國(guó)產(chǎn)雪茄煙葉堆積發(fā)酵過(guò)程中的微生物變化規(guī)律及差異分析

潘 勇，吳巧茵，李林林，譚再鈺，李俊瑤，張 娟，施友志

（1. 湖北中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，湖北 武漢 430040；2. 江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122；3. 江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122；4. 江南大學(xué) 未來(lái)食品科學(xué)中心，江蘇 無(wú)錫 214122）

近年來(lái)，國(guó)產(chǎn)雪茄的產(chǎn)量與銷售迅速增加，銷售年均增長(zhǎng)率達(dá)到39.13%，但國(guó)產(chǎn)雪茄受風(fēng)格特征與原料的限制難以更好地突破高端雪茄市場(chǎng)[1-2]。長(zhǎng)期以來(lái)，雪茄生產(chǎn)原料依賴于進(jìn)口，存在成本昂貴、原料質(zhì)量不夠穩(wěn)定、發(fā)酵時(shí)間較長(zhǎng)、品質(zhì)風(fēng)格受限等不利因素；而國(guó)產(chǎn)雪茄煙葉原料受工藝條件不夠成熟、地理環(huán)境差異、氣候性因素的限制，在品質(zhì)上未能達(dá)到國(guó)外進(jìn)口煙葉的水平[3]。雪茄生產(chǎn)對(duì)于煙葉原料的要求極高，不同部位煙葉制成雪茄后致香成分有著比較明顯的差別，下部煙葉的煙堿含量、總氮含量、多酚含量等低于中部煙葉，使得下部煙葉在發(fā)酵后致香成分含量較低，制得雪茄香氣較淡、吃味寡淡，在雪茄煙葉等級(jí)評(píng)定與煙葉發(fā)酵生產(chǎn)中劣于中上部煙葉[3-6]。

堆積發(fā)酵是雪茄煙葉香氣物質(zhì)產(chǎn)生和品質(zhì)提升的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，國(guó)產(chǎn)雪茄生產(chǎn)仍處于起步的初級(jí)階段，堆積過(guò)程中的發(fā)酵機(jī)制以及衡量雪茄發(fā)酵質(zhì)量的指標(biāo)仍尚待挖掘。已有大量研究對(duì)煙葉種植方式與煙葉產(chǎn)量質(zhì)量進(jìn)行了分析，對(duì)不同發(fā)酵階段的研究主要是不同生理生化指標(biāo)與煙葉香韻、致香物質(zhì)的分析，而對(duì)于雪茄發(fā)酵的相關(guān)研究，尤其是對(duì)發(fā)酵機(jī)制的研究仍較為有限[5，7-9]。

為了提升國(guó)產(chǎn)雪茄在國(guó)際市場(chǎng)中的競(jìng)爭(zhēng)力，還需進(jìn)一步提高國(guó)產(chǎn)煙葉工業(yè)可用性，形成一套完善的雪茄發(fā)酵工藝[2]。因此，研究國(guó)產(chǎn)雪茄煙葉堆積發(fā)酵過(guò)程中微生物的變化規(guī)律與不同產(chǎn)區(qū)、不同部位煙葉微生物的差異，對(duì)于強(qiáng)化國(guó)產(chǎn)雪茄煙葉發(fā)酵技術(shù)、增強(qiáng)下部雪茄煙葉香氣、提升雪茄發(fā)酵品質(zhì)具有重要意義。鑒于此，采用高通量測(cè)序技術(shù)分析湖北十堰與四川德陽(yáng)2 個(gè)產(chǎn)區(qū)中、下部的雪茄煙葉原料在堆積發(fā)酵過(guò)程中不同發(fā)酵節(jié)點(diǎn)優(yōu)勢(shì)微生物的變化，解析堆積發(fā)酵中優(yōu)勢(shì)微生物的變化規(guī)律及十堰與德陽(yáng)煙葉特有微生物的差異，為生產(chǎn)高質(zhì)量國(guó)產(chǎn)雪茄、形成國(guó)產(chǎn)雪茄特征風(fēng)格提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

