苜?？购詫η锛臼┯免浄史N類及用量的生理響應(yīng)

孫明雪，張玉霞，叢百明，夏全超，田永雷，張慶昕，杜曉艷

(1.內(nèi)蒙古民族大學(xué)農(nóng)學(xué)院/內(nèi)蒙古自治區(qū)飼用作物工程技術(shù)研究中心，內(nèi)蒙古 通遼 028041；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)通遼市畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究所，內(nèi)蒙古 通遼 028000；3.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010)

紫花苜蓿(MedicagosativaL.)是被譽為“飼草之王”的多年生豆科牧草[1]，具有適應(yīng)性強、營養(yǎng)價值高的特點，在世界各地種植面積超過3 000萬公頃[2]。我國的苜蓿栽培面積在國家扶持政策和區(qū)域化農(nóng)業(yè)布局優(yōu)化調(diào)整的引導(dǎo)下，已達到377萬hm2以上[3]，其中科爾沁沙地的苜蓿生產(chǎn)也得以快速發(fā)展，成為新興苜蓿優(yōu)勢生產(chǎn)區(qū)[4-6]。紫花苜蓿作為多年生牧草翌年產(chǎn)量的高低取決于苜蓿根頸能否安全越冬[7-8]，而科爾沁沙地冬季溫度低，晝夜溫差大，降水少等氣象特點都是限制苜蓿安全越冬的重要因素[9]。氮、磷、鉀是維持植物生命活動最重要的大量元素[10-11]，其中鉀元素是苜蓿維持生長發(fā)育的必要營養(yǎng)元素，鉀肥既能促進碳水化合物的轉(zhuǎn)運及蛋白質(zhì)的合成[12-13]，又能調(diào)節(jié)植物氣孔開閉，活化多種酶，提高植物抗逆性。鉀肥種類及用量對苜?？购缘挠绊懯欠翊嬖诓町悾绾瓮ㄟ^調(diào)控水分含量及狀態(tài)、含氮保護物質(zhì)提高苜蓿抗寒性方面的研究尚少。為此，本研究采用大田試驗對苜蓿進行秋季施用KCl和K2SO4兩種鉀肥的不同施用量處理，越冬前期挖取越冬材料采用低溫冷藏和低溫冷凍處理人工模擬低溫處理，測定苜蓿根頸相對電導(dǎo)率、含水量及含氮保護物質(zhì)變化，以期找到更經(jīng)濟有效的鉀肥種類及用量，為科爾沁沙地生境下合理施用鉀肥提高苜?？购蕴峁├碚撘罁?jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗地位于內(nèi)蒙古民族大學(xué)科技示范園區(qū)(43°36′N，122°22′E)。該地區(qū)屬于溫帶半干旱大陸性氣候，四季分明，降水集中，冬季漫長寒冷，降水少。年平均氣溫5.5℃，≥10℃年積溫為3 000℃～3 200℃，無霜期140～150 d，年平均降水量約375 mm，年平均風(fēng)速3.0～4.4 m·s-1，土壤為透氣性好、保水保肥較差、土壤溫度變幅較大的沙壤土，土壤有機質(zhì)含量為63.50 mg·kg-1，堿解氮含量34.95 mg·kg-1，全氮含量43.00 mg·kg-1，速效磷含量3.65 mg·kg-1，速效鉀含量78.01 mg·kg-1。

1.2 供試材料

供試紫花苜蓿(M.sativa)品種為北極熊，由北京百斯特有限公司提供。供試肥料為K2SO4(K2O 50%)和KCl(K2O 60%)。

1.3 試驗方法

1.3.1 大田試驗設(shè)計 試驗采用隨機區(qū)組設(shè)計，于2018年7月2日播種北極熊苜蓿品種，播種量為22.5 kg·hm-2，行距為30 cm，小區(qū)面積為3 m×5 m=15 m2。播種前一次性施入過磷酸鈣200 kg·hm-2為基肥。兩個鉀肥各設(shè)置5個處理：K0(不施鉀)、K1(50 kg·hm-2)、K2(100 kg·hm-2)、K3(150 kg·hm-2)、K4(200 kg·hm-2)K2O，每個處理設(shè)置3次重復(fù)，共27個小區(qū)，均作為基肥一次性施入。試驗田進行指針式噴灌，并正常進行雜草防除、病蟲防治等管理。于封凍前期挖取長勢一致的苜蓿越冬材料(包括根系、根頸、越冬芽)，帶回室內(nèi)進行低溫處理。

