我國不同產(chǎn)地黨參藥材中糖類成分比較分析

黃延盛，張欣，劉耀軍，胡流云，王長虹，王崢濤，黃曉君

(1.無限極(中國)有限公司，廣東 廣州 510623；2.上海中藥標(biāo)準(zhǔn)化研究中心，上海 2012033.南昌大學(xué)a.食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室;b.中國-加拿大食品科學(xué)與技術(shù)聯(lián)合實驗室c.江西省生物活性多糖實驗室，江西 南昌 330047)

黨參屬(Codonopsis)隸屬桔?？?Campanulaceae)，全屬共40余種，我國有39種，野生黨參主要分布于西南各省區(qū)，栽培黨參則主產(chǎn)于西北、華北地區(qū)[1]。本屬植物黨參(Codonopsispilosula(Franch.)Nannf.)、素花黨參(C.pilosulavar.modesta(Nannf.)L.T.Shen.)及川黨參(C.tangshenOliv.)為2010版《中國藥典》收載品種[2]，其干燥根作為黨參入藥，具有補中益氣，健脾益肺之功效[3]。用于脾肺虛弱、氣短心悸、食少便溏、虛喘咳嗽、內(nèi)熱消渴等癥[4-8]。黨參屬大多數(shù)種類的根部都具有藥用價值，一些種類如管花黨參(C.tubulosaKom.)、球花黨參(C.subglobosaSrnith.)、灰毛黨參(C.canescensNannf.)、新疆黨參(C.clematidea(Schrenk)Clarke.)等在臨床上也作為黨參使用[9]。

黨參中含有單糖、低聚糖和多糖等糖類物質(zhì)，單糖有果糖，低聚糖有菊糖等[10-12]。黨參多糖同其他藥用植物多糖一樣，具有廣泛的藥理作用，主要包括調(diào)節(jié)機體免疫、清除自由基和造血等作用，其中尤以黨參多糖的免疫調(diào)節(jié)作用研究得較多和較深入，主要表現(xiàn)為增強免疫作用，與黨參補中益氣、健脾益肺之功效相符[13-14]。從化學(xué)組成可見，素花黨參多糖由甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖6種單糖組成，HPLC法測得其物質(zhì)的量比為0.07:0.22:1.00:4.38:0.81:1.40，主要含有葡萄糖、阿拉伯糖和半乳糖醛酸[15]。GC法分析表明，黨參粗多糖的單糖組成為阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、半乳糖醛酸、木糖，物質(zhì)的量比依次為1.0:10.5:2.0:1.4:1.0[16]。另一研究結(jié)果表明，黨參中性雜多糖COP-Ⅰ的單糖組成為甘露醇、果糖、葡萄糖，物質(zhì)的量比為1:0.05:1.56；黨參酸性雜多糖COP-Ⅱ的單糖組成為甘露醇、果糖、葡萄糖和半乳糖，物質(zhì)的量比為1:0.11:1.07:0.37。由此可以看出，不同品種的黨參多糖的組成和物質(zhì)的量比均存在一定的差異[17]。這些研究為黨參多糖的結(jié)構(gòu)分析奠定了基礎(chǔ)。黨參多糖含量高低可以初步反映黨參藥材質(zhì)量的好壞，是鑒別黨參藥材的方法之一。

目前，對于黨參中多糖含量測定方法已有很多，多采用苯酚-硫酸法測定其多糖含量，該方法具有操作簡單、快速、重復(fù)性好、顯色后穩(wěn)定性較好等優(yōu)點，但對有色樣品結(jié)果易偏高[18]。多糖可用與其組成結(jié)構(gòu)相近的多糖作標(biāo)準(zhǔn)曲線，但更多的情況下是以相應(yīng)的單糖作標(biāo)準(zhǔn)。本研究通過測定黨參的多糖含量、單糖組成，以及建立黨參中5種糖類成分的HPLC-ELSD定量分析方法，并通過測定35批黨參中5種糖類成分含量，為黨參質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中糖類成分含量測定項的完善提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黨參藥材，35批黨參主要來源于甘肅、貴州、山西、湖北、四川等黨參主產(chǎn)區(qū)，包括2015版《中國藥典》收錄的3種黨參藥材：黨參、素花黨參、川黨參。由上海中藥標(biāo)準(zhǔn)化研究中心吳立宏研究員鑒定，其性狀與2015年版《中國藥典》所規(guī)定的黨參藥材一致，鑒定為正品。

