4種蚯蚓腸道微生物對砷毒性的響應(yīng)差異研究

王洪濤,丁 晶,邵元虎,張衛(wèi)信,傅聲雷,*

1 黃河中下游數(shù)字地理技術(shù)教育部重點實驗室；河南大學地理與環(huán)境學院,開封 475004 2 煙臺大學環(huán)境與材料工程學院,煙臺 264005

土壤動物廣泛分布在世界各地,是土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分。它們參與了眾多土壤生態(tài)過程,如土壤有機質(zhì)分解及營養(yǎng)元素生物地球化學循環(huán)等,在土壤健康和生物多樣性中發(fā)揮了關(guān)鍵作用[1—3]。其中蚯蚓是土壤中最大的無脊椎動物,被稱為土壤的“生態(tài)系統(tǒng)工程師”和“基石物種”。蚯蚓不僅可以改善土壤結(jié)構(gòu)和肥力,還可以影響土壤有機質(zhì)分解和養(yǎng)分循環(huán),并促進植物生長[4—5]。此外,越來越多的研究表明,大量微生物定植在蚯蚓腸道內(nèi),這些腸道菌群直接參與了碳氮元素代謝轉(zhuǎn)化,在促進宿主健康方面也起著至關(guān)重要的作用[6—8]。然而,我們對土壤動物腸道微生物菌群的研究才剛剛開始,對于蚯蚓腸道菌群的組成多樣性和生態(tài)功能的了解還很缺乏。

砷是環(huán)境中廣泛存在的天然有毒類金屬元素。由于礦山開采、金屬冶煉等工業(yè)活動,以及畜糞、含砷農(nóng)藥等農(nóng)業(yè)活動將大量砷排放入土壤中,從而引起土壤砷污染問題。當前土壤砷污染已引起全球公眾的廣泛關(guān)注[9]。土壤中的砷元素可對植物、動物產(chǎn)生不利影響,還可通過食物鏈在人體富集,對人類健康構(gòu)成嚴重威脅。同時,砷在土壤環(huán)境中的行為歸宿和生物毒性均與其化學形態(tài)有密切關(guān)系[10]。而環(huán)境中微生物在和砷的長期共存過程中,進化出多種砷代謝轉(zhuǎn)化機制,能夠調(diào)節(jié)砷的形態(tài)和遷移轉(zhuǎn)化,在砷的地球化學循環(huán)中起到關(guān)鍵作用[11]。此外,進入農(nóng)田土壤的污染物砷嚴重影響蚯蚓的生長和繁殖,砷對蚯蚓生態(tài)毒理危害的研究已引起了廣泛關(guān)注[12—13]。微生物介導(dǎo)的砷轉(zhuǎn)化影響著砷的生物毒性,對于砷的遷移轉(zhuǎn)化過程具有重要作用。然而蚯蚓腸道內(nèi)微生物介導(dǎo)下砷的生物轉(zhuǎn)化過程還不清楚。因此,研究蚯蚓腸道微生物群落介導(dǎo)下的砷生物轉(zhuǎn)化過程,對于了解蚯蚓腸道在砷的土壤地球化學循環(huán)中所起的作用具有重要意義。

蚯蚓種類豐富,目前發(fā)現(xiàn)已達6000多種。不同類型的蚯蚓擁有大量的生物多樣性,共同維持著土壤生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定[14]。根據(jù)蚯蚓的生活習性及生態(tài)功能間的差異,研究者將蚯蚓分為3種生態(tài)型種類,即表棲類,內(nèi)棲類和深棲類[15]。不同種類的蚯蚓,它們的生理構(gòu)造和代謝能力存在差異,而且這些差異有助于在蚯蚓生態(tài)群落中建立各自獨特的細菌群落,維持著土壤動物的生物多樣性。因此,我們推測不同蚯蚓腸道微生物也存在顯著差異,且對砷毒性的響應(yīng)機制也存在一定差異,腸道內(nèi)的砷形態(tài)和生物轉(zhuǎn)化關(guān)鍵基因也存在不同。Button等[16]發(fā)現(xiàn)砷污染土壤中,蚯蚓Lumbricusrubellus和Dendrodrillusrubidus組織和腸道內(nèi)砷形態(tài)主要有三價砷(As(III)),五價砷(As(V))以及有機砷等多種形態(tài)。Wang等[17]研究了高濃度砷污染對單一蚯蚓Metaphiresieboldin腸道微生物的影響。然而該研究僅局限于單一生物物種,且砷濃度設(shè)置較高,與土壤環(huán)境中普遍存在砷濃度不相符合。因此, 開展廣泛砷濃度條件下對不同蚯蚓腸道微生物影響的差異性研究, 對于完善砷在地下動物的生物化學循環(huán)多樣性等方面的知識具有重要意義。因此,本研究設(shè)定了一個較低濃度砷的土壤環(huán)境,且選取土壤系統(tǒng)中常見的4種蚯蚓為目標物種,測定蚯蚓組織內(nèi)砷的含量,腸道微生物與砷轉(zhuǎn)化基因,并分析它們之間的聯(lián)系。研究結(jié)果將有助于我們理解砷在地下土壤動物腸道內(nèi)生物多樣性的轉(zhuǎn)化過程。

