液相色譜特征圖譜用于草烏成分定量

蒙天琛，李鑫，隆海鳴

（哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，哈爾濱 150076）

草烏為毛茛科植物北烏頭（Aconitum kusnezoffii Reichb）的干燥塊根?！吨袊参镏尽穼ζ溆性敿?xì)記載，我國的草烏藥材資源十分豐富，大約有200 多個品種，在東北、河北省、內(nèi)蒙古、山西省等地區(qū)分布較為集中。草烏藥材的使用來源于古籍《神農(nóng)本草經(jīng)》，可以用于風(fēng)寒濕痹的治療等，已被廣泛應(yīng)用于臨床［1-9］。部分藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)烏頭類藥物、復(fù)方制劑都有消除炎癥、減輕疼痛和免疫抑制的作用。臨床上多用于治療各種各樣的痛癥，例如風(fēng)濕痹痛等［10-15］。分析草烏的組成成分更有利于它在制劑中被有效應(yīng)用。采用高效液相色譜（HPLC）法測定制草烏藥材中的生物堿已有報道，但針對不同產(chǎn)地的草烏特征圖譜以及指標(biāo)性成分的含量測定尚未有報道。

筆者采用HPLC 法建立10 批不同地區(qū)草烏藥材的高效液相指紋圖譜，對樣品進(jìn)行相似性對比分析，并比較其生物堿含量的異同，考察不同產(chǎn)地草烏之間的質(zhì)量差異，可以全面精確地為草烏藥材的質(zhì)量評價提供依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：Dionex UltiMate 3000 型，美國Dionex 公司。

超聲波清洗機：AS3120A 型，深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司。

電子天平：FA22048 型，感量為0.1 mg，上海精科天美科學(xué)儀器有限公司。

氨水、甲醇：均為色譜純。

新烏頭堿對照品：批號為wkq20031307，質(zhì)量分?jǐn)?shù)不小于98%，四川省維克奇生物科技有限公司。

烏頭堿對照品：批號為wkq20041408，質(zhì)量分?jǐn)?shù)不小于98%，四川省維克奇生物科技有限公司。

次烏頭堿對照品：批號為wkq20031308，含量不小于98%，四川省維克奇生物科技有限公司。

草烏樣品：10 批，經(jīng)哈爾濱商業(yè)大學(xué)金哲雄教授鑒定為毛茛科植物北烏頭（Aconitum kusnezoffii Reichb）的干燥塊根，藥材來源見表1。

表1 草烏樣品產(chǎn)地

實驗所用其它試劑均為分析純。

實驗用水為純凈水杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司。

1.2 色譜條件

色譜柱：WelchromC18柱（250mm×4.6mm，5μL，上海月旭科技有限公司）；流動相：甲醇–0.1%三乙胺水溶液（體積比為75∶25），流量為1mL/min；檢測波長：235 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣體積：20 μL。

1.3 溶液配制

新烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿對照品溶液：精密稱取適量的新烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿對照品，用甲醇配制成質(zhì)量濃度分別為1.04、1.14、1.04 mg/mL的對照品儲備液，分別取適量體積的新烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿對照品儲備液，配制成新烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿質(zhì)量濃度分別為52、28.5、26 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，冷藏備用。

草烏樣品溶液：精密稱取草烏粉末2.2 g，置于具塞錐形瓶中，加入35 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.04%的鹽酸水溶液，攪拌6 h，以4 000 r/min 轉(zhuǎn)速離心15 min，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的氨水將上層清液pH 調(diào)至10，再向其中加入20 mL 乙醚進(jìn)行萃取，取乙醚層，揮干乙醚，用甲醇溶解，并于25 mL 容量瓶中定容至標(biāo)線，經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜過濾。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

分別選擇色譜柱WelchromC18柱（250 mm×4.6 mm，5 μL）和Agilent HILIC 柱（100 mm×2.1 mm，2.7 μL），結(jié)果顯示前者對草烏樣品溶液中各成分的分離效果好，能實現(xiàn)主要色譜峰的分離且色譜峰信息較全。