以湖北十堰產(chǎn)區(qū)的CX14 品種的中、下部煙葉及四川德陽(yáng)產(chǎn)區(qū)的DX4 品種的中、下部煙葉作為試驗(yàn)的研究對(duì)象，樣品編號(hào)：A 為十堰產(chǎn)區(qū)品種CX14的中部一級(jí)煙葉、B為十堰產(chǎn)區(qū)品種CX14的下部一級(jí)煙葉、C 為德陽(yáng)產(chǎn)區(qū)品種DX4 的中部一級(jí)煙葉、D為德陽(yáng)產(chǎn)區(qū)品種DX4的下部一級(jí)煙葉。對(duì)煙葉原料進(jìn)行堆積發(fā)酵，湖北中煙工業(yè)有限責(zé)任公司堆垛發(fā)酵室的溫度為21～25 ℃，濕度控制在60%～70%，從發(fā)酵0 d 的原煙開(kāi)始取樣，煙葉每發(fā)酵7～10 d 進(jìn)行一次翻垛，每次翻垛都進(jìn)行一次取樣至發(fā)酵結(jié)束，共有5 個(gè)節(jié)點(diǎn)，分別為煙葉的原煙時(shí)期（T0，0 d）、發(fā)酵前期（T1，7 d）、發(fā)酵中期（T2，14 d）、發(fā)酵后期（T3，21 d）、發(fā)酵結(jié)束（T4，30 d）。采集好的樣品用自封袋密封，保存于-20 ℃冰箱中。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品處理 取5 g 煙葉在預(yù)冷的研缽中用液氮研磨成粉末，將煙葉粉末與100 mL 無(wú)菌的0.9%生理鹽水加入500 mL 帶擋板的三角搖瓶中，在10 ℃、220 r/min 振蕩培養(yǎng)箱（ZQZY-AFS，知楚）中，振蕩2～3 h 洗脫煙葉總微生物；使用臺(tái)式高速大容量離心機(jī)（5810R，Eppendorf）在4 ℃、7 000 r/min 離心10 min，收集沉淀即為煙葉的總微生物；使用OMEGA Soil DNA Kit（D5625-01，Omega Biotek 公司）提取煙葉總微生物DNA。

1.2.2 擴(kuò)增子測(cè)序 以細(xì)菌和真菌DNA 為模板，分別以細(xì)菌通用引物515F（GTGCCAGCMGCCGCGGTAA）/907R（CCGTCAATTCMTTTRAGTTT）和真菌通用 引 物ITS1（GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG）/ITS2（GCTGCGTTCTTCATCGATGC）對(duì)細(xì)菌的V4—V5 區(qū)和真菌ITS1—ITS2 區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，采用0.8%瓊脂凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，并利用Illumina Hiseq對(duì)群落DNA 進(jìn)行雙端測(cè)序。原始序列經(jīng)過(guò)去引物、質(zhì)量過(guò)濾、去噪、拼接和去嵌合體等步驟，得到煙葉樣品的物種組成和豐度信息[10]。

1.2.2 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 應(yīng)用QIIME 2、Excel 2021和Origin 2022 軟件對(duì)獲得的煙葉微生物數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和繪圖，通過(guò)計(jì)算α 多樣性指數(shù)和組間差異分析對(duì)不同產(chǎn)區(qū)、部位煙葉樣品微生物多樣性進(jìn)行分析。使用QIIME 2 計(jì)算煙葉菌群的α 多樣性指數(shù)（以Chao1 指數(shù)表征群落豐富度，以Simpson 指數(shù)表征群落多樣性），應(yīng)用R 語(yǔ)言的vegan 包進(jìn)行基于置換檢驗(yàn)的多元方差分析（Permutational multivariate analysis of variance，PERMANOVA）測(cè)試堆積發(fā)酵過(guò)程中每個(gè)發(fā)酵節(jié)點(diǎn)之間的差異[11]。以煙葉樣品中相對(duì)豐度在前20的微生物作為分析對(duì)象，使用R語(yǔ)言的Venn Diagram 包統(tǒng)計(jì)共有微生物和特有微生物并繪制Venn 圖；使用LEfSe 分析（LDA effect size 分析）展示每個(gè)煙葉樣品內(nèi)顯著富集的物種[12]。使用Origin 2022 和Excel 2021 對(duì)煙葉樣品中任意節(jié)點(diǎn)任意樣品中相對(duì)豐度超過(guò)2%的微生物的相對(duì)豐度進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同產(chǎn)區(qū)、部位煙葉微生物多樣性分析