1 材料與方法

1.1 材料準備與實驗設(shè)計

土壤采自浙江寧波某塊廢棄菜地,同時在該地附近農(nóng)田采集蚯蚓。采集完成后,將土壤和蚯蚓一并運回實驗室。野外采集土壤風干過篩后備用,蚯蚓則進行實驗室內(nèi)馴化及種類鑒定[17]。最后從中選取4種常見蚯蚓種類,分別是安德愛勝蚓(Eiseniaandrei),湖北遠盲蚓(Amynthashupeiensis),加州腔蚓(Metaphirecalifornica)和通俗腔蚓(Metaphirevulgaris)。

稱取過10目篩的風干土樣加到聚乙烯塑料保鮮盒中,充分混勻,用超純水配置As(V)母液(溶解固體含砷化合物Na3AsO4·12H2O),分別將對應(yīng)濃度As(V)溶液,均勻加入到保鮮盒中,溶液充分淹沒土壤并混勻,放在實驗室老化半個月,從而得到一系列處理土壤樣品。本次實驗共設(shè)四個處理,即空白(砷的背景濃度為5 mg/kg)無蚯蚓,空白(砷的背景濃度為5 mg/kg)有蚯蚓,砷濃度分別為15 mg/kg和25 mg/kg的蚯蚓處理組,每個處理設(shè)置5個重復(fù),其中空白無蚯蚓處理是為了探討蚯蚓活動對土壤背景值下砷生物轉(zhuǎn)化行為的影響。同時每個保鮮盒容器內(nèi)放入10條大小和重量相似的同一種蚯蚓,即每個保險盒內(nèi)一共40條蚯蚓。最后保鮮盒放入培養(yǎng)箱內(nèi)(光照/黑暗循環(huán)時間各一半,相對濕度75%,溫度20—22℃)培養(yǎng)28 d。實驗期間,定期向土壤中加入無菌超純水,保證土壤含水率保持在30%左右。

1.2 樣品分析方法

1.2.1樣品DNA提取

每份土壤樣品充分混勻,裝入無菌自封袋中,多余土壤樣品風干測理化性質(zhì)。用無菌鑷子將蚯蚓從土壤樣品取出,同時去除體表土壤殘余物,并在無菌超純水中漂洗五次,然后在無菌操作臺上使用無菌鑷子和無菌剪刀將蚯蚓解剖,取出其腸道內(nèi)含物。提DNA的土樣和蚯蚓腸道樣品,均放在-20 ℃冰箱備用。測砷形態(tài)的土壤、腸道和蚯蚓組織樣品,存于-80 ℃冰箱備用。本實驗使用Fast DNA? Spin Kit for Soil(MP Biomedical, 美國)規(guī)格提取試劑盒提取土樣和腸道樣品DNA。使用紫外分光光度計 ND- 1000測定所提DNA濃度,最后將DNA樣品儲存于-20 ℃冰箱備用。