無水葡萄糖、苯酚、濃硫酸、三氟乙酸、冰醋酸、乙酸酐、鹽酸、硼氫化鈉、甲醇、甲苯、氯仿(分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司)；三乙胺、乙腈、甲醇、甲酸(色譜純，美國Fisher公司);D-(+)-葡萄糖、D-果糖、蔗糖(分析純，上海源葉生物科技有限公司)；蔗果三糖、蔗果四糖(分析純，上海西寶生物藥業(yè)有限公司)。

1.2 儀器與設(shè)備

KQ-250DB數(shù)控超聲波清洗儀(江蘇昆山市超聲儀器有限公司)；高速離心機(美國BECKMAN公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀N-1001、OSB-2000水浴鍋(日本EYELA公司)；BP211D電子分析天平(德國Sartourius公司)；MILLI-Q超純水制備儀(美國Millipore公司)；Agilent1100高效液相色譜儀；Agilent GC-MSD7890B氣質(zhì)聯(lián)用色譜儀(美國Agilent公司)。

色譜柱：X-Bridge Amide C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，3.5 μm)(美國Waters公司)

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

每個產(chǎn)地黨參樣品中挑選200 g無霉變、外觀良好的黨參用粉碎機粉碎，過藥典標(biāo)準(zhǔn)3號篩(篩孔孔徑為0.355 mm)備用。

1.3.2 黨參多糖含量測定

1.3.2.1 標(biāo)準(zhǔn)液的配制

精密稱取經(jīng)105 ℃干燥至恒重的無水葡萄糖900 mg置100 mL容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻；精密量取該溶液1.0 mL置100 mL容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻,即得90.0 μg·mL-1的葡萄糖溶液。

1.3.2.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密量取對照品溶液0.2，0.4，0.6，0.8，0.9，1.0 mL，分別置于10.0 mL具塞試管中，各加水補至1.0 mL，精密加入質(zhì)量分數(shù)為5%的苯酚溶液1.0 mL(臨用配制)，搖勻，再精密加濃硫酸5.0 mL，搖勻，至沸水浴中加熱30 min后取出，迅速置于冰水浴中冷卻5 min，空白對照以1.0 mL蒸餾水代替葡萄糖對照品溶液，照紫外-可見分光光度法，在482 nm下測定吸光度，以吸光度(x)為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度(y)為橫坐標(biāo)，進行線性回歸，得回歸方程：y=0.009x-0.008 6,R2=0.998 6。結(jié)果表明，葡萄糖質(zhì)量濃度在18.01～90.05 μg·mL-1范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

ρ/(μg·mL-1)圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve

1.3.2.3 樣品前處理

取黨參粉末1.0 g，精密稱定，加水200 mL，加熱回流2.0 h，放冷，轉(zhuǎn)移至250 mL容量瓶，用少量水分次洗滌容器，洗滌液并入容量瓶中，加水至刻度，搖勻，過濾。精密量取續(xù)濾液3.0 mL至離心管中，加入無水乙醇15.0 mL，搖勻，冷藏1.0 h，取出，離心15 min(轉(zhuǎn)速為4 000 r·min-1)，棄去上清液，沉淀加體積分數(shù)為80%的乙醇洗滌2次，每次8.0 mL，離心，棄去上清液，沉淀加熱水溶解，轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，放冷，加水至刻度，搖勻，即得。

1.3.2.4 多糖含量的測定

精密量取樣品溶液1.0 mL，按照“葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制”的方法測定其吸光度，計算出不同批次黨參多糖含量。

1.3.3 黨參多糖的單糖組成分析

1.3.3.1 黨參多糖的提取與精制

分別取10.0 g黨參(S7、S21、S31)藥材粗粉，精密稱定，置于圓底燒瓶中，加入250 mL石油醚脫脂，回流提取2.0 h過濾，藥渣揮盡石油醚后，以80%乙醇500 mL浸漬過夜，85 ℃回流提取2次，每次1.5 h，過濾，藥渣加蒸餾水浸漬1.0 h后，100 ℃回流提取60 min，過濾，再用500 mL蒸餾水100 ℃提取30 min，過濾，合并濾液，減壓濃縮至150 mL，與等體積Sevage試劑(V(三氯甲烷)：V(正丁醇)=4:1)混合，振搖，以除去蛋白質(zhì)。加體積分數(shù)為95%的乙醇使含醇量達80%(V/V)冰箱靜置過夜。過濾，殘渣先后用95%乙醇、無水乙醇、乙醚、丙酮依次多次洗滌，凍干，即得精制黨參多糖0.72 g。得率為7.2%。其中S7為純白色疏松粉末，S21為白色粉末，S31為灰白色粉末。