1.3.2 低溫處理試驗 每個處理取50株長勢均勻一致的苜蓿越冬材料，平均分成兩份，1份放入4℃冰箱中儲存(低溫冷藏)，將另1份苜蓿根系用蒸餾水沖洗干凈，整齊地排放在20 cm×30 cm的脫脂純棉布上包裹好，后用3 mL蒸餾水均勻噴灑，使棉布保持濕潤，最后用30 cm×30 cm的錫箔紙包裹好，放入可程式恒溫恒濕試驗箱進行-20℃低溫處理(低溫冷凍)?？沙淌胶銣睾銤裨囼炏湓O(shè)置為：以4℃為起點，先以每小時4℃的速度降溫，到達-20℃后保持6 h，后以每小時4℃的速度升溫至4℃，取出后在4℃下放置12 h，與冷藏處理材料同時測定苜蓿根頸相對電導(dǎo)率、自由水、束縛水及游離氨基酸和脯氨酸含量。

1.4 測定指標(biāo)及方法

相對電導(dǎo)率采用DDS電導(dǎo)率儀進行測定[14]，自由水和束縛水含量采用阿貝折射儀測定[15]，采用水合茚三酮法測定游離氨基酸含量[15]，采用酸性茚三酮法測定脯氨酸含量[15]。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)用Microsoft Excel 軟件處理、制作表格，用DPS 7.0軟件進行方差顯著性分析及相關(guān)性分析，采用二因素試驗統(tǒng)計分析Duncan新復(fù)極差法進行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同鉀肥種類及用量對苜蓿根頸相對電導(dǎo)率的影響

如表1所示，在4℃低溫冷藏處理下苜蓿根頸的相對電導(dǎo)率，KCl肥在K2和K3處理下的相對電導(dǎo)率顯著低于CK(P<0.05)，分別降低了19.73%和13.91%；K2SO4肥的相對電導(dǎo)率在各處理下均顯著低于CK(P<0.05)，且在K3處理下達到最小值。在-20℃低溫冷凍處理下，KCl和K2SO4肥處理苜蓿根頸的相對電導(dǎo)率較4℃處理分別增加了135.66%、153.22%、170.10%、129.70%、138.02%和135.66%、94.01%、53.39%、86.52%、143.52%，說明-20℃低溫冷凍處理增加了細(xì)胞膜透性，使細(xì)胞外滲液增多。K2SO4肥在各施肥量處理下的相對電導(dǎo)率均顯著低于KCl肥(P<0.05)，兩種鉀肥在K3和K4處理下的相對電導(dǎo)率均顯著低于CK(P<0.05)，且在K3處理下最低，分別為較CK降低了16.09%和44.21%，說明施用鉀肥有利于提高苜?？购?，且K2SO4肥優(yōu)于KCl肥，施用量以150 kg·hm-2K2O為宜。

表1 不同鉀肥處理苜蓿根頸在低溫處理下的相對電導(dǎo)率變化/%Table 1 Changes in relative conductivity of alfalfa root necks cultured with different potassium fertilizers under low temperature treatment

2.2 不同鉀肥種類及用量對苜蓿根頸自由水含量的影響

如表2所示，在4℃冷藏處理下苜蓿根頸的自由水含量，KCl肥在K3和K4處理下的自由水含量顯著低于CK(P<0.05)，分別降低了17%和13%；K2SO4肥的自由水含量在各處理下均較CK無顯著性差異。在-20℃處理下，KCl肥處理苜蓿根頸的自由水含量較4℃處理分別降低了11.94%、10.74%、21.59%、26.90%、13.95%，K2SO4肥處理苜蓿根頸的自由水含量較4℃處理分別降低了11.94%、10.62%、24.68%、51.34%、36.36%，說明-20℃處理下苜蓿根頸自由水含量降低；KCl肥在K2、K3和K4施肥量處理下的自由水含量顯著低于CK(P<0.05)，分別降低了14.96%、31.89%和16.08%；K2SO4肥在K2、K3和K4處理下的自由水含量顯著低于CK(P<0.05)，分別降低了12.26%、42.05%和28.88%；-20℃低溫冷凍處理下K2SO4肥的自由水含量小于KCl肥(K2處理除外)，且在K3施用量處理下苜蓿根頸自由水含量達到最小值，說明施用適量的鉀肥有利于降低苜蓿自由水含量，且K2SO4肥優(yōu)于KCl肥，施用量為K3處理150 kg·hm-2K2O時，苜蓿根頸中自由水含量最低，細(xì)胞保水能力更強。

