原發(fā)性肺淋巴上皮癌41例臨床病理及分子遺傳學(xué)分析

馬善寶，鄭巧靈，延永琴，齊興峰，劉慶宏，曲利娟

肺淋巴上皮癌(lymphoepithelioma carcinoma, LEC)是一種具有大量淋巴間質(zhì)、分化差的非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)，為臨床少見的、與EBV感染密切相關(guān)的惡性上皮性腫瘤，可發(fā)生于全身任何器官，僅占所有肺癌的0.92%。由于肺LEC的低發(fā)病率、發(fā)病機(jī)制及驅(qū)動(dòng)基因突變不明確，目前臨床治療經(jīng)驗(yàn)有限。隨著免疫療法的興起，程序性細(xì)胞死亡1(programmed death-1, PD-1)/程序性細(xì)胞死亡配體1(programmed cell death ligand 1, PD-L1)抑制劑已成為NSCLC的重要治療方法[1]，但PD-1/PD-L1在肺LEC中的表達(dá)及相關(guān)治療療效數(shù)據(jù)有限，仍有待進(jìn)一步探究。本文回顧性分析41肺LEC臨床病理特征及PD-1/PD-L1在肺LEC中的表達(dá)情況，為臨床開展新的免疫治療方案提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2017年1月～2021年12月解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九〇〇醫(yī)院病理科存檔的肺LEC手術(shù)切除標(biāo)本41例，所有患者均接受鼻咽內(nèi)鏡檢查以排除鼻咽部轉(zhuǎn)移性LEC，臨床病理資料完整。其中發(fā)病年齡27～77歲，中位年齡54歲，男女比為1.2 ∶1，其中吸煙者4例。按照第8版肺癌腫瘤TNM分期系統(tǒng)進(jìn)行分期。隨訪資料通過電話形式獲取信息，隨訪時(shí)間6～54個(gè)月，其中3例出現(xiàn)胸腔、肝和骨等部位遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。

1.2 方法標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片，行HE及免疫組化染色，鏡下觀察。PD-1抗體(稀釋比1 ∶50)購(gòu)自SIGMA公司，PD-L1(克隆號(hào)SP263)檢測(cè)采用羅氏OptiView法，每次實(shí)驗(yàn)均設(shè)置陽(yáng)性和陰性對(duì)照，其余免疫組化檢測(cè)試劑盒購(gòu)于福州邁新公司，免疫組化染色采用EnVision兩步法，所用抗體包括CK5/6、p40、p63、CK7、TTF-1、Napsin A、Syn、CgA、CD56。EBER原位雜交染色試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋公司，采用辣根過氧化物酶系統(tǒng)，DAB顯色。另切取相應(yīng)石蠟包埋組織4 μm厚切片5～10張，利用石蠟組織DNA/RNA共提取試劑盒提取DNA及RNA，采用擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)(ARMS)PCR檢測(cè)RET、ROS1、EGFR、HER-2、PIK3CA、BRAF、KRAS和ALK基因突變情況，PCR具體操作及結(jié)果判讀均按試劑盒說明書進(jìn)行，試劑盒購(gòu)自廈門艾德生物醫(yī)藥公司。