1.3.3.2 多糖水解及單糖衍生化產(chǎn)物的制備

稱取3.0 mg精制黨參多糖，轉(zhuǎn)入10 mL安瓿瓶中，各加入3.0 mL 2 mol·L-1三氟乙酸溶解，拉絲封口，120 ℃油浴中水解反應(yīng)2.0 h，取出轉(zhuǎn)移到心形瓶，減壓蒸干，加甲醇蒸干3次，以完全除盡三氟乙酸；殘余物加入50.0 mg NaBH4和2.0 mL水，混勻后室溫還原反應(yīng)過夜(還原8.0 h以上即可)；加適量冰醋酸以除去過量的NaBH4，減壓濃縮至黏稠液體；加入冰醋酸-甲醇(體積比1:5)3.0～5.0 mL，蒸干3次，再加乙腈蒸干2次，得到白色粉末，放入烘箱105 ℃加熱5 min以除去水分，快速加入3.0 mL乙酸酐，置101 ℃烘箱中乙?；磻?yīng)1.0 h，取出，加適量水溶解靜置10 min，加2.0～3.0 mL氯仿用水萃取3次，吸出上層水層，取出氯仿層，用無水硫酸鈉干燥濃縮至0.5 mL進行GC-MS分析(適量棉花堵住1.0 mL槍頭，用無水硫酸鈉填充，讓樣品溶液濾過槍頭流入氣相小瓶)。標(biāo)準(zhǔn)品與樣品同時處理，進樣。

1.3.3.3 氣相條件

GC-MS程序升溫條件：起始溫度120 ℃，以2 ℃·min-1升溫至180 ℃，保溫4 min，再以1 ℃·min-1升溫至200 ℃，最后以3 ℃·min-1升溫至250 ℃，保持5 min；進樣口溫度為250 ℃；氦氣載氣，流速為1 mL·min-1。單糖標(biāo)準(zhǔn)品與樣品進行圖譜對照。提取特征峰為115m/z。

1.3.4 黨參中單糖及低聚果糖含量測定

1.3.4.1 對照品溶液的制備

分別稱取D-果糖、D-葡萄糖、蔗糖、蔗果三糖、蔗果四糖對照品適量，精密稱定，加入60%甲醇(V/V)制成每毫升含D-果糖0.607 4 mg、D-葡萄糖0.504 8 mg、蔗糖0.590 3 mg、蔗果三糖0.561 1 mg、蔗果四糖0.685 7 mg的溶液，即得。

1.3.4.2 樣品前處理

取本品細粉約0.05 g，精密稱定，置100 mL具塞錐形瓶中，精密加入60%甲醇10.0 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理(功率250 W,頻率40 kHz)60 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用60%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，過濾，精密量取濾液2.0 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，過濾取濾液，即得。

1.3.4.3 色譜條件

Waters X-Bridge Amide C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，3.5 μm)；以乙腈(A)-甲醇(B)-0.05%三乙胺水(C)為溶劑按表2進行梯度洗脫，流速1.0 mL·min-1，柱溫40 ℃，蒸發(fā)光散射檢測器采用撞機器關(guān)(impactor off)的模式，漂移管溫度控制在100 ℃，氣體流速1.5 mL·min-1。

2 結(jié)果與分析

2.1 黨參多糖含量測定

2.1.1 最優(yōu)反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間的篩選

2.1.1.1 反應(yīng)溫度的考察

取供試品溶液共4份，每份3個平行樣，經(jīng)苯酚-濃硫酸顯色后，分別在40，60，80，100 ℃保溫0.5 h，考察吸光度值變化。結(jié)果表明接近沸水浴的溫度，吸光度越接近，即此階段反應(yīng)溫度為最佳反應(yīng)溫度。最終反應(yīng)溫度確定為100 ℃。

2.1.1.2 反應(yīng)時間的考察

取供試品溶液5份，每份3個平行樣，經(jīng)苯酚-濃硫酸顯色后，分別在不同反應(yīng)時間10，20，30，45，60 min保溫后，考察吸光度變化。結(jié)果表明10～60 min之間吸光度無明顯變化，即反應(yīng)時間對吸光度無明顯影響。故最終反應(yīng)時間取中間時間點為30 min。

表2 反應(yīng)時間考察表(n=3)Tab.2 Reaction time(n=3)

2.1.2 方法學(xué)考察結(jié)果

2.1.2.1 精密度試驗結(jié)果

精確量取樣品1.0 mL，按照“葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制”的方法測定其吸光度，進行5次平行測定。結(jié)果的RSD為0.006 9%，表明儀器精密度良好。

