantitative analysis of the expressions of p20 and Pro-casp1 in BMDM.D-F:ELISAof IL-1β，TNF-α and IL-6 in cell culture supernatants,respectively.**P＜0.01,***P＜0.001.

2.2 WP1130 抑制其他活化劑誘導(dǎo)的NLRP3 炎癥小體活化

Western blot檢測結(jié)果顯示，WP1130劑量依賴性地抑制了ATP 和MSU 活化NLRP3 炎癥小體誘導(dǎo)的caspase-1的表達（P＜0.05，圖2A、B），但對pro-caspase-1的蛋白表達無顯著影響（P＞0.05，圖2A、B）。ELISA檢測結(jié)果顯示，WP1130劑量依賴性地抑制了細胞培養(yǎng)上清液中IL-1β的分泌水平（P＜0.001，圖2C、D）。

圖2 WP1130抑制ATP和MSU誘導(dǎo)的NLRP3炎癥小體活化Fig.2 WP1130 inhibits NLRP3 inflammasome activation in BMDM induced by other agonists.A,B:Western blotting of p20 in supernatants (SN) and Pro-casp1 in cell lysates (Input) of BMDM.C,D: ELISA of mature IL-1β in the culture supernatant of BMDM.*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001.

2.3 WP1130抑制非經(jīng)典NLRP3炎癥小體活化

Western blot檢測結(jié)果顯示，WP1130劑量依賴性地抑制了非經(jīng)典NLRP3炎癥小體活化產(chǎn)物caspase-1的產(chǎn)生（P＜0.05，圖3A、B），但對pro-caspase-1的表達無顯著影響（P＞0.05，圖3A、C）。ELISA檢測結(jié)果顯示，WP1130劑量依賴性地抑制了細胞培養(yǎng)上清液中IL-1β的水平（P＜0.001，圖3D）。

圖3 WP1130抑制非經(jīng)典NLRP3炎癥小體活化Fig.3 WP1130 inhibits non-canonical NLRP3 inflammasome activation in BMDM.A:Western blotting of p20 in culture supernatants(SN)and Pro-casp1 in lysates(Input)of BMDM.B,C:Quantitative analysis of the expressions of p20 and Pro-casp1 in BMDM.D:ELISAof mature IL-1β in the culture supernatant of BMDM.*P＜0.05,***P＜0.001.

2.4 WP1130對AIM2炎癥小體活化無影響

Western blot 檢測結(jié)果顯示，與WP1130 抑制nigericin活化NLRP3炎癥小體相比，加入WP1130并不抑制poly A:T 活化AIM2 炎癥小體介導(dǎo)的caspase-1的蛋白表達（P＞0.05，圖4A、B），同時WP1130 對procaspase-1 的表達無顯著影響（P＞0.05，圖4A、C）。ELISA 檢測結(jié)果顯示，WP1130 抑制nigericin 誘導(dǎo)的IL-1β分泌，對poly A:T誘導(dǎo)的IL-1β分泌無顯著抑制作用（P＞0.05，圖4D）。

圖4 WP1130對AIM2炎癥小體活化無影響Fig.4 WP1130 does not affect AIM2 inflammasome activation in BMDM.A:Western blotting of p20 in culture supernatants (SN) and Pro-casp1 in lysates (Input) of BMDM.B,C:Quantitative analysis of the expressions of p20 and Pro-casp1 in BMDM.D:ELISA of mature IL-1β in the culture supernatant of BMDM.***P＜0.001 vs control.

2.5 WP1130 抑制人THP-1 細胞中NLRP3 炎癥小體活化

Western blot 檢測結(jié)果顯示，nigericin 誘導(dǎo)了人THP-1細胞中NLRP3炎癥小體活化，促進caspase-1的表達，加入WP1130可劑量依賴性地抑制細胞培養(yǎng)上清中caspase-1的表達（P＜0.05，圖5A、B），但對細胞裂解液中pro-caspase-1的表達無顯著影響（P＞0.05，圖5A、C）。ELISA檢測結(jié)果顯示，WP1130劑量依賴性地抑制細胞培養(yǎng)上清中IL-1β的分泌（P＜0.05，圖5D），TNF-α的分泌水平各組無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05，圖5E）。

圖5 WP1130抑制人THP-1細胞中NLRP3炎癥小體活化Fig.5 WP1130 inhibits NLRP3 inflammasome activation in human THP-1 cells.A: Western blotting of p20 in culture supernatants(SN)and Pro-casp1 in lysates(Input)of human THP-1 cells.B,C:Quantitative analysis of the expressions of p20 and Pro-casp1 in human THP-1 cells.D,E: ELISA of IL-1β (D) and TNF-α (E) in the culture supernatant of THP-1 cells.**P＜0.01,***P＜0.001.