1.3 結(jié)果判斷CK5/6、CK7、Napsin A、Syn、CgA表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)，CD56表達(dá)定位于細(xì)胞膜，p40、p63、TTF-1表達(dá)定位于細(xì)胞核。PD-L1陽(yáng)性判斷[2-3]：以任何強(qiáng)度的細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜染色腫瘤細(xì)胞占所有腫瘤細(xì)胞的百分比計(jì)算：0～1%為陰性，≥1%為陽(yáng)性，其中1%～49%為低表達(dá)，≥50%為高表達(dá)。PD-1陽(yáng)性判斷[4-5]：以細(xì)胞計(jì)數(shù)法評(píng)估：低倍鏡下觀察整張切片，尋找淋巴細(xì)胞密度較高處，隨機(jī)選擇5個(gè)高倍視野(400×)，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞中PD-1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，求其平均值作為PD-1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。以所有病例PD-1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均數(shù)為閾值，>該閾值即為PD-1陽(yáng)性，<該閾值即為PD-1陰性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料的比較采用χ2檢驗(yàn)，當(dāng)樣本量<5時(shí)進(jìn)行Fisher確切檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床特征本組41例LEC中有34例(34/41，82.93%)無癥狀患者為體檢偶然發(fā)現(xiàn)，僅7例(7/41，17.07%)患者出現(xiàn)臨床癥狀，主要表現(xiàn)為咳嗽、咳痰、咯血或胸悶。腫瘤部位：中央型11例、周圍型30例，具體分別為左肺上葉2例(5%)、左肺下葉11例(27%)、左下肺門2例(5%)、右肺上葉6例(14%)、右肺下葉13例(32%)、右肺中葉7例(17%)。臨床分期：Ⅰ期21例(51%)，Ⅱ期4例(10%)，Ⅲ期13例(32%)，Ⅳ期3例(7%)。所有患者均在首診時(shí)進(jìn)行了血清腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)：CA199升高1例，CA125和CEA升高各2例，NSE升高4例，細(xì)胞角蛋白19片段(Cyfra21-1)升高11例，其他血清腫瘤標(biāo)志物均陰性。所有患者均經(jīng)手術(shù)切除病灶，接受新輔助治療者3例，接受輔助治療者19例，化療周期>4個(gè)療程者7例。隨訪截至2021年12月31日，隨訪時(shí)間6～54個(gè)月，患者均存活，其中3例分別出現(xiàn)胸腔、肝和骨轉(zhuǎn)移。

2.2 病理檢查眼觀：41例手術(shù)根治標(biāo)本，腫瘤呈結(jié)節(jié)狀，大小不等，腫瘤最大徑0.5～9.8 cm(中位最大徑3.2 cm)，均無明顯包膜，境界欠清，切面灰白色，質(zhì)中，部分伴壞死。鏡檢：41例腫瘤組織學(xué)特點(diǎn)相似，低倍鏡下腫瘤細(xì)胞呈彌漫片狀浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，具有明顯的推進(jìn)性邊界；腫瘤細(xì)胞界限不清，呈合體細(xì)胞樣生長(zhǎng)，細(xì)胞核大、空泡狀，具有明顯的嗜酸性核仁；間質(zhì)有明顯的淋巴上皮病變及炎性反應(yīng)，浸潤(rùn)細(xì)胞以成熟的淋巴細(xì)胞為主，常伴有漿細(xì)胞和組織細(xì)胞(圖1)，個(gè)別病例伴嗜中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞；部分病例可見肉芽腫性炎(8例)(圖2)、局灶角化(4例)(圖3)、肺泡腔播散(3例)。

2.3 免疫表型及原位雜交腫瘤細(xì)胞CK5/6(41/41)(圖4)、p40(41/41)(圖5)、p63(41/41)、PD-L1(37/41)陽(yáng)性，其中16例(16/41)腫瘤細(xì)胞PD-L1呈高表達(dá)(圖6)；17例(17/41)腫瘤間質(zhì)淋巴細(xì)胞PD-1陽(yáng)性(圖7)，CK7、TTF-1、Napsin A、Syn、CgA、CD56陰性。PD-L1和PD-1表達(dá)與LEC患者年齡、性別、吸煙狀況、腫瘤分期等均無相關(guān)性(P>0.05，表1)。EBER原位雜交檢測(cè)結(jié)果均呈陽(yáng)性(圖8)。

2.4 基因檢測(cè)本組11例行基因突變檢測(cè)，包括RET基因融合、ROS1基因融合、EGFR基因突變、HER-2基因突變、PIK3CA基因突變、BRAF基因突變、KRAS基因突變、ALK基因重排，結(jié)果均呈陰性。

3 討論

LEC是一種罕見且獨(dú)特的肺癌亞型，好發(fā)于較為年輕且非吸煙的東南亞地區(qū)和中國(guó)的患者，無明顯性別差異[6]。WHO(2021)肺腫瘤分型系統(tǒng)將淋巴上皮瘤樣癌的名稱更改為淋巴上皮癌，并歸類于鱗狀細(xì)胞癌分類目錄下[7]，其組織學(xué)上與鼻咽癌非常類似，腫瘤免疫微環(huán)境中存在大量浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞。大多數(shù)肺LEC患者無明顯臨床表現(xiàn)，少數(shù)患者伴發(fā)熱、咯血、咳嗽、咳痰及胸悶等癥狀。肺LEC好發(fā)于左下肺葉和右中肺，但很少發(fā)生于右上肺[8]。本組41例患者多是通過體檢偶然發(fā)現(xiàn)肺部結(jié)節(jié)，僅4例有吸煙史，男女比為1.2 ∶1，發(fā)病年齡27～77歲，中位年齡54歲，腫瘤的發(fā)生部位多見于右肺下葉(32%)和左肺下葉(27%)，少見于左肺上葉(5%)和左下肺門(5%)。除外腫瘤發(fā)生部位，其余臨床癥狀與既往報(bào)道相似。