表3 精密度試驗Tab.3 Precision experiment

2.1.2.2 重復(fù)性試驗結(jié)果

精確量取1.0 mL黨參樣品，平行5份，按照“葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制”的方法測定其吸光度，結(jié)果RSD為4.35%，表明方法重復(fù)性良好。

表4 重復(fù)性試驗Tab.4 Repeatability experiment

2.1.2.3 穩(wěn)定性試驗結(jié)果

精確量取樣品1.0 mL,然后按照“葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制”的方法測定其吸光度，分別在0，10，20，30，45，60，90，120 min時測定吸光度值。結(jié)果表明供試樣品溶液在2.0 h內(nèi)是穩(wěn)定的。

表5 穩(wěn)定性試驗結(jié)果Tab.5 Stability experiment

2.1.2.4 加樣回收率試驗結(jié)果

精密量取0.5 mL 15號黨參樣品液6份，分別加入質(zhì)量濃度為0.066 41 mg·mL-1的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液0.5 mL，按照“葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制”的方法測定其吸光度，結(jié)果見表6。

2.1.2.5 多糖含量測定結(jié)果

精密量取樣品溶液1.0 mL，按照“葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制”的方法測定其吸光度，計算出不同批次黨參多糖含量，結(jié)果見表7。

表6 加樣回收率試驗結(jié)果(n=6)Tab.6 Recovery experiment(n=6)

表7 黨參藥材多糖含量測定結(jié)果(n=2)Tab.7 Polysaccharide content of Codonopsis pilosula (n=2)

結(jié)果表明，35批黨參中，多糖含量在5.3%～28.1%的范圍，平均含量為16.9%±6.0%。按照下浮20%計算，可暫定含多糖不得低于13.5%。

2.2 黨參單糖組成分析結(jié)果

將3批不同品種黨參，分別是產(chǎn)于甘肅省渭源縣的素花黨參S7(西黨)、湖北省恩施市的川黨參S23(板黨)以及產(chǎn)于山西省陵川縣的黨參S31(潞黨)，按氣相條件進樣，3種黨參糖組成圖譜見圖2。

t/minA.潞黨；B.板黨；C.西黨；D.單糖混合標(biāo)準(zhǔn)品。1.鼠李糖；2.阿拉伯糖；3.木糖；4.甘露糖；5.葡萄糖；6.半乳糖。

可知，3種基源黨參的多糖組成大致相同，均含有鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖。并且3種黨參的物質(zhì)的量比分別為：素花黨參S7=0.8:1.2:0.4:19.2:6.8；川黨參S23=1.4:3.2:0.8:21.2:6.8；黨參S31=1.6:1.9:1.4:20.2:6.8。

2.3 黨參中單糖及低聚果糖含量測定結(jié)果分析

2.3.1 對照品與樣品色譜圖

黨參中主要單糖及低聚果糖為D-果糖、D-葡萄糖、蔗糖、蔗果三糖、蔗果四糖。HPLC-ELSD色譜圖如圖3。

圖3 混合對照品和樣品的HPLC-ELSD色譜圖Fig.3 HPLC-ELSD chromatograms of mixed reference and sample

2.3.2 方法學(xué)考察

2.3.2.1 線性關(guān)系及定量限、檢測限的考察

精密吸取“對照品溶液的制備”項下5種糖類對照品溶液適量，制成混合標(biāo)準(zhǔn)品貯備液，并逐級稀釋成一系列標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液，進樣10.0 μL，得到各標(biāo)準(zhǔn)對照品的標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍，并分別按信噪比(S:N)為3:1和10:1計算各標(biāo)準(zhǔn)品的檢測限和定量限，結(jié)果如表8。

表8 黨參中5種糖類成分的線性方程、線性范圍以及其定量限和檢測限Tab.8 Linear equation,range and the limit of quantitation and detection between five kinds of carbohydrate components of Codonopsis pilosula

2.3.2.2 精密度考察

取高、中、低3種不同質(zhì)量濃度混合對照品溶液各10.0 μL，連續(xù)進樣6次，分別計算D-果糖、D-葡萄糖、蔗糖、蔗果三糖和蔗果四糖的日內(nèi)、日間精密度。5種物質(zhì)峰面積的日內(nèi)、日間精密度RSD均在5%以內(nèi)，表明儀器及進樣精密度良好，結(jié)果見表9。

表9 D-果糖、D-葡萄糖、蔗糖、蔗果三糖和蔗果四糖的日內(nèi)、日間精密度Tab.9 Intra-day and inter-day precision of D-fructose,D-glucose,Sucrose,Kestose,Nystose