考慮乙腈毒性問題，選擇常用流動相甲醇–水進(jìn)行考察，結(jié)果顯示基線穩(wěn)定，分離度良好。但色譜峰形因草烏中的生物堿存在色譜峰拖尾現(xiàn)象，所以在水相中加入0.1%三乙胺溶液調(diào)整色譜峰形。分別改變流動相中有機相和水相的體積比為85∶15、75∶25、65∶35，考察流動相中有機相和與水相的配比對色譜分離效果的影響。結(jié)果顯示在流動相中有機相和與水相的配比為75∶25 的條件下能夠顯示穩(wěn)定峰高的色譜峰且分離度理想，故選擇甲醇–0.1%三乙胺水溶液（75∶25）為流動相。

分別選擇進(jìn)樣體積為10、20 μL，考察進(jìn)樣體積對色譜分離效果的影響，結(jié)果顯示進(jìn)樣體積為10 μL 時色譜圖中未出現(xiàn)目標(biāo)色譜峰，故選擇進(jìn)樣體積為20 μL。

分別設(shè)定柱溫為20、30、40 ℃，考察不同柱溫條件下草烏樣品的色譜分離情況，結(jié)果顯示柱溫為30℃和40 ℃時色譜分離度較好，色譜峰寬較窄且基線穩(wěn)定?？紤]高溫對色譜柱的壽命影響，故選擇柱溫為30 ℃。

2.2 草烏HPLC 特征圖譜

2.2.1 色譜峰重復(fù)性

將草烏樣品溶液連續(xù)測定6 次，其10 個共有色譜峰的面積列于表2。由表2 可知，草烏樣品溶液其共有色譜峰面積測定值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于2%，說明色譜峰重復(fù)性良好。

表2 草烏樣品共有峰色譜峰重復(fù)性試驗結(jié)果

2.2.2 樣品穩(wěn)定性

制備草烏樣品溶液，分別放置0，2，4，8，12，24 h后進(jìn)樣測定，10 個共有色譜峰的面積列于表3。由表3 可知，草烏樣品溶液共有色譜峰面積均值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于2%，說明樣品溶液穩(wěn)定性良好。

表3 草烏樣品溶液穩(wěn)定性試驗結(jié)果

2.2.3 色譜峰重現(xiàn)性

按照1.3 方法制備得到6 個草烏樣品溶液，分別進(jìn)行測定，所得共有色譜峰面積列于表4。由表4 可知，草烏樣品溶液共有色譜峰面積測定值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于2%，表明樣品測定色譜峰重現(xiàn)性較好。

表4 草烏樣品共有峰色譜峰重現(xiàn)性試驗結(jié)果

2.2.4 特征峰鑒別

分別取新烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿混合標(biāo)準(zhǔn)溶液、草烏樣品溶液20 μL 進(jìn)行測定，色譜圖分別如圖1、圖2 所示。

圖1 新烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

圖2 草烏樣品溶液色譜圖

分別取10 個不同產(chǎn)地的草烏樣品，按照1.3 方法制備樣品溶液并進(jìn)行測定，用國家藥典委員會的“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A 版”對色譜圖進(jìn)行分析，以平均數(shù)法作為對照指紋圖譜的生成方法，參照草烏樣品溶液色譜圖，標(biāo)定了10 個共有峰，其中8、9、10 號峰分別為新烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿的特征峰，如圖3所示。將樣品與參照圖譜進(jìn)行比較，計算其指紋圖譜的相似度值，相關(guān)數(shù)據(jù)列于表5。由表5 可知：10 個草烏樣品的液相色譜圖與對照指紋圖譜的相似度平均值均大于0.90，表明10 個產(chǎn)地的草烏品質(zhì)均一。

表5 草烏樣品指紋圖譜相似度數(shù)據(jù)