2.1.1 不同產(chǎn)區(qū)、部位煙葉細(xì)菌多樣性分析 在整個(gè)堆積發(fā)酵過(guò)程中，不同產(chǎn)區(qū)、部位煙葉細(xì)菌群落α多樣性分析結(jié)果如圖1 所示。十堰中部煙葉Chao 1指數(shù)在發(fā)酵過(guò)程中先升高后降低，最后基本趨于平穩(wěn)；Simpson 指數(shù)呈現(xiàn)稍有降低后逐漸升高的趨勢(shì)。十堰下部煙葉Chao 1 指數(shù)先升高后降低，最后基本趨于平穩(wěn)；Simpson 指數(shù)在發(fā)酵過(guò)程中先降低后升高再降低，最后稍有升高。德陽(yáng)中部煙葉Chao 1 指數(shù)呈先升高后降低再升高的趨勢(shì)，Simpson 指數(shù)在發(fā)酵過(guò)程中呈先降低后升高再升高的趨勢(shì)，在發(fā)酵結(jié)束時(shí)升高。德陽(yáng)下部煙葉Chao 1 指數(shù)在發(fā)酵過(guò)程中逐漸降低，Simpson 指數(shù)在發(fā)酵前期上升后逐漸降低。

圖1 不同產(chǎn)區(qū)、部位煙葉細(xì)菌菌群α多樣性分析Fig.1 Bacterial alpha diversity of tobacco leaves in different origins and leaf parts

對(duì)不同產(chǎn)區(qū)、部位煙葉在整個(gè)堆積發(fā)酵過(guò)程中細(xì)菌群落進(jìn)行組間差異分析，如圖2所示，十堰產(chǎn)區(qū)煙葉細(xì)菌群落在原煙時(shí)期與發(fā)酵前期組間差異較小，發(fā)酵中期時(shí)細(xì)菌菌群具有顯著變化；德陽(yáng)產(chǎn)區(qū)煙葉細(xì)菌菌群在發(fā)酵前期具有顯著變化，發(fā)酵中期至發(fā)酵結(jié)束的菌群組間差異較小。以上結(jié)果表明，同一產(chǎn)區(qū)中、下部煙葉在堆積發(fā)酵過(guò)程中細(xì)菌菌群發(fā)生顯著變化的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)相似，推測(cè)發(fā)酵前期或發(fā)酵中期可能是堆積發(fā)酵過(guò)程中細(xì)菌微生物群落組成與豐度顯著變化的節(jié)點(diǎn)，且不同產(chǎn)區(qū)煙葉細(xì)菌微生物群落變化的節(jié)點(diǎn)具有較大差異。

圖2 不同產(chǎn)區(qū)、部位煙葉細(xì)菌群落組間差異分析Fig.2 Bacterial difference analysis between groups of tobacco leaves in different origins and leaf parts

2.1.2 不同產(chǎn)區(qū)、部位煙葉真菌多樣性分析 在整個(gè)堆積發(fā)酵過(guò)程中，不同產(chǎn)區(qū)、部位煙葉真菌群落α多樣性變化如圖3 所示。十堰中部煙葉真菌Chao 1指數(shù)在發(fā)酵過(guò)程中呈先上升后下降的趨勢(shì)，Simpson指數(shù)在發(fā)酵過(guò)程中先上升后下降，最后再次上升。十堰下部煙葉真菌Chao 1 指數(shù)在發(fā)酵過(guò)程中整體呈先上升后下降的趨勢(shì)，Simpson 指數(shù)在整個(gè)堆積發(fā)酵過(guò)程中逐漸下降。德陽(yáng)中部煙葉Chao 1 指數(shù)和Simpson 指數(shù)在發(fā)酵過(guò)程中呈增加-降低-增加-降低的趨勢(shì)，德陽(yáng)下部煙葉真菌Chao 1 指數(shù)和Simpson 指數(shù)在發(fā)酵過(guò)程中呈先增加后降低的趨勢(shì)，最后略有增加。

圖3 不同產(chǎn)區(qū)、部位煙葉真菌群落α多樣性分析Fig.3 Fungal alpha diversity of tobacco leaves in different origins and leaf parts