表2 不同鉀肥處理苜蓿根頸在低溫處理下自由水含量的變化/%Table 2 Changes of free water content in root neck of alfalfa cultivated with different potassium fertilizers under low temperature treatment

2.3 不同鉀肥種類及用量對苜蓿根頸束縛水含量的影響

如表3所示，在4℃處理下苜蓿根頸的束縛水含量，KCl各施肥量處理下的束縛水含量均顯著高于CK(P<0.05)，且在K3下達到最大值；K2SO4的束縛水含量在K1、K3和K4施肥量處理下顯著高于CK(P<0.05)，且在K3下達到最大值，較CK增加了50%。在-20℃處理下，KCl肥處理苜蓿根頸的束縛水含量較4℃處理分別增加了88.21%、4.89%、62.54%、55.02%、41.56%，K2SO4肥處理苜蓿根頸的束縛水含量較4℃處理分別增加了88.21%、16.30%、164.46%、150.94%、91.62%，說明-20℃低溫處理下苜蓿根頸束縛水含量明顯增加；KCl肥的K3施肥量處理下的束縛水含量顯著高于CK(P<0.05)，增加了71.88%；K2SO4肥在K2、K3和K4處理下的束縛水含量顯著高于CK(P<0.05)，分別增加了29.83%、93.37%和39.72%；K2SO4處理的束縛水含量均大于KCl處理下的束縛水含量，說明施用鉀肥有利于增加苜蓿根頸中束縛水含量，且K2SO4優(yōu)于KCl，K3處理的施用量為150kg·hm-2K2O，苜蓿根頸中束縛水含量最高。

表3 不同鉀肥處理苜蓿根頸在低溫處理下束縛水含量的變化/%Table 3 Changes of irreducible water content in the root neck of alfalfa cultivated with different potassium fertilizers under low temperature treatment

2.4 不同鉀肥種類及用量對苜蓿根頸自由水/束縛水的影響

如表4所示，4℃低溫冷藏處理的苜蓿根頸的自由水/束縛水在KCl肥K3處理下最小，在K2SO4肥K1處理下最小。-20℃處理的苜蓿根頸的自由水/束縛水均較4℃處理明顯減小，說明低溫冷凍處理會使自由水/束縛水降低；K2SO4處理下自由水/束縛水小于KCl肥處理，且兩種鉀肥處理下的K3施肥量下自由水/束縛水最小，說明施肥量為150 kg·hm-2K2O最有利于促進苜蓿根頸束縛水含量的增加和自由水含量的降低，且K2SO4肥優(yōu)于KCl肥。

表4 不同鉀肥處理苜蓿根頸在低溫處理下自由水/束縛水的變化Table 4 Free water/bound water changes of alfalfa root necks cultured with different potassium fertilizers under low temperature treatment

2.5 不同鉀肥種類及用量對苜蓿根頸游離氨基酸含量的影響

如表5所示，在4℃冷藏處理下苜蓿根頸的游離氨基酸含量，KCl處理下的游離氨基酸含量在K1和K2施肥量下顯著高于CK(P<0.05)，且在K2下達到最大值;K2SO4處理下的游離氨基酸含量在K1施肥量處理下顯著高于CK(P<0.05)，較CK增加了23.74%。在-20℃低溫處理下，KCl處理苜蓿根頸的游離氨基酸含量除K1處理外較4℃處理分別增加了10.07%、21.59%、50.32%、7.01%，K2SO4處理苜蓿根頸的游離氨基酸含量較4℃處理分別增加了10.07%、6.40%、54.78%、82.69%、21.77%，說明-20℃處理下苜蓿根頸游離氨基酸含量增加；KCl的K2、K3和K4施肥量處理下的游離氨基酸含量顯著高于CK(P<0.05)，分別增加了39.87%、53.33%和9.80%；K2SO4肥在各施肥量處理下的游離氨基酸含量均顯著高于CK(P<0.05)，分別增加了19.61%、58.82%和86.27%和16.99%；K2SO4肥處理的游離氨基酸含量在各施肥量處理下均大于KCl處理下的游離氨基酸含量，說明施用鉀肥有利于增加苜蓿根頸中游離氨基酸含量，且K2SO4肥優(yōu)于KCl肥，施用量以150 kg·hm-2K2O時，苜蓿根頸中游離氨基酸含量最高。