2.3.2.3 重復(fù)性實驗結(jié)果

取7號樣品細粉0.05 g，精密稱定，按供試品溶液制備方法操作，平行制備6份供試品溶液，測得D-果糖、D-葡萄糖、蔗糖、蔗果三糖和蔗果四糖的平均含量分別為6.8%、1.0%，4.0%，1.2%和0.6%，RSD分別為1.82%，1.91%，1.94%，0.93%，1.38%，表明重復(fù)性良好。

2.3.2.4 穩(wěn)定性實驗結(jié)果

精密吸取同一供試品溶液(S7)，分別于0，1，3，5，9，12，18，24，36 h進樣，測定D-果糖、D-葡萄糖、蔗糖、蔗果三糖和蔗果四糖的峰面積，其峰面積的RSD分別為3.49%，2.81%，2.76%，2.43%，2.15%，表明供試品溶液在36 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.2.5 加樣回收率實驗結(jié)果

取黨參藥材(S7)9份，分別按已知質(zhì)量含量的80%，100%，120%加入D-果糖、D-葡萄糖、蔗糖、蔗果三糖和蔗果四糖對照品溶液，每一比例平行做3份；按供試品溶液制備方法操作，計算各成分的加樣回收率，5種物質(zhì)的加樣回收率見表10。

2.3.3 樣品檢測結(jié)果

35批黨參和飲片中D-果糖、D-葡萄糖、蔗糖、蔗果三糖和蔗果四糖的含量測定，見表11和圖4。

表10 D-果糖、D-葡萄糖、蔗糖、蔗果三糖和蔗果四糖的加樣回收率(n=9)Tab.10 Recovery experiment of D-fructose，D-glucose，sucrose，kestose，nystose

表11 黨參原藥材中35批黨參和飲片中D-果糖、D-葡萄糖、蔗糖、蔗果三糖和蔗果四糖的含量(n=2,以干燥品計算含量)Tab.11 The content of D-fructose，D-glucose，sucrose，kestose，nystose in sample of Codonopsis pilosula

圖4 黨參中5種糖類物質(zhì)含量比較Fig.4 Comparison of the contents of five sugars in Codonopsis pilosula

從圖4看出黨參中35批黨參和飲片中D-果糖、D-葡萄糖、蔗糖、蔗果三糖和蔗果四糖的含量存在種內(nèi)和種間差異。其中D-果糖、蔗糖和葡萄糖為黨參藥材中主要糖類成分，不同品種之間差異較大，質(zhì)量含量范圍分別為10.69～157.54，5.36～23.06和8.00～50.38 mg·g-1。其中D-果糖含量在S1～S10(素花黨參)中相對較低，在S12～S19(素花黨參)樣品中含量相對較高。D-果糖在S20～S28(川黨參)中含量與素花黨參相當(dāng)，并且隨著生長年限的增加逐漸增加。D-葡萄糖在素花黨參中的含量分布和D-果糖類似。蔗糖含量在3種黨參中差異較大，總體而言素花黨參>黨參>川黨參。

3 結(jié)論

本文通過使用HPLC-ELSD方法對我國5個主要黨參產(chǎn)區(qū)(甘肅、貴州、山西、湖北、四川)的黨參、素花黨參和川黨參中的多糖含量、單糖組成、D-果糖等5種單糖以及低聚糖進行定量分析，并制定黨參相關(guān)的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。其中35批黨參藥材中，多糖的平均質(zhì)量分數(shù)為16.9%±6.0%，但不同來源的黨參多糖含量差異較大，對其品質(zhì)影響較大。不同品種黨參多糖的單糖組成成分基本相似且含量大致相同，均含有鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖，葡萄糖和半乳糖是黨參中主要的單糖成分，可作為真?zhèn)舞b別指標(biāo)。35批黨參中，5種單糖和低聚糖(D-果糖、D-葡萄糖、蔗糖、蔗果三糖和蔗果四糖)的總平均質(zhì)量分數(shù)為19.91%，其中總含量最高的黨參比最低值高達8.4倍，造成黨參之間的品質(zhì)差異較大。根據(jù)平均含量下浮20%的標(biāo)準(zhǔn)，建議設(shè)定黨參中多糖含量質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)為≥13.5%；5種糖類成分總質(zhì)量分數(shù)不得低于15.92%。本文通過對主要產(chǎn)地和品種黨參糖類成分的分析及研究，并制定相應(yīng)質(zhì)量控制要求，可為選擇適宜品種黨參作為食品原料時提供一定的數(shù)據(jù)支持。