圖4 為不同產(chǎn)區(qū)、部位煙葉真菌群落的組間差異分析。從圖4 可以看出，只有德陽(yáng)中部煙葉真菌菌群在發(fā)酵中期具有顯著變化，而其余煙葉真菌群落在整個(gè)堆積發(fā)酵過(guò)程中均具有較大變化，說(shuō)明煙葉真菌在堆積發(fā)酵過(guò)程中不同發(fā)酵節(jié)點(diǎn)變化較大。

圖4 不同產(chǎn)區(qū)、部位煙葉真菌群落組間差異分析Fig.4 Fungal difference analysis between groups of tobacco leaves in different origins and leaf parts

2.2 不同產(chǎn)區(qū)、部位煙葉物種組成分析

2.2.1 不同產(chǎn)區(qū)、部位煙葉細(xì)菌物種組成 圖5a為不同產(chǎn)區(qū)、部位煙葉在堆積發(fā)酵過(guò)程中相對(duì)豐度在前20 的細(xì)菌Venn 圖，煙葉樣品之間既有共性也有差異，在不同產(chǎn)區(qū)、部位煙葉中共有的細(xì)菌屬共有9個(gè)，分別是氣球菌屬（Aerococcus）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、棒狀桿菌屬（Corynebacterium_1）、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）、綠細(xì)菌屬（Chloroplast）、鞘氨醇桿菌屬（Sphingobium）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、假 單 胞 菌 屬（Pseudomonas）、Mitochondria，這些共有物種可能參與了堆積發(fā)酵中的有害物質(zhì)降解和香氣成分轉(zhuǎn)化[5-6]。

圖5 不同產(chǎn)區(qū)、部位煙葉共有微生物物種Fig.5 Shared microbial species of tobacco leaves in different origins and leaf parts

2.2.2 不同產(chǎn)區(qū)、部位煙葉真菌物種組成 圖5b為不同產(chǎn)區(qū)、部位煙葉在堆積發(fā)酵過(guò)程中相對(duì)豐度在前20 的真菌Venn 圖，煙葉樣品之間既有共性也有差異，在不同產(chǎn)區(qū)、部位煙葉中共有的真菌屬共有6個(gè)，分 別 是 曲 霉 屬（Aspergillus）、鏈 格 孢 菌 屬（Alternaria）、微 子 囊 菌 屬（Microascus）、Sampaiozyma、青 霉 屬（Penicillium）、枝 頂 孢 屬（Acremonium）、鐮孢屬（Fusarium）。

2.2.3 不同產(chǎn)區(qū)、部位煙葉特征微生物 應(yīng)用LEfSe 分析不同產(chǎn)區(qū)、部位煙葉的特征微生物，結(jié)果如圖6 所示。從圖6 可以看出，十堰產(chǎn)區(qū)煙葉的特征細(xì)菌屬有費(fèi)克藍(lán)姆氏菌屬（Facklamia）、水桿菌屬（Aquabacterium）；德陽(yáng)產(chǎn)區(qū)的特征細(xì)菌屬有鹽單胞菌屬（Halomonas）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、砷氧化菌（Aliihoeflea）和涅斯捷連科氏菌屬（Nesterenkonia）。其余各煙葉樣品還有特征細(xì)菌屬，十堰中部煙葉的乳桿菌屬（Lactobacillus）、彎桿菌屬（Flectobacillus），十堰下部煙葉的海洋芽孢桿菌屬（Oceanobacillus）；德陽(yáng)中部煙葉的酸桿菌屬（Acidibacter）、孢囊菌屬（Dactylosporangium）和WD2101_soil_group 及德陽(yáng)下部煙葉的泛菌屬（Pantoea）等。

圖6 不同產(chǎn)區(qū)、部位煙葉微生物L(fēng)EfSe分析Fig.6 Microbial LEfSe analysis of tobacco leaves in different origins and leaf parts

十堰產(chǎn)區(qū)的特征真菌屬為刺盤(pán)孢菌屬（Colletotrichum）和單端孢屬（Trichothecium），德陽(yáng)產(chǎn)區(qū)煙葉特有的真菌屬為輪枝孢屬（Verticillium）和枝孢菌屬（Cladosporium）。其余各煙葉樣品還有特征真菌屬，十堰中部煙葉的赤霉菌屬（Gibberella）、間座殼屬（Diaporthe），十堰下部煙葉的籃狀菌屬（Talaromyces），德陽(yáng)中部煙葉的柄孢殼屬（Podospora）及德陽(yáng)下部煙葉的紅酵母屬（Rhodotorula）等。