表5 施用不同鉀肥苜蓿根頸在低溫處理下游離氨基酸含量的變化/(mg·g-1)Table 5 Changes of free amino acid content in root neck of alfalfa cultivated with different potassium fertilizers under low temperature treatment

2.6 不同鉀肥種類及用量對苜蓿根頸脯氨酸含量的影響

如表6所示，4℃處理苜蓿根頸的脯氨酸含量，KCl肥處理的脯氨酸含量在K2、K3和K4施肥量下顯著高于CK(P<0.05)，且在K3處理下達到最大值;K2SO4肥處理下的脯氨酸含量在K3和K4施肥量處理下顯著高于CK(P<0.05)，較CK分別增加了20.71%和11.90%。在-20℃低溫處理下，KCl肥處理苜蓿根頸的脯氨酸含量較4℃處理分別增加了18.10%、11.47%、3.09%、14.23%和1.71%，K2SO4肥處理苜蓿根頸的脯氨酸含量較4℃處理分別增加了18.10%、12.27%、29.67%、11.64%、3.40%，說明-20℃處理的苜蓿根頸脯氨酸含量增加；KCl肥的K3施肥量處理下的脯氨酸含量顯著高于CK(P<0.05)，增加了13.31%；K2SO4肥的K2和K3施肥量處理下的脯氨酸含量顯著高于CK(P<0.05)，分別增加了9.27%和14.11%；K2SO4肥處理的脯氨酸含量在各施肥量處理下均大于KCl肥處理下的脯氨酸含量。說明施用鉀肥有利于增加苜蓿根頸中脯氨酸含量，且K2SO4肥優(yōu)于KCl肥，施用量以K3施肥量處理的150 kg·hm-2K2O時，苜蓿根頸中脯氨酸含量最高。

表6 施用不同鉀肥苜蓿根頸在低溫處理下脯氨酸含量的變化/(μg·g-1)Table 6 Changes of proline content in root neck of alfalfa cultivated with different potassium fertilizers under low temperature treatment

2.7 苜蓿根頸相對電導(dǎo)率與含水量和含氮保護物質(zhì)含量的相關(guān)性

如表7所示，4℃處理下，自由水/束縛水與束縛水含量呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)，KCl肥處理下的自由水與束縛水含量、自由水/束縛水呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)；K2SO4肥處理的束縛水含量與脯氨酸含量呈顯著正相關(guān)(P<0.05)。如表8所示，-20℃低溫處理下，自由水/束縛水與束縛水含量呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)，與自由水含量呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)；KCl肥處理的相對電導(dǎo)率與脯氨酸含量呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)；自由水含量與束縛水含量呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)，與游離氨基酸含量呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)；束縛水含量與游離氨基酸、脯氨酸含量呈顯著正相關(guān)(P<0.05)。-20℃低溫處理下，K2SO4肥處理的相對電導(dǎo)率與游離氨基酸含量呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)，自由水含量與束縛水含量呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)，束縛水含量與游離氨基酸含量呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，游離氨基酸含量與脯氨酸含量呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)。說明苜蓿根頸束縛水含量、脯氨酸含量和游離氨基酸含量越高，相對電導(dǎo)率、自由水含量和自由水/束縛水越低，苜蓿細(xì)胞膜透性越低，苜?？购栽綇?。

表7 4℃處理下苜蓿根頸相對電導(dǎo)率與含水量和含氮保護物質(zhì)含量的相關(guān)性Table 7 Correlation between relative conductivity and water content and nitrogen-containing protective substance content in root neck of alfalfa under 4℃ treatment

表8 -20℃處理下苜蓿根頸相對電導(dǎo)率與含水量和含氮保護物質(zhì)含量的相關(guān)性Table 8 Correlation between relative conductivity and water content and nitrogen-containing protective substance content in root neck of alfalfa under -20℃ treatment

3 討 論

植物受到低溫脅迫時，細(xì)胞原生質(zhì)結(jié)構(gòu)會受到破壞，導(dǎo)致細(xì)胞膜透性增大，進而使電解質(zhì)外滲液增多，相對電導(dǎo)率增大，因此相對電導(dǎo)率是反映植物受傷害程度及抗寒性強弱的重要指標(biāo)之一[16-18]。

