同種屬來源抗體免疫組化雙重染色的應用體會

韓 雪，宋國新，王 敏，陳 剛，季 盼，張煒明

免疫組化雙重染色是指在同一張切片上同時顯示兩種不同的抗原，大多采用異種屬抗體間接標記法，即兩種標記的一抗分別來源于不同種屬。臨床實踐中使用的一抗種屬單克隆鼠來源較多，滿足免疫組化雙染可配伍組合抗體少，限制了免疫組化雙染技術的應用。本科室通過實驗摸索，對免疫組化雙染方法進行改良，使得相同種屬來源的抗體也可進行免疫組化雙染。本文以肺腺癌組織Ki-67+CK7免疫組化雙染為例，介紹如下。

1 材料與方法

1.1 材料收集南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院病理學部經10%中性福爾馬林固定的肺腺癌組織60例，每例組織連續(xù)切片3張，切片厚度3 μm，防脫載玻片撈片，分別用于CK7、Ki-67免疫組化單染和Ki-67+CK7免疫組化雙染。

1.2 試劑Ki-67(鼠單抗，MX006)、CK7(鼠單抗，OV-TL12/30)、HRP標記羊抗小鼠IgG聚合物與DAB顯色試劑盒購自福州邁新公司；內源性過氧化物酶阻斷劑、SAP試劑盒(生物素標記山羊抗小鼠IgG工作液、堿性磷酸酶標記鏈霉卵白素工作液)、快紅顯色劑購自北京中杉金橋公司；2 mol/L H2SO4溶液為實驗室自配。

1.3 方法第1組切片行CK7免疫組化單染，DAB顯色；第2組切片行Ki-67免疫組化單染，DAB顯色；第3組切片行Ki-67+CK7免疫組化雙染。免疫組化雙染步驟如下：(1)常規(guī)組織切片脫蠟水化；(2)檸檬酸抗原修復液(pH 6.0)高溫高壓熱修復12 min，自然冷卻；PBST(pH 7.2)浸泡3 min×3次；(3)滴加內源性過氧化物酶阻斷劑，室溫孵育10 min，PBST(pH 7.2)浸泡3 min×3次；(4)滴加一抗Ki-67(鼠單抗)，4 ℃孵育過夜或37 ℃孵育1 h，PBST(pH 7.2)浸泡3 min×3次；(5)滴加HRP標記羊抗小鼠IgG聚合物，室溫孵育20 min，PBST(pH 7.2)浸泡3 min×3次；(6)滴加DAB顯色液，鏡下控制顯色3 min，PBST(pH 7.2)浸泡3 min×3次；(7)滴加2 mol/L H2SO4溶液，室溫2 min，流水沖洗5 min，PBST(pH 7.2)浸泡3 min×3次；(8)滴加一抗CK7(鼠單抗)，4 ℃孵育過夜或37 ℃孵育1 h，PBST(pH 7.2)浸泡3 min×3次；(9)滴加生物素標記山羊抗小鼠IgG工作液，37 ℃孵育15 min，PBST(pH 7.2)浸泡3 min×3次；(10)滴加堿性磷酸酶標記鏈霉卵白素工作液，37 ℃孵育15 min，PBST(pH 7.2)浸泡3 min×3次；(11)滴加快紅顯色液，室溫孵育10～15 min，鏡下控制顯色，自來水充分洗滌；(12)蘇木精復染，水溶性封片膠封固，鏡下觀察。

1.4 結果判讀由兩名高年資病理醫(yī)師對所有染色切片進行雙盲判讀：CK7表達于正常腺上皮及肺腺癌上皮細胞，陽性定位于細胞質；Ki-67主要表達于增殖期細胞，陽性定位于細胞核。免疫組化單染時CK7、Ki-67呈棕色，免疫組化雙染時CK7呈玫紅色、Ki-67呈棕色。