2.2.4 堆積發(fā)酵過(guò)程中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌物種組成與變化

選取在整個(gè)堆積發(fā)酵過(guò)程中相對(duì)豐度在前20，且在任意發(fā)酵節(jié)點(diǎn)相對(duì)豐度超過(guò)2%的細(xì)菌屬進(jìn)行優(yōu)勢(shì)細(xì)菌物種組成分析，結(jié)果如圖7a所示。葡萄球菌屬、氣球菌屬和棒狀桿菌屬是各產(chǎn)區(qū)共有的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌，不同產(chǎn)區(qū)煙葉優(yōu)勢(shì)細(xì)菌在發(fā)酵過(guò)程中具有較大差異。

圖7 堆積發(fā)酵過(guò)程中不同產(chǎn)區(qū)、部位煙葉優(yōu)勢(shì)微生物物種變化Fig.7 Changes of tobacco leaf dominant microobial species in different origins and leaf parts during stacking fermentation

葡萄球菌屬是不同產(chǎn)區(qū)煙葉原煙時(shí)期、發(fā)酵前期的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，不同產(chǎn)區(qū)、部位的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌組成和豐度變化存在差異。十堰產(chǎn)區(qū)煙葉優(yōu)勢(shì)細(xì)菌在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中變化規(guī)律類似，發(fā)酵前期以葡萄球菌屬為優(yōu)勢(shì)細(xì)菌，隨著發(fā)酵過(guò)程進(jìn)行，葡萄球菌屬相對(duì)豐度逐漸下降，優(yōu)勢(shì)細(xì)菌轉(zhuǎn)變?yōu)闅馇蚓鷮俸桶魻顥U菌屬。德陽(yáng)產(chǎn)區(qū)發(fā)酵前期的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌是葡萄球菌屬，氣球菌屬和棒狀桿菌屬在發(fā)酵前期和發(fā)酵中期相對(duì)豐度增加，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，德陽(yáng)中部煙葉的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌轉(zhuǎn)變?yōu)辂}單胞菌屬，而德陽(yáng)下部煙葉中葡萄球菌屬始終占優(yōu)勢(shì)地位。酸桿菌屬、孢囊菌屬和WD2101_soil_group 是德陽(yáng)中部煙葉的特有微生物，在發(fā)酵結(jié)束時(shí)相對(duì)豐度迅速增加。

2.2.5 堆積發(fā)酵過(guò)程中優(yōu)勢(shì)真菌物種組成與變化

選取在整個(gè)堆積發(fā)酵過(guò)程中任一發(fā)酵節(jié)點(diǎn)相對(duì)豐度超過(guò)2%的真菌屬進(jìn)行優(yōu)勢(shì)真菌物種組成分析，結(jié)果如圖7b所示。十堰產(chǎn)區(qū)中部煙葉的優(yōu)勢(shì)真菌是曲霉屬，在發(fā)酵后期，鏈格孢屬、微子囊菌屬相對(duì)豐度增加，轉(zhuǎn)變?yōu)閮?yōu)勢(shì)真菌。在十堰產(chǎn)區(qū)下部煙葉的發(fā)酵前期，曲霉屬相對(duì)豐度迅速減少，籃狀菌屬是十堰下部煙葉中特有的微生物且在發(fā)酵前期和發(fā)酵結(jié)束保持優(yōu)勢(shì)地位，在發(fā)酵前期至發(fā)酵后期鏈格孢菌屬相對(duì)豐度增加成為優(yōu)勢(shì)真菌。德陽(yáng)產(chǎn)區(qū)中、下部煙葉在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中以曲霉屬為優(yōu)勢(shì)真菌，德陽(yáng)產(chǎn)區(qū)中部煙葉在發(fā)酵前期與發(fā)酵中期節(jié)擔(dān)菌屬和微子囊菌屬相對(duì)豐度增加，參與組成了煙葉的優(yōu)勢(shì)菌。