2.6 WP1130不影響nigericin刺激引起的線粒體損傷

激光共聚焦顯微鏡觀察線粒體染色結(jié)果顯示，空白對照組與單加WP1130處理組線粒體形態(tài)正常無損傷，加入nigericin 顯著誘導(dǎo)了線粒體的斷裂和聚集。與nigericin組相比，nigericin+WP1130組線粒體仍表現(xiàn)為斷裂和聚集這一損傷形態(tài)（圖6）。

2.7 WP1130對小鼠感染性休克的影響

ELISA 結(jié)果顯示，與空白對照組相比，腹腔注射LPS導(dǎo)致小鼠血清和腹腔液中IL-1β、TNF-α的分泌顯著增高，與感染性休克組（LPS組）相比，WP1130治療組（WP1130+LPS 組）明顯降低了小鼠血清和腹腔液中IL-1β的分泌水平（P＜0.05，圖7A、C），但對NF-κB信號通路介導(dǎo)的細胞因子TNF-α的產(chǎn)生無顯著影響（P＞0.05，圖7B、D）。

圖7 WP1130緩解LPS誘導(dǎo)的小鼠感染性休克Fig.7 WP1130 alleviates LPS-induced septic shock in mice.A,B: Levels of IL-1β (A) and TNF-α (B) determined with ELISA in the serum from C57BL/6 mice in control,LPS-treated and LPS plus WP1130-treated mice.C,D:Levels of IL-1β (C) and TNF-α (D) in peritoneal lavage fluid measured by ELISA.**P＜0.01,***P＜0.001.

3 討論

NLRP3炎癥小體與多種感染性疾病相關(guān)，可被多種病原體激活，導(dǎo)致炎性因子的大量釋放，引發(fā)多種炎癥性疾病，如膿毒血癥［20］、炎癥性腸病［21］、痛風(fēng)［22］等，因此阻斷NLRP3炎癥小體活化成為治療NLRP3炎癥小體相關(guān)疾病的新策略［23］。已有研究表明WP1130具有抗感染作用，可抑制一些細菌和病毒病原體的細胞內(nèi)復(fù)制，其抗感染作用是否與NLRP3炎癥小體有關(guān)尚不清楚，本研究通過細胞實驗和體內(nèi)動物實驗探究小分子化合物WP1130 對NLRP3炎癥小體活化的影響。

多種病原相關(guān)分子信號和危險相關(guān)分子信號可誘導(dǎo)NLRP3炎癥小體活化，剪切caspase-1，促進IL-1β分泌［24-26］，本研究首先利用nigericin活化炎癥小體，初步證實了WP1130能夠抑制NLRP3炎癥小體活化，利用另外兩種經(jīng)典活化劑ATP和MSU，進一步證實WP1130可廣譜的抑制NLRP3炎癥小體活化，且相較于其他小分子去泛素化酶抑制劑，如P22077［27］，WP1130發(fā)揮抑制作用的濃度更低，效果更好。此外，NLRP3炎癥小體存在非經(jīng)典激活途徑，caspase-11識別胞內(nèi)LPS，從而誘導(dǎo)非經(jīng)典NLRP3炎癥小體活化［28］，本研究表明WP1130也抑制NLRP3炎癥小體非經(jīng)典途徑的活化。

目前研究較多的其他經(jīng)典炎癥小體還包括AIM2炎癥小體，其激活可保護機體免受感染［29］，本研究表明WP1130對AIM2炎癥小體的激活并無影響，僅特異性的抑制NLRP3 炎癥小體活化。進一步探究發(fā)現(xiàn)WP1130不僅作用于小鼠細胞，其在人THP-1細胞中對NLRP3炎癥小體活化同樣有顯著抑制效果。

NLRP3炎癥小體的活化需要兩個關(guān)鍵信號，預(yù)刺激信號和組裝活化信號［30］，本研究結(jié)果顯示，WP1130對預(yù)刺激信號介導(dǎo)的NF-κB信號通路的激活無影響，提示W(wǎng)P1130可能影響組裝活化信號階段。其中線粒體損傷被認為是NLRP3炎癥小體組裝活化的重要上游信號［31-33］，NLRP3炎癥小體活化劑通過產(chǎn)生大量線粒體活性氧并將其釋放到胞質(zhì)誘導(dǎo)線粒體損傷，從而激活NLRP3炎癥小體［34］，本研究中共聚焦顯微鏡結(jié)果表明WP1130并不影響線粒體損傷這一重要上游信號，提示W(wǎng)P1130可能直接影響NLRP3炎癥小體復(fù)合物的組裝過程。

NLRP3炎癥小體的異常活化會導(dǎo)致大量炎性因子釋放，腹腔注射LPS誘導(dǎo)的感染性休克是一種常見的NLRP3炎癥小體相關(guān)的急性疾病模型，主要由細菌感染引起，伴有嚴重的全身性炎癥反應(yīng)，感染性休克發(fā)生過程中，會導(dǎo)致血清和腹腔液中細胞因子的分泌增加，如IL-1β、TNF-α［35-37］。本研究通過腹腔注射LPS構(gòu)建小鼠感染性休克模型，結(jié)果表明WP1130可顯著抑制小鼠血清和腹腔液中IL-1β的分泌，但對非炎癥小體依賴的細胞因子TNF-α無影響。以上結(jié)果證實WP1130可在體內(nèi)外抑制NLRP3炎癥小體活化，緩解相關(guān)疾病。但WP1130抑制NLRP3炎癥小體的具體作用機制還需后續(xù)研究去闡明。

綜上所述，本研究證實WP1130抑制多種激動劑誘導(dǎo)的NLRP3炎癥小體活化，對NLRP3炎癥小體的活化具有特異性，在鼠和人細胞中均有良好抑制效果，通過阻斷體內(nèi)NLRP3炎癥小體激活，減輕了LPS誘導(dǎo)的感染性休克。本研究的發(fā)現(xiàn)為后續(xù)深入研究WP1130抑制NLRP3炎癥小體活化可能的作用機制提供了實驗依據(jù)，也為治療感染性休克以及其他NLRP3炎癥小體相關(guān)疾病提供了新的方向和策略。