1.2.2細菌16S rRNA基因擴增,高通量測序和微生物群落生物分析

以提取DNA為模板,并對細菌16S rRNA基因的可變V4區(qū)進行擴增。上游引物為515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA- 3′),而下游引物為806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT- 3′),其下游引物含有6 個堿基片段的barcode。PCR的擴增條件如下：95 ℃預(yù)變性2 min；然后30個循環(huán)擴增,每個循環(huán)含95 ℃變性20 s,55 ℃退火15 s,72 ℃延伸1 min；最終72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)過純化回收并混庫后,送測序公司(諾禾致源,中國)進行Illumina測序。使用服務(wù)器QIIME 1對測序數(shù)據(jù)進行下游分析[18]。其中,原始序列需要進行分類,然后去除低質(zhì)量或模糊序列,從而得到高品質(zhì)目標序列。隨后用Uclust聚類法(97%的相似度水平)將高質(zhì)量序列進一步聚類為操作分類單元(Operational Taxonomic Units, OTUs)[19—20]。接著通過稀有化分析獲得樣品序列的多樣性,其中通過不同測序深度下細菌群落多樣性可得到每個樣品內(nèi)在多樣性(即Alpha多樣性,如Chao1指數(shù)和香農(nóng)(Shannon)指數(shù)等),通過計算相同測序深度來比較不同樣品間的多樣性(即Beta多樣性,如基于Bray-Curtis距離的主坐標分析)。

1.2.3高通量定量PCR

我們采用SmartChip Real-time PCR Systems(WaferGen,美國)高通量熒光定量系統(tǒng)對所有樣品中砷生物轉(zhuǎn)化基因進行定量測序。引物一共有80對,包含79對砷轉(zhuǎn)化基因和16S rRNA gene,引物具體信息以及定量PCR體系溫度時間條件設(shè)定參數(shù)參考Zhao等[21]的研究。根據(jù)砷轉(zhuǎn)化基因的功能特征,將其分為四類,即五價砷還原(As(V) reduction),三價砷氧化(As(III) oxidation),砷(去)甲基化(As (de)methylation),和砷轉(zhuǎn)運(As transport)。一個基因檢測閾值(CT,31)被用來作為有效擴增基因的主要依據(jù),同時每個樣品包含3 個技術(shù)重復(fù)(三次技術(shù)重復(fù)都擴增出來時,才認定該樣品檢測出來)。此外,通過公式(1)計算每個樣品的基因拷貝數(shù), 當CT值超出31或為0時,認定該基因沒有檢測出來,其對應(yīng)的CT值被替換為31。為降低樣品間DNA提取效率差異,使用公式(2)將公式(1)轉(zhuǎn)換為歸一化的基因豐度,即每個細菌細胞基因的拷貝數(shù),在這里計為其相對豐度。

(1)

Relative abundance=4.1× (Relative ABG Copy Number/Relative 16S rRNA Copy Number)

(2)

1.2.4樣品理化分析

土壤pH值采用pH儀進行測定(水土比為2.5∶1),土壤TC和TN使用C/N 分析儀(Vario MAX C/N,德國)燃燒法進行測定,TOC分析儀(Vario TOC cube,德國)測定土壤總有機碳TOC。采用微波消解儀(CEM Microwave Technology Ltd., 英國) 進行土壤重金屬預(yù)消解,具體消解體系及消解程序參照我們之前的方法[17]。土壤中As、Cd、Cr、Cu、Ni、Pb和Zn含量由電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS, Agilent 7500 ce, Agilent Technologies, 美國)測定。每批消解樣品都有3個空白對照,以及兩個樣品技術(shù)平行,樣品平行重復(fù)的相對偏差均在10%以內(nèi),其中使用標準物質(zhì)黃棕壤GBW07403和扇貝GBW07403來進行校準驗證,回收率均在91.1%—109.3%之間,達到要求。此外,土壤,蚯蚓腸道及組織樣品砷形態(tài)的提取方法同樣參照之前方法,后續(xù)使用高效液相色譜(HPLC, Agilent 1200, Agilent Technologies, 美國)和ICP-MS聯(lián)用測定樣品的砷形態(tài)[17]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

本研究中均值,百分比,變異系數(shù),標準差和熱圖等均采用Excel 2016(Microsoft,美國)完成。各個樣品間顯著性分析采用SPSS V18.0(IBM,美國),其中本文使用單因素方差分析(one-way analysis of variance,one-way ANOVA)比較數(shù)據(jù)在0.05水平上的顯著性,顯著性檢驗的方法用Tukey HSD進行檢驗包括數(shù)據(jù)前期正態(tài)分布檢驗。微生物數(shù)據(jù)分析主要基于R(version 3.4.3)軟件繪制,如使用R vegan2.3- 1工具進行了主坐標分析,Adonis test算法檢驗不同樣品間的微生物群落分布顯著性。柱狀圖和箱線圖等由Origin Pro8.5(OriginLab,美國)完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同蚯蚓間體重,存活率,砷總量和形態(tài)的響應(yīng)差異