關(guān)聯(lián)分析4個(gè)煙葉樣品可知，曲霉屬、鏈格孢屬和微子囊菌屬是各產(chǎn)區(qū)共有的優(yōu)勢(shì)真菌，不同產(chǎn)區(qū)煙葉優(yōu)勢(shì)真菌組成與豐度變化在發(fā)酵過(guò)程中具有較大差異。曲霉菌屬是各煙葉樣品原煙時(shí)期和發(fā)酵前期的優(yōu)勢(shì)真菌，鏈格孢菌屬、微子囊菌屬在發(fā)酵中期、發(fā)酵后期相對(duì)豐度增加，組成煙葉的優(yōu)勢(shì)真菌。

3 結(jié)論與討論

本研究中，德陽(yáng)中部煙葉的微生物群落豐富度在堆積發(fā)酵過(guò)程中呈上升趨勢(shì)，其余煙葉樣品微生物群落豐富度隨著發(fā)酵的進(jìn)行呈下降趨勢(shì)，德陽(yáng)產(chǎn)區(qū)中部煙葉在發(fā)酵后期群落豐富度增加，可能是德陽(yáng)產(chǎn)區(qū)的特有微生物對(duì)群落結(jié)構(gòu)變化的影響。中部煙葉微生物群落多樣性在發(fā)酵過(guò)程中基本呈上升趨勢(shì)，下部煙葉群落多樣性隨著發(fā)酵的進(jìn)行基本呈下降趨勢(shì)。堆積發(fā)酵過(guò)程中，中部、下部煙葉微生物群落多樣性變化的差異可能是因?yàn)橹胁繜熑~稍厚油分較多，總糖含量、煙堿、總氮含量與下部煙葉相比較高，在堆積發(fā)酵時(shí)利于微生物繁殖，下部煙葉群落多樣性在發(fā)酵后期至發(fā)酵結(jié)束減少，可能是導(dǎo)致下部煙葉生產(chǎn)的雪茄香氣、吃味上不如中部煙葉的原因[5，13-14]。前人以海南中部煙葉為研究對(duì)象，其細(xì)菌群落多樣性隨著發(fā)酵的進(jìn)行呈先增加后降低的趨勢(shì)[15-16]，與本研究結(jié)果相似。

本研究中，十堰產(chǎn)區(qū)中部、下部煙葉細(xì)菌優(yōu)勢(shì)微生物與德陽(yáng)產(chǎn)區(qū)中部、下部煙葉細(xì)菌優(yōu)勢(shì)微生物在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中變化規(guī)律相似，但中部煙葉與下部煙葉總糖、氨基酸、香氣物質(zhì)含量等存在較大差異，造成中、下部煙葉品質(zhì)差異可能是因?yàn)橄虏繜熑~結(jié)構(gòu)疏散、含水量較高，長(zhǎng)時(shí)間的高溫高濕發(fā)酵環(huán)境在發(fā)酵過(guò)程中會(huì)促使糖分和多酚類物質(zhì)快速轉(zhuǎn)化過(guò)多，加速煙葉褐變和霉變的風(fēng)險(xiǎn)，影響煙葉品質(zhì)[17]。

煙葉微生物和環(huán)境變化協(xié)同作用下，雪茄煙葉發(fā)酵過(guò)程中大分子物質(zhì)降解、小分子物質(zhì)轉(zhuǎn)化、香氣物質(zhì)生成，推動(dòng)雪茄特殊品質(zhì)的形成[18-19]。本研究中，同一部位不同產(chǎn)區(qū)的煙葉在優(yōu)勢(shì)微生物的結(jié)構(gòu)上存在較大差異，在不同發(fā)酵節(jié)點(diǎn)起到主要作用的微生物也不完全相同，這與產(chǎn)區(qū)特有微生物和環(huán)境因素、微生物之間的互作關(guān)系相關(guān)[20]。在發(fā)酵前期，中等酸性和中溫環(huán)境適宜葡萄球菌屬、氣球菌屬等菌株的生長(zhǎng)。意大利托斯卡諾雪茄煙葉在發(fā)酵過(guò)程中，葡萄球菌屬與棒狀桿菌屬的變化與十堰產(chǎn)區(qū)煙葉相似，可能是由于葡萄球菌屬、氣球菌屬對(duì)煙葉還原糖、蘋(píng)果酸和檸檬酸的利用，導(dǎo)致溫度和pH 值升高，從而促進(jìn)耐鹽、抗逆性強(qiáng)的棒狀桿菌屬的生長(zhǎng)[21]，與本研究中發(fā)酵結(jié)束時(shí)棒狀桿菌屬相對(duì)豐度增加相符合。德陽(yáng)產(chǎn)區(qū)下部煙葉葡萄球菌屬豐度變化與前人[22-24]研究結(jié)果相似，在菌群發(fā)生顯著變化的發(fā)酵前期與發(fā)酵中期，氨基酸運(yùn)輸和代謝及碳水化合物運(yùn)輸和代謝功能豐度更高。通過(guò)比較菌群優(yōu)勢(shì)菌組成與豐度的相似之處，可為更好地挖掘優(yōu)勢(shì)微生物的發(fā)酵作用及國(guó)產(chǎn)雪茄特征風(fēng)格的確定提供指導(dǎo)。