血清腫瘤相關(guān)標(biāo)志物對(duì)惡性腫瘤的輔助診斷、治療和疾病監(jiān)測(cè)具有重要作用。然而，肺LEC中血清腫瘤標(biāo)志物的特征尚不清楚。肺LEC患者血漿中的循環(huán)EBV-DNA含量可預(yù)測(cè)疾病進(jìn)展和治療反應(yīng)情況，較高的EBV濃度可能與腫瘤進(jìn)展和癌癥分期相關(guān)[9]。有學(xué)者報(bào)道血清NSE和Cyfra21-1水平可能與疾病的活動(dòng)性相關(guān)，可用于監(jiān)測(cè)早期腫瘤復(fù)發(fā)，因此建議在肺LEC治療期間進(jìn)行定期隨訪[10]。

①②③④⑤⑥⑦⑧

表1 41例原發(fā)性肺淋巴上皮癌患者PD-L1和PD-1表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

Qin等[11]發(fā)現(xiàn)肺LEC患者的CA125升高率達(dá)25.3%(20/79)，這提示CA125升高可能是預(yù)測(cè)肺LEC的標(biāo)志物之一。本組病例均在首診時(shí)進(jìn)行了血清腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)，1例患者CA199升高，各有2例患者CA125和CEA升高，4例患者NSE升高，11例患者Cyfra21-1升高，其他腫瘤標(biāo)志物均陰性。

肺LEC的組織病理特征與未分化的鼻咽癌類似，是一種分化差并混有明顯淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)及癌細(xì)胞核內(nèi)存在EBV的獨(dú)特類型的腫瘤，需與轉(zhuǎn)移性鼻咽癌、非霍奇金淋巴瘤進(jìn)行區(qū)分。有研究發(fā)現(xiàn)肺LEC的一些明顯的病理形態(tài)學(xué)特征，包括小灶角化、肉芽腫性炎以及肺泡腔擴(kuò)散和鱗狀擴(kuò)散模式[12]。本組患者通過鼻咽內(nèi)鏡檢查排除了鼻咽部轉(zhuǎn)移性LEC，其中有8例出現(xiàn)肉芽腫性炎、4例出現(xiàn)局灶角化和3例出現(xiàn)肺泡腔播散。免疫組化可為了解不同腫瘤的分化來源等生物學(xué)特征提供線索，本組病例表達(dá)CK5/6、p40、p63、PD-L1，不表達(dá)神經(jīng)內(nèi)分泌標(biāo)志物(Syn、CgA、CD56)和腺上皮標(biāo)志物(CK7、TTF-1、Napsin A)，所有病例EBER原位雜交均呈陽(yáng)性，提示肺LEC起源于上皮組織，本質(zhì)上屬于鱗狀細(xì)胞癌的一種亞型。此外，腫瘤間質(zhì)淋巴細(xì)胞PD-1陽(yáng)性率達(dá)41.46%(17/41)，這提示腫瘤相關(guān)微環(huán)境中存在著大量的免疫效應(yīng)細(xì)胞。