經(jīng)28天污染土壤暴露后,3個處理組間所有蚯蚓的體重(濕重)和數(shù)目(存活率)均無顯著差異變化(ANOVA,P>0.05；表1),土壤中低濃度砷對蚯蚓存活數(shù)及生長影響不大。此外,這4種蚯蚓的體重之間存在較大差異,如通俗腔蚓的體重為4.67 g,是安德愛勝蚓體重的12.4倍(P<0.05)。

表1 蚯蚓體重和數(shù)量變化特征

數(shù)據(jù)以“均值±標準差”(n=5)表示；相同字母(a)表示不同處理間的數(shù)據(jù)不存在顯著差異(在0.05水平上,ANOVA);As5：砷濃度為5 mg/kg的處理組 Treatment with arsenic concentration of 5 mg/kg；As15：砷濃度為15 mg/kg的處理組 Treatment with arsenic concentration of 15 mg/kg；As25：砷濃度為25 mg/kg的處理組 Treatment with arsenic concentration of 25 mg/kg;Ea：安德愛勝蚓Eiseniaandrei；Ah：湖北遠盲蚓Amynthashupeiensis；Mc：加州腔蚓Metaphirecalifornica；Mv：通俗腔蚓Metaphirevulgaris

隨著土壤中砷濃度的增加,所有蚯蚓腸道和組織中砷含量均呈現(xiàn)一個增加的趨勢(P<0.05；圖1)。如As5處理中安德愛勝蚓組織砷濃度為11.8 mg/kg,但在As25處理中其砷濃度富集至38.1 mg/kg。加州腔蚓腸道在As25處理中砷含量(28.9 mg/kg)是其As5處理中(7.01 mg/kg)的4.1倍。同時,不同蚯蚓在同一土壤處理組中的砷富集濃度存在較大差異。4種蚯蚓富集系數(shù)由高到低依次為：安德愛勝蚓(1.93)> 安德愛勝蚓(0.80)> 通俗腔蚓(0.78)> 湖北遠盲蚓(0.52)。如處理As25中加州腔蚓組織砷含量為21.3 mg/kg,而相同處理下湖北遠盲蚓砷濃度僅為10.8 mg/kg。從圖1中,我們可以看到土壤中砷形態(tài)主要以As(V)為主,As(III)僅占17.0%。而在各個蚯蚓腸道或組織內(nèi),砷形態(tài)均以As(III)為主,占總砷含量高達80.7%。同時在安德愛勝蚓腸道組織中,檢測到部分有機砷,主要以砷甜菜堿(Arsenobetaine, AsB)為主,占比11.7%。湖北遠盲蚓僅組織內(nèi)發(fā)現(xiàn)了部分有機砷AsB。

圖1 蚯蚓組織和腸道內(nèi)砷富集濃度和砷形態(tài)所占百分比Fig.1 Arsenic concentrations and proportion of arsenic species in the soil, earthworm body tissues and gut圖中右側(cè)C：對照無蚯蚓組；As(V)：五價砷 Pentavalent arsenic；As(III)：三價砷 Trivalent arsenic；AsB：砷甜菜堿 Arsenobetaine;數(shù)據(jù)以“均值±標準差”(n=5)表示;Ea：安德愛勝蚓 Eisenia andrei；Ah：湖北遠盲蚓 Amynthas hupeiensis；Mc：加州腔蚓 Metaphire californica；Mv：通俗腔蚓 Metaphire vulgaris

2.2 土壤和各種蚯蚓腸道細菌群落結(jié)構(gòu)差異

從基本理化性質(zhì)來看,土壤和蚯蚓腸道之間存在較大差異(表2)。蚯蚓腸道pH值為6.74,較高于周圍土壤的pH值(6.11)。蚯蚓腸道內(nèi)總碳(125 mg/g)和總可溶性碳(56.2 mg/g)含量顯著高于土壤中含量(分別為33.3 mg/g和0.48 mg/g,P<0.01)。此外,蚯蚓腸道內(nèi)重金屬鎘(Cd)含量(2.73 mg/kg)顯著高于土壤中鎘含量(0.2 mg/kg,P<0.01)。