相對電導(dǎo)率越大，植物受傷害的程度越大。本研究結(jié)果表明，4℃低溫冷藏處理下苜蓿根頸相對電導(dǎo)率明顯低于-20℃冷凍處理。馬娟娟等[19]的研究結(jié)果表明，隨著低溫脅迫強度的增加，北美冬青新品種苗木相對電導(dǎo)率呈上升趨勢，與本研究結(jié)果一致；而-20℃低溫冷凍處理下，隨著施鉀量的增加，相對電導(dǎo)率降低，且在施用量為150 kg·hm-2K2O(K3)下最低，說明適量的鉀有利于減少電解質(zhì)外滲，與游明鴻等[20]的研究結(jié)果一致。

植物細(xì)胞中的水分以自由水和束縛水兩種狀態(tài)存在[21]，自由水含量高時，植物代謝旺盛，抗寒性弱[22],束縛水含量高時，植物細(xì)胞生命代謝緩慢,細(xì)胞原生質(zhì)粘稠性增加，冰點降低[12]。逆境條件下，植物自由水/束縛水降低，保水能力增強，維持細(xì)胞正常生命活動[23]。本研究結(jié)果表明，-20℃低溫冷凍下的自由水含量與4℃冷藏處理下的相比明顯降低，而束縛水含量明顯增加。曹健冉[24]的研究結(jié)果表明，越冬期間軟棗獼猴桃的自由水含量下降，束縛水含量有所上升，與本研究一致；而本研究中低溫冷凍處理下施用鉀肥可以顯著降低自由水含量，增加束縛水含量，說明適量的鉀肥有利于低溫脅迫下束縛水含量的增加及自由水含量的減少，從而增加細(xì)胞液濃度，降低水溶液冰點，提高苜?？购?，其中以K2SO4施用量為150 kg·hm-2K2O(K3)最有利于提高苜?？购?。

脯氨酸和游離氨基酸是植物體內(nèi)兩種重要的非結(jié)構(gòu)性含氮保護物質(zhì)，游離氨基酸既是蛋白質(zhì)分解的產(chǎn)物[25]，又是合成蛋白質(zhì)的原料，游離氨基酸含量一定程度上可以反映氮代謝的情況；脯氨酸作為水溶性最大的氨基酸[26]，因其有強大的保水能力，能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透勢[27]，當(dāng)植物受到逆境脅迫時，通常會積累大量脯氨酸。本研究結(jié)果表明，-20℃低溫冷凍處理下的游離氨基酸含量與4℃處理下的相比有增加的趨勢。朱愛民等[28]的研究表明，低溫脅迫下苜蓿根頸中游離氨基酸含量增加，與本研究結(jié)果一致；-20℃低溫冷凍處理下的游離氨基酸含量隨著施鉀量的增加有升高的趨勢，但過量的鉀又會使游離氨基酸含量下降，與程福皆等[13]的研究結(jié)果一致，可能的原因是，適量的鉀能促進植物對氮素的吸收[29]，進而使游離氨基酸含量增加。本研究結(jié)果表明，-20℃低溫冷凍處理下的脯氨酸含量隨著施鉀量的增加有升高的趨勢，并且明顯高于4℃處理下的脯氨酸含量，說明低溫脅迫會使脯氨酸含量增加，并且適量的鉀有利于脯氨酸的積累。研究表明施用150 kg·hm-2K2O的K2SO4最有利于提高苜?？购?，但過量的鉀又會起抑制作用，可能的原因是，植物體內(nèi)脯氨酸合成酶活性的增強和脯氨酸降解酶活性的降低會使脯氨酸含量增多，而鉀作為植物體內(nèi)多種酶的活化劑，過量的鉀會抑制脯氨酸合成酶的活性，促進脯氨酸降解酶活性的增強[30]，并且過量的鉀還會破壞細(xì)胞內(nèi)滲透勢的平衡，超出其自我調(diào)節(jié)能力，導(dǎo)致脯氨酸含量下降，其機理還有待進一步研究。

4 結(jié) 論

-20℃低溫冷凍處理下苜蓿根頸相對電導(dǎo)率、束縛水含量、游離氨基酸含量和脯氨酸含量較4℃冷藏處理下增加，自由水含量、自由水/束縛水降低；且K2SO4肥處理束縛水含量、游離氨基酸和脯氨酸含量均高于KCl肥處理，自由水/束縛水低于KCl肥處理，說明K2SO4肥優(yōu)于KCl肥；-20℃低溫冷凍處理下，施用量為150 kg·hm-2K2O的K2SO4肥最有利于提高苜?？购?。因此建議在科爾沁沙地進行苜蓿生產(chǎn)，秋季施用K2SO4肥料150 kg·hm-2K2O促進苜蓿安全越冬。