2 結果

第1組切片中CK7陽性細胞胞質呈棕色，染色背景干凈，細胞定位清晰(圖1)；第2組切片中Ki-67在腫瘤細胞及周圍炎癥細胞均有表達，陽性細胞胞核呈棕色，細胞定位清晰(圖2)；第3組切片中CK7陽性細胞胞質呈鮮艷玫紅色，Ki-67陽性細胞胞核呈棕色，Ki-67+CK7陽性共染腫瘤細胞鏡下清晰可見，同時可見腫瘤細胞周圍圍繞較多核陽性的非腫瘤細胞(圖3、4)。與免疫組化單染相比，免疫組化雙染組CK7、Ki-67表達定位及染色強度無差別，通過計數共染腫瘤細胞占比，使得腫瘤細胞增殖指數的判讀結果更準確可靠。

①②③④

3 討論

應用組織切片進行免疫組化雙染，可以克服同一病例切片間因不同時間或空間差異而引起的樣本誤差，提高診斷信息量，與免疫組化單染相比，免疫組化雙染在觀察組織中兩種標記抗體的相互定位關系時具有無可比擬的優(yōu)越性。

Ki-67是評估腫瘤細胞增殖活性指標，因腫瘤組織內細胞種類復雜，Ki-67實際計數時易受各類非腫瘤的陽性背景細胞干擾，導致不同觀察者間或同一觀察者不同觀察時間點的計數結果有一定差異，影響腫瘤預后的精準分析。本文應用的Ki-67+CK7免疫組化雙染，可在同一張組織切片上清晰標記出Ki-67染色陽性的腫瘤細胞，方便觀察者對增殖的腫瘤細胞精準計數，可提高Ki-67判讀結果的一致性。

常規(guī)免疫組化雙染關鍵環(huán)節(jié)在于：(1)合理的染色抗體配伍組合，確保所選標記抗體定位于不同細胞或同一細胞的不同部位，并用不同顏色的顯色試劑區(qū)分[1-2]，常規(guī)應用的辣根過氧化物酶(HRP)和堿性磷酸酶(AP)分別與底物作用后可獲得較好的棕色與玫紅色著色對比；(2)避免兩種標記抗體之間的交叉反應，一般市售雙染試劑盒中的兩種抗體分別來自不同種屬，即一個兔來源和一個鼠來源的抗體，但實際工作中常用的一抗大都來自同一種屬，即鼠來源，可供配伍雙染的抗體組合少，限制了免疫組化雙染技術的應用。

本文中Ki-67和CK7都是鼠來源抗體，本實驗對常規(guī)免疫組化雙染方法作如下改良，使之可適用于兩種同一種屬來源抗體的免疫組化雙染：(1)應用2 mol/L H2SO4滅活第1次染色后殘留酶及一抗的活性，充分洗滌后，可避免與第2個一抗間相互干擾，同時低濃度酸短時處理切片后并不會影響后續(xù)免疫組化染色，也不會影響第1次染色過程中的DAB著色[3]；(2)兩步法與三步法相結合，兩步法標記第一個抗體顯色，再用三步法標記第二個抗體，即第二個一抗孵育后，先與生物素標記山羊抗小鼠IgG結合，再用堿性磷酸酶標記鏈霉卵白素示蹤后快紅顯色，較之堿性磷酸酶直接標記的羊抗小鼠IgG聚合物二抗，大大提高了檢測的敏感性。

隨著克隆抗體制備與標記技術的發(fā)展，免疫組化雙染技術日趨成熟。為保證免疫組化雙染效果，需加強從標本送檢到組織處理各個環(huán)節(jié)的質量控制。首先，組織的處理質量可直接影響染色效果，擬行免疫組化雙染前應由診斷醫(yī)師結合組織形態(tài)學，充分評估組織處理情況后合理選擇配伍抗體[4-7]。其次，所選擇的配伍抗體應是特異性、敏感性高的抗體，即所選擇的抗體在單染時有較好的標記效果。最后，免疫組化雙染步驟較多，操作者需要更加耐心和細心，嚴格按操作流程進行，才能獲得優(yōu)良的免疫組化雙染切片。