表2 本研究中土壤和蚯蚓腸道原位性質(zhì)

所有樣品經(jīng)過微生物群落高通量測序和下游分析后,一共獲得高質(zhì)量9 903 591個高質(zhì)量序列,這些序列根據(jù)97%的相似性原則進行OTUs聚類,共得到95 900個OTUs。其中土壤的OTUs數(shù)目(36 294)顯著高于蚯蚓腸道OTUs數(shù)目(P<0.01)。同時,土壤和蚯蚓腸道細菌群落組成成分間存在差異。變形菌門(Proteobacteria),厚壁菌門(Firmicutes),綠彎菌門(Chloroflexi),放線菌門(Actinobacteria),和酸桿菌門(Acidobacteria)是土壤中的優(yōu)勢菌群,它們在總菌群中占據(jù)的比例高達73.4%。而各個蚯蚓腸道內(nèi)的優(yōu)勢菌基本一致,主要是放線菌,厚壁菌和變形菌等,它們的相對豐度總和比例為76.6%(圖2)。其中土壤酸桿菌門(9.3%)的豐度顯著高于各個蚯蚓腸道內(nèi)(0.7%)的豐度(P<0.01),而土壤放線菌門(11.0%)豐度顯著低于各個蚯蚓腸道內(nèi)(28.0%)的豐度(P<0.01)。

圖2 土壤和蚯蚓腸道細菌群落在門和屬水平上的物種組成和相對豐度Fig.2 Composition and abundance of bacterial community of soil and gut at the phylum and genus level圖中僅顯示了前11個高豐度的細菌組成,其他均歸為“Other”類別;圖例中文注釋,變形菌門：Proteobacteria；厚壁菌門：Firmicutes；綠彎菌門：Chloroflexi；放線菌門：Actinobacteria；酸桿菌門：Acidobacteria；擬桿菌門：Bacteroidetes；浮霉菌門：Planctomycetes；泉古菌門：Crenarchaeota；疣微菌門：Verrucomicrobia；芽單胞菌門：Gemmatimonadetes；軟壁菌門：Tenericutes。熱圖顯示了豐度最高的前24種屬水平上的物種組成。如屬水平上物種不確定,則使用該水平上一級(科或目水平)的物種組成,顏色越紅表示豐度越高,顏色越藍表示豐度越低。圖例中文注釋,魯梅爾芽胞桿菌屬：Rummeliibacillus；微單孢菌科：Micromonosporaceae；分支桿菌屬：Mycobacterium；類諾卡氏菌科：Nocardioidaceae；黃色土源菌：Flavisolibacter；凱氏桿菌屬：Kaistobacter；科里氏菌科：Koribacteraceae；黃單胞菌科：Xanthomonadaceae；紅游動菌屬：Rhodoplanes；黃桿菌屬：Flavobacterium；紅螺菌科：Rhodospirillaceae；假單胞菌屬：Pseudomonas；伊索菌科：Isosphaeraceae；梭菌屬：Clostridium；紅桿菌目：Solirubrobacterales；芽孢桿菌屬：Bacillus；纖線桿菌科：Ktedonobacteraceae；鏈霉菌屬：Streptomyces；氣單胞菌科：Aeromonadaceae

熱圖(圖2)顯示了土壤和各個蚯蚓腸道間在屬水平上細菌群落組成差異。土壤各組成成分豐度變化不大,豐度最高細菌Ktedonobacteraceae所占序列也僅為5.0%,而腸道內(nèi)微生物群落組成則較集中,如加州腔蚓和通俗腔蚓腸道內(nèi)Aeromonadaceae豐度分別高達16.9%和19.5%。此外,土壤中CandidatusKoribacter的豐度為2.4%,遠遠高于其在蚯蚓腸道內(nèi)的豐度(0.1%,P<0.05)。