目前，肺LEC的分子機(jī)制和發(fā)病機(jī)制尚未明確。在整合基因組和轉(zhuǎn)錄組分析中發(fā)現(xiàn)[13]，肺LEC中腫瘤相關(guān)基因鋅指和BTB結(jié)構(gòu)域16(zinc finger and BTB domain containing 16, ZBTB16)、過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisomeproliferator-activated receptors γ, PPARγ)和重組人轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β受體2(recombinant human transforming growth factor beta receptor 2, TGFBR2)顯著下調(diào)，同時(shí)存在拷貝數(shù)變異(copy number variations, CNVs)的丟失，但缺乏NSCLC中常見的驅(qū)動(dòng)基因突變(如EGFR、KRAS和BRAF等)。因此，肺LEC缺乏驅(qū)動(dòng)突變因子可能會(huì)使腫瘤細(xì)胞的侵襲性降低，并可能導(dǎo)致肺LEC患者的生存率增加。此外，EBV可以促進(jìn)BART5-3P的表達(dá)，TP53突變和PD-L1表達(dá)與無瘤生存期(disease-free survival, DFS)相關(guān)，這些發(fā)現(xiàn)為肺LEC的分子機(jī)制研究提供了新見解。本組病例未檢測(cè)到PIK3CA、RET、ALK、ROS1、EGFR、BRAF、KRAS和HER-2基因突變。與低基因突變率不同，PD-L1在肺LEC中的陽(yáng)性率達(dá)90%以上(37/41)，其中16例呈高表達(dá)(16/41, 34.15%)，但PD-L1表達(dá)與LEC患者年齡、性別、吸煙狀況、腫瘤分期等均無相關(guān)性(P>0.05)。本組PD-L1的表達(dá)水平高于既往文獻(xiàn)報(bào)道的數(shù)據(jù)，但PD-L1表達(dá)對(duì)肺LEC患者的預(yù)后意義存在爭(zhēng)議。有研究證實(shí)[14]，肺LEC中PD-L1陽(yáng)性率為75%，并且PD-L1陽(yáng)性患者有更長(zhǎng)的DFS和總生存期(overall survival, OS)。另有研究表明[15]，PD-L1表達(dá)與LEC患者年齡、性別、吸煙狀況、腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和OS均無相關(guān)性(P>0.05)。

早期肺LEC主要通過手術(shù)治療，晚期常以放療聯(lián)合化療進(jìn)行綜合治療。雖然肺LEC患者的預(yù)后優(yōu)于其他亞型的NSCLC患者，但仍有部分患者出現(xiàn)治療耐藥性，從而出現(xiàn)局部腫瘤復(fù)發(fā)和(或)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[16]。對(duì)于綜合治療失敗的肺LEC晚期患者，目前暫無統(tǒng)一和標(biāo)準(zhǔn)的治療措施。此外，肺LEC基因突變罕見可能提示靶向治療的低敏感性，而PD-L1在肺LEC中高表達(dá)揭示了在這一亞型肺癌中使用免疫治療的可能性[17]。并且免疫治療的有效性可能不僅取決于腫瘤組織中PD-L1表達(dá)情況，還取決于腫瘤微環(huán)境中是否有足夠的免疫效應(yīng)細(xì)胞；肺LEC腫瘤周圍間質(zhì)有豐富的淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞浸潤(rùn)，這可能是肺LEC患者盡管PD-L1低表達(dá)但仍受益于免疫治療的原因之一[11]。因此，PD-1/PD-L1抑制劑可能是晚期肺LEC患者的有效治療方式之一，或許將改變晚期肺LEC患者的治療模式。本組病例均經(jīng)手術(shù)切除病灶，接受新輔助治療者3例，接受輔助治療者19例，化療周期>4程者7例。腫瘤細(xì)胞和間質(zhì)淋巴細(xì)胞的PD-1及PD-L1陽(yáng)性率較高，分別為90.24%、41.46%，這為腫瘤的免疫治療提供了依據(jù)。目前患者均存活且狀態(tài)良好，其中3例分別出現(xiàn)胸腔、肝和骨轉(zhuǎn)移，并且將繼續(xù)接受輔助治療。

綜上，肺LEC是一種少見且獨(dú)特亞型的肺惡性腫瘤，好發(fā)于非吸煙的年輕患者，組織學(xué)特征與鼻咽癌相似，且與EBV密切相關(guān)。因此，診斷肺LEC首先要排除鼻咽等部位的腫瘤轉(zhuǎn)移。由于發(fā)病率低和病例信息有限，缺乏標(biāo)準(zhǔn)的治療模式，肺LEC治療方式主要通過手術(shù)、放療和化療。由于腫瘤相關(guān)基因突變率低，晚期肺LEC患者不太可能從靶向治療中獲益。PD-1及PD-L1在肺LEC中高表達(dá)使得免疫治療成為肺LEC治療熱點(diǎn)，但仍需進(jìn)一步的臨床研究驗(yàn)證。由于樣本量及隨訪時(shí)間有限，未來將開展具有足夠長(zhǎng)隨訪時(shí)間的多中心研究，以提供更多的證據(jù)來確定肺LEC的最佳治療策略。