圖3 10 個草烏樣品液相色譜圖

2.3 含量測定

2.3.1 線性關(guān)系

分別精密移取新烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿對照品溶液各0.05、2.0、5.0、8.0 mL 于10 mL 容量瓶中，用甲醇稀釋至標(biāo)線，搖勻，配制成分別含有新烏頭堿312.0、249.6、156.0、62.4、1.56 μg/mL，烏頭堿36.75、29.4、18.38、7.35、0.18 μg/mL，次烏頭堿26.0、20.8、13.0、5.2、0.13 μg/mL 的混合對照品溶液，經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜過濾后測定，以色譜峰面積為縱坐標(biāo)（Y）、質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）進(jìn)行線性回歸。新烏頭堿、烏頭堿和次烏頭堿的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)見表6。由表6 數(shù)據(jù)可知，3 種成分線性相關(guān)系數(shù)均大于0.999，表明線性關(guān)系良好，適于準(zhǔn)確定量。

表6 新烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿線性關(guān)系

2.3.2 重復(fù)性精密度

稱取6 份草烏藥材，按1.3 方法制備樣品溶液，進(jìn)樣測定色譜峰面積，計算測定均值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果列于表7。由表7 數(shù)據(jù)可知，各指標(biāo)成分色譜峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于2%，表明該方法的重復(fù)性精密度良好。

表7 重復(fù)性精密度試驗結(jié)果

2.3.3 重現(xiàn)性精密度

精密吸取草烏樣品溶液，利用本法在同日內(nèi)測定3 次，并且在3 天內(nèi)連續(xù)測定，計算日內(nèi)、日間色譜峰面積測量值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，試驗結(jié)果列于表8。由表8 數(shù)據(jù)可知，新烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿色譜峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于2%，表明方法的重現(xiàn)性精密度良好。

表8 重現(xiàn)性精密度試驗結(jié)果

2.4 加標(biāo)回收試驗

選取草烏藥材6 份，配制樣品溶液后測定其中新烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿的含量，分別向樣品中加入新烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿對照品適量，按照1.3 方法制備樣品溶液，測定3 種組分的色譜峰面積，計算加標(biāo)回收率，試驗結(jié)果列于表9。

表9 加標(biāo)回收試驗結(jié)果

由表9 可知，3 種成分平均加標(biāo)回收率為100.51%～100.66%，表明該方法測量準(zhǔn)確度較高。

2.5 樣品分析

取10 個不同產(chǎn)地的草烏粉末各約2.2 g，按1.3方法制備樣品溶液，測定新烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿的含量，實驗結(jié)果列于表10。由表10 數(shù)據(jù)可知，產(chǎn)地1 的草烏的生物堿含量最高為3.404 6 mg/g，其余產(chǎn)地草烏的生物堿含量較為接近，并且10 個產(chǎn)地的草烏符合《中國藥典》2020 年版關(guān)于草烏中生物堿總含量應(yīng)為1.5～7.5 mg/g 的規(guī)定。

表10 不同產(chǎn)地草烏生物堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定結(jié)果 mg/g

3 結(jié)語

采用HPLC 指紋圖譜方法標(biāo)定出草烏中的10個共有峰，指認(rèn)出3 個特征峰，對草烏原藥材進(jìn)行了指紋圖譜相似度評價，10 個草烏樣品的HPLC 色譜圖與對照指紋圖譜相似度平均值均大于0.90，表明其相似度較好。應(yīng)用所建方法測定了10 批不同產(chǎn)地的草烏中新烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿3 種成分的含量。所建立的HPLC 指紋圖譜方法精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性良好。對不同產(chǎn)地和來源的草烏樣品建立特征指紋圖譜，并進(jìn)行生物堿含量測定，有助于了解不同產(chǎn)地草烏之間的成分的相似性和差異，可以從一定程度上保證和控制一定區(qū)域內(nèi)的草烏療效和毒性。