除了微生物組成成分存在差異以外,土壤和各個蚯蚓腸道細菌群落分布模式也存在顯著差異。圖3中主坐標分析結(jié)果顯示,土壤菌群模式聚集在一起,分布在坐標軸右側(cè),沿著第一軸與分布在左側(cè)的各個蚯蚓腸道細菌群落模式顯著隔開(Adonis test, R=0.94,P<0.005)。同時安德愛勝蚓和湖北遠盲蚓腸道細菌群落聚集在左側(cè)下方,而加州腔蚓和通俗腔蚓聚集在左側(cè)上方,這兩類腸道菌群主要沿第二軸顯著分開(Adonis test,P=0.001)。此外,土壤細菌多樣性顯著高于各個蚯蚓腸道內(nèi)多樣性(P<0.01,圖3)。其中Shannon指數(shù)表明加州腔蚓腸道細菌多樣性顯著低于安德愛勝蚓和湖北遠盲蚓。

圖3 土壤和蚯蚓腸道細菌群落beta多樣性和alpha多樣性Fig.3 Beta diversity and alpha diversity of bacterial communities in soil and earthworm gut圖中土壤和蚯蚓腸道細菌群落beta多樣性分布圖是基于Bray-Curtis距離的主坐標分析繪制的;箱線圖顯示土壤和腸道細菌群落Shannon指數(shù)的差異。不同字母(abc)顯示土壤和各個蚯蚓間的細菌多樣性在0.05水平上存在顯著差異(ANOVA)

2.3 各種蚯蚓腸道微生物對砷污染的不同響應(yīng)

土壤中低濃度砷改變4種蚯蚓腸道內(nèi)群落組成,且各種蚯蚓腸道微生物對砷響應(yīng)存在較大差異。如對照組中安德愛勝蚓腸道變形菌門豐度為22.7%,而As25處理中其腸道內(nèi)變形菌門的豐度下降到13.7%(P<0.05)。圖4展示了4種蚯蚓腸道內(nèi)科水平細菌群落主要組成成分的變化。所有蚯蚓腸道內(nèi)假單胞菌科(Pseudomonadaceae)的豐度隨著土壤砷濃度的增加而顯著減少(P<0.05),芽胞桿菌科(Bacillaceae),動性球菌科(Planococcaceae)在湖北遠盲蚓,安德愛勝蚓和加州腔蚓腸道內(nèi)呈現(xiàn)相反的趨勢,即顯著增加(P<0.05)。相對于其他3種蚯蚓,通俗腔蚓內(nèi)細菌群落變化較少。此外,低濃度砷暴露還能改變腸道細菌群落多樣性。如As25處理組湖北遠盲蚓腸道內(nèi)細菌多樣性Chao1指數(shù)顯著高于對照處理組,而As25處理組通俗腔蚓腸道內(nèi)細菌多樣性Chao1指數(shù)顯著低于對照處理組(P<0.05)。通過Adonis test統(tǒng)計分析,發(fā)現(xiàn)低濃度砷顯著改變4種蚯蚓腸道微生物結(jié)構(gòu)模式(P<0.05,圖3)。

圖4 各個蚯蚓腸道內(nèi)砷處理下科水平細菌的差異性變化Fig.4 Different changes of bacterial families among arsenic treatments in different earthworm gutBacillaceae：芽胞桿菌科；Streptomycetaceae：鏈霉菌科；Planococcaceae：動性球菌科；Pseudomonadaceae：假單胞菌科；圖中不同字母表示腸道細菌群落多樣性在3個處理間存在顯著差異(在0.05水平上,ANOVA)

2.4 砷生物轉(zhuǎn)化基因多樣性與豐度分布特征

土壤和蚯蚓腸道樣品內(nèi)一共檢測到17種砷的生物轉(zhuǎn)化基因(圖5),并且土壤中的砷轉(zhuǎn)化基因數(shù)目顯著高于腸道內(nèi)基因數(shù)目(P<0.05)。其中土壤中檢測到的砷轉(zhuǎn)化基因數(shù)目最多為17個,在湖北遠盲蚓腸道內(nèi)檢測到的基因數(shù)目最少為7個。外源砷的添加沒有顯著改變土壤或腸道內(nèi)砷轉(zhuǎn)化基因的數(shù)量(P>0.05)。此外樣品中砷轉(zhuǎn)化基因相對豐度的檢測范圍為0.56—0.63 拷貝數(shù)/每細胞,外源砷的添加也沒有明顯改變土壤中砷轉(zhuǎn)化基因的豐度,但蚯蚓腸道內(nèi)基因的豐度變化范圍較大,最低為0.05 拷貝數(shù)/每細胞(As25處理-湖北遠盲蚓腸道內(nèi)),最高豐度則達到0.47 拷貝數(shù)/每細胞(As15處理-通俗腔蚓腸道內(nèi))。土壤中砷轉(zhuǎn)化基因的豐度顯著高于各個蚯蚓腸道(P<0.05,圖5)。4種蚯蚓腸道內(nèi)砷基因隨著外源砷的增加,其豐度均呈現(xiàn)一個先增加后減少的趨勢。如空白處理下湖北遠盲蚓腸道內(nèi)砷豐度為0.11 拷貝數(shù)/每細胞,As15處理下其豐度增加到0.13 拷貝數(shù)/每細胞,最后在As25處理中豐度顯著下降到0.05 拷貝數(shù)/每細胞(P<0.05)。根據(jù)砷生物轉(zhuǎn)化基因的功能分類,土壤中砷轉(zhuǎn)化基因主要以As(III)氧化和As(V)還原為主,而在腸道內(nèi)主要以As(V)還原和砷轉(zhuǎn)運基因為主(圖5)。