本研究中，葡萄球菌屬、氣球菌屬、棒狀桿菌屬、鹽單胞菌屬等屬于煙葉的主要優(yōu)勢(shì)細(xì)菌，據(jù)報(bào)道可能在堆積發(fā)酵過(guò)程中具有增加香氣成分、降解有害成分等作用[21，25]。關(guān)于葡萄球菌屬在煙葉中應(yīng)用的報(bào)道較少，已有研究報(bào)道在發(fā)酵香腸中接種葡萄球菌菌劑利用蛋白質(zhì)和脂肪產(chǎn)生酸和醇類物質(zhì)，酯化反應(yīng)后醛類、酯類物質(zhì)含量增加，使得食品的清新味、甜香味、果香味和花香味更加濃郁[25-26]。隨著煙葉發(fā)酵的進(jìn)行，溫度和pH 升高，棒狀桿菌的耐鹽性使其能夠生長(zhǎng)較好[21]。有研究報(bào)道，氣球菌屬、鹽單胞菌屬是腌制麻竹筍的優(yōu)勢(shì)微生物，具有耐鹽、抗逆性較強(qiáng)的特點(diǎn)，且在雪茄煙葉研究中也能檢測(cè)到[21，27]；通過(guò)Pearson 相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，鹽單胞菌屬、涅斯捷連科氏菌屬與3-甲基丁醛、2-庚酮、己醛、辛醛及己酸乙酯等具有水果香、花香的物質(zhì)呈正相關(guān)[28]。雪茄堆積發(fā)酵過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)真菌如曲霉屬、籃狀菌屬在發(fā)酵過(guò)程中也具有改善煙葉品質(zhì)、提升香氣的功能。全銘沁等[29]將1株能夠分泌淀粉酶和蛋白酶的黑曲霉應(yīng)用于上部煙葉中，發(fā)酵后的煙葉勁頭下降、雜氣量減少，香氣得到了提升。另外，在分離根際微生物時(shí)分離到1株籃狀菌，應(yīng)用該菌能夠抑制有害菌的繁殖，使有益微生物的相對(duì)豐度上升[30]。除優(yōu)勢(shì)微生物外，煙葉特有微生物如芽孢桿菌屬、砷氧化菌屬、乳桿菌屬、海洋芽孢桿菌屬、刺盤(pán)孢菌屬、單端孢屬、枝孢菌屬、赤霉菌屬、間座殼屬、紅酵母屬等在本研究煙葉樣品中相對(duì)豐度較低，但在其他研究中均有報(bào)道是煙葉的優(yōu)勢(shì)微生物，且在分泌淀粉酶、蛋白酶等關(guān)鍵酶降解大分子物質(zhì)、生成特征香氣成分中具有重要作用[16，22]。本研究中，葡萄球菌屬、氣球菌屬、棒狀桿菌屬、鹽單胞菌屬等優(yōu)勢(shì)微生物可能通過(guò)產(chǎn)酶、影響菌群結(jié)構(gòu)等對(duì)雪茄煙葉香氣提升和國(guó)產(chǎn)雪茄生產(chǎn)具有至關(guān)重要的作用，其代謝活動(dòng)和發(fā)酵機(jī)制還需進(jìn)一步的研究，并通過(guò)菌劑制備與人工構(gòu)建微生物群落應(yīng)用于下部煙葉的發(fā)酵生產(chǎn)。