圖5 土壤和蚯蚓腸道內(nèi)砷轉(zhuǎn)化基因的檢測數(shù)目和相對豐度Fig.5 The detected number and relative abundance of arsenic biotransformation genes (ABGs) in microbiome of soil and earthworm gutAs (III) oxidation：三價砷氧化基因；As (V) reduction：五價砷還原基因；As (de)methylation：砷(去)甲基化基因；As Transport：砷轉(zhuǎn)運基因;圖中數(shù)據(jù)為平均值±標準差(n=5)

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)低濃度砷對蚯蚓體重和生長變化無顯著影響,但能顯著改變蚯蚓腸道微生物群落。土壤砷濃度最高僅為25 mg/kg,明顯低于很多研究報道的蚯蚓半致死濃度[22—23]。同時rut等[24]發(fā)現(xiàn)微生物對污染物響應(yīng)較敏感,蚯蚓腸道微生物可用來作為重金屬污染的生物指示物。因此我們可以推測蚯蚓腸道微生物群落的擾動可作為對土壤污染物前期監(jiān)測的重要生物指標。同時4種蚯蚓組織內(nèi)砷濃度會隨著土壤中砷濃度的增加而增加,即砷污染會引起蚯蚓體內(nèi)砷的生物富集。這是容易理解的,蚯蚓長期生活在土壤圈內(nèi),砷元素可通過皮膚接觸或蚯蚓攝食行為,進入蚯蚓體內(nèi)從而不斷富集[25]。但不同種類蚯蚓的富集系數(shù)存在較大差異,這與各種蚯蚓的生態(tài)習性有很大聯(lián)系[26]。其中安德愛勝蚓屬表棲類,主要以枯枝碎屑為食。而其它種蚯蚓屬內(nèi)棲類,主要以礦質(zhì)土壤為食。食物來源不同,其進入各種蚯蚓體內(nèi)的砷含量自然存在較大差異。此外,這也和蚯蚓自身生理結(jié)構(gòu)和腸道微生物也有一點關(guān)系[8]。如加州腔蚓和通俗腔蚓屬同種生態(tài)型和同種分屬,且它們個體大小,腸道構(gòu)造和腸道微生物群落組成最為相似,因此這兩種蚯蚓砷富集系數(shù)也基本相同。

本研究表明土壤中砷形態(tài)以As(V)為主,而蚯蚓腸道主要以As(III)為主。土壤為好氧條件,其氧化還原電位為正。而蚯蚓腸道是一個厭氧環(huán)境,包括厭氧菌在內(nèi)的大量微生物參與了砷的生物化學形態(tài)轉(zhuǎn)化,As(V)將被還原為As(III),當然腸道內(nèi)高有機質(zhì)和中性pH等獨特微環(huán)境可能也是引起砷形態(tài)轉(zhuǎn)化的重要因素[6—7,17]。此外,各種蚯蚓腸道內(nèi)砷轉(zhuǎn)化基因以As(V)還原基因為主,這與腸道內(nèi)砷形態(tài)結(jié)果相一致。As(V)被還原為As(III)是微生物代謝最為關(guān)鍵的一個過程,As(III)將進行甲基化反應(yīng)生成甲基砷等低毒有機砷,這些毒性較小的砷形態(tài)經(jīng)砷轉(zhuǎn)運基因外排出體外,從而達到解毒目的[16—17,27]。我們在蚯蚓腸道微生物內(nèi)均檢測到砷甲基化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)化酶AsM和部分有機砷 AsB,這和大部分研究結(jié)果一致[16,27],也驗證了關(guān)于蚯蚓腸道內(nèi)微生物參與下砷形態(tài)轉(zhuǎn)化的猜想。同時,4種蚯蚓體內(nèi)砷轉(zhuǎn)化基因豐度會隨著土壤中砷濃度增加,呈現(xiàn)出一個先增加后減少的趨勢。研究表明土壤中金屬濃度較低時能刺激微生物的生長,增加微生物活性。但當金屬濃度升高時,會出現(xiàn)明顯抑制效應(yīng),使微生物生物量出現(xiàn)一個減少趨勢[28]。據(jù)此推測,低濃度砷可以刺激并提高腸道內(nèi)微生物的活性,而較高濃度砷則抑制其腸道內(nèi)微生物的活性,從而影響腸道內(nèi)生物代謝速率,進而間接影響到微生物介導(dǎo)下的砷生物轉(zhuǎn)化基因的豐度。

本研究結(jié)果進一步顯示4種蚯蚓腸道微生物均與土壤微生物群落存在顯著差異,這與土壤和腸道所處微環(huán)境有直接關(guān)系[7,17,29—30]。從表2看出蚯蚓腸道缺氧,pH偏中性,可溶性碳氮含量遠高于好氧的土壤。同時各種蚯蚓腸道微生物群落間也存在很大差異?？赡茉蛑饕袃蓚€,第一不同生態(tài)型的蚯蚓自身生理構(gòu)造存在差異,特別是腸道內(nèi)的結(jié)構(gòu)存在不同。當然各個蚯蚓攝食習慣的不同也會引起腸道菌群的差異。Knapp等[31]發(fā)現(xiàn)蚯蚓腸道微生物組對所攝取的食物來源有很強的依賴性。加州腔蚓和通俗腔蚓腸道內(nèi)氣單胞菌科(Aeromonadaceae)的相對豐度高達16%,而在安德愛勝蚓腸道內(nèi)僅為0.3%。該菌在水體和淤泥中被大量發(fā)現(xiàn),是動物體內(nèi)常見的致病菌[32—33]。加州腔蚓和通俗腔蚓可能吞食大量含砷土壤,且長期生活在土壤內(nèi)部,可能會接觸較多的致病菌,從而引發(fā)蚯蚓腸道微生物出現(xiàn)紊亂。而安德愛勝蚓主要生活在土壤表層,主要以富含有機質(zhì)枯枝落葉為食。第二,進入蚯蚓腸道內(nèi)的砷以毒性更高的As(III)存在,同時蚯蚓腸道細菌群落較土壤菌群敏感,因此進入蚯蚓組織腸道內(nèi)砷對腸道菌群產(chǎn)生不同差異毒害。如假單胞菌科(Pseudomonadaceae)內(nèi)很多細菌具有分解營養(yǎng)元素的能力[34]。和空白處理組相比,As25處理中4種蚯蚓腸道內(nèi)假單胞菌科的豐度均顯著降低,這表明污染物砷的添加能夠破壞蚯蚓腸道微生物分解蛋白質(zhì)和脂肪的能力,從而抑制蚯蚓正常代謝。

4 結(jié)論

土壤中廣泛存在的砷元素對蚯蚓生態(tài)毒理無顯著影響,但顯著改變其腸道微生物群落結(jié)構(gòu),這表明蚯蚓腸道微生物組的變化可能比蚯蚓毒理指標更適合做土壤污染的指示性指標。同時蚯蚓腸道菌群和土壤群落顯著不同,且蚯蚓腸道細菌多樣性顯著低于土壤。蚯蚓組織和腸道內(nèi)砷形態(tài)主要以As(III)為主,其次是少量As(V)和有機砷,這和腸道內(nèi)As(V)還原和轉(zhuǎn)運為主的砷轉(zhuǎn)化基因分布特征一致,顯示蚯蚓腸道是一個微生物介導(dǎo)下砷形態(tài)轉(zhuǎn)化多樣性的潛在熱區(qū)。然而本文關(guān)于蚯蚓腸道內(nèi)砷還原和轉(zhuǎn)運解毒的機制和原理尚不清楚,有待深入發(fā)掘。