外源營(yíng)養(yǎng)物對(duì)菌絲體生物質(zhì)材料的生長(zhǎng)研究及其性能表征

陳晨偉，丁 榕，彭柳城，謝 晶，楊福馨，楊新宇，于千惠

外源營(yíng)養(yǎng)物對(duì)菌絲體生物質(zhì)材料的生長(zhǎng)研究及其性能表征

陳晨偉1,2,3，丁 榕1，彭柳城1，謝 晶1,2,3※，楊福馨1,2,3，楊新宇1，于千惠1

（1. 上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306； 2. 上海冷鏈設(shè)備性能與節(jié)能專業(yè)技術(shù)服務(wù)平臺(tái)，上海 201306；3. 國(guó)家食品科學(xué)與工程試驗(yàn)教學(xué)示范中心（上海海洋大學(xué)），上海 201306）

為優(yōu)化菌絲體生物質(zhì)材料配方和成品性能，該研究以菌絲生長(zhǎng)速率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，首先通過(guò)單因素試驗(yàn)篩選出較佳外源營(yíng)養(yǎng)物。再利用Plackett-Burman試驗(yàn)確定了影響平菇菌絲生長(zhǎng)的主要因素為葡萄糖、酵母粉和KH2PO4，通過(guò)最陡爬坡試驗(yàn)和Box-Behnken響應(yīng)面分析對(duì)添加物進(jìn)行分析，得到較佳外源營(yíng)養(yǎng)物組合為：質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4.7%葡萄糖、1%酵母粉和0.3%磷酸二氫鉀。最后比較了未添加和添加外源營(yíng)養(yǎng)物制得的菌絲體材料結(jié)構(gòu)與性能，結(jié)果表明：與未添加組相比，添加外源營(yíng)養(yǎng)物制得的菌絲體材料，其菌絲粗壯且相對(duì)致密，菌絲直徑增加了460 nm；復(fù)合材料壓縮強(qiáng)度為114 kPa，較未添加對(duì)照組提升了43.7%，說(shuō)明外源營(yíng)養(yǎng)物的添加促進(jìn)了平菇菌絲的生長(zhǎng)，提高了菌絲體材料的強(qiáng)度和回彈性。研究結(jié)果為菌絲體生物質(zhì)材料的制備及其性能優(yōu)化提供參考。

可降解材料；優(yōu)化；菌絲體材料；外源營(yíng)養(yǎng)物；響應(yīng)面分析法；農(nóng)業(yè)廢棄物

0 引 言

2020年全球塑料產(chǎn)量已經(jīng)達(dá)到3.67億t[1]，而2020年全球生物可降解塑料的產(chǎn)能僅有120萬(wàn)t左右，不可降解塑料使用的嚴(yán)重后果之一就是不可逆的環(huán)境污染[2-3]。因此，開(kāi)發(fā)綠色可降解材料刻不容緩。近年來(lái)，菌絲體材料作為一種新型綠色材料越來(lái)越引起關(guān)注[4]，它是一種將真菌與農(nóng)業(yè)廢棄物結(jié)合制造的可降解多孔材料，不僅所有原料完全可降解，而且可以循環(huán)利用農(nóng)業(yè)廢棄物，大大減少了環(huán)境污染[5]。

菌絲體材料概念最先由Bayer和McIntyre在2007年提出[6]，而該領(lǐng)域的研究最早是Holt制得菌絲體并在包裝上應(yīng)用[7]。菌絲體材料主要是利用真菌菌絲在基質(zhì)中的生長(zhǎng)特性，類似粘合劑去固定木屑、棉籽殼和秸稈等農(nóng)業(yè)廢棄物基質(zhì)材料，從而得到具有一定強(qiáng)度的生物質(zhì)材料，可用作包裝、保溫、隔音等領(lǐng)域[8-9]。目前，國(guó)內(nèi)外有關(guān)菌絲體材料的研究日益增多。Wimmers等[10]篩選不同真菌與不同木材以挑選出最佳的木材菌絲體材料組合來(lái)生產(chǎn)隔熱板。Elsacker 等[11]研究不同類型農(nóng)業(yè)廢棄物和不同加工方式對(duì)菌絲體材料性能影響，發(fā)現(xiàn)最終材料性能與基質(zhì)顆粒大小和加工方式有關(guān)。 Ziegler等[12]使用不同基質(zhì)-真菌組合，以棉花廢料為芯材，纖維織物為表面，將真菌接種在纖維表面來(lái)制備菌絲體材料。閆微等[13]利用靈芝菌種與木竹碎屑制備菌絲體材料，發(fā)現(xiàn)果樹(shù)碎料適合靈芝生長(zhǎng)，復(fù)合材料擁有良好的保溫性能。吳豪等[14]比較了幾種真菌生長(zhǎng)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，平菇真菌與棉籽殼結(jié)合生長(zhǎng)得到的復(fù)合材料性能較佳，可以替代發(fā)泡聚苯乙烯。尚舒等[15]使用平菇真菌與農(nóng)業(yè)廢棄物結(jié)合，得到的菌絲體材料防水性能良好且緩沖性能優(yōu)于發(fā)泡聚乙烯。盡管如此，菌絲體材料仍是一個(gè)較新的研究領(lǐng)域，材料性能與菌種類型、基質(zhì)配方、制備工藝等諸多因素有關(guān)，值得進(jìn)一步探究。結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)與預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，制備菌絲體材料的首要問(wèn)題是解決菌絲在基質(zhì)材料中長(zhǎng)勢(shì)問(wèn)題，因?yàn)榫z在材料中充當(dāng)粘結(jié)劑作用，菌絲生長(zhǎng)程度決定了菌絲材料性能好壞[16]。因此，在制備菌絲體材料中如何促進(jìn)菌絲生長(zhǎng)是關(guān)鍵問(wèn)題所在。

在傳統(tǒng)食用菌產(chǎn)業(yè)中，可以通過(guò)添加外源營(yíng)養(yǎng)物來(lái)促進(jìn)菌絲及子實(shí)體生長(zhǎng)[17]。通過(guò)預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，外源營(yíng)養(yǎng)物的添加在制備菌絲體材料時(shí)也有助于菌絲的生長(zhǎng)。因此，本文主要研究外源營(yíng)養(yǎng)物對(duì)菌絲體材料的生長(zhǎng)特性及其性能的影響。以木屑、棉籽殼等農(nóng)業(yè)廢棄物為基質(zhì)材料，首先通過(guò)單因素試驗(yàn)對(duì)平菇菌絲在基質(zhì)中生長(zhǎng)的較適碳/氮源、無(wú)機(jī)鹽等外源營(yíng)養(yǎng)物及其添加量進(jìn)行篩選，再利用響應(yīng)面法對(duì)適合平菇菌絲在基質(zhì)上生長(zhǎng)的外源營(yíng)養(yǎng)物進(jìn)行優(yōu)化，以獲得較佳外源營(yíng)養(yǎng)物添加配方，最后比較未添加和添加外源營(yíng)養(yǎng)物制得的菌絲體材料結(jié)構(gòu)與性能，旨在為菌絲體生物質(zhì)材料的制備及其性能優(yōu)化提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

平菇菌株，購(gòu)于江蘇天達(dá)食用菌研究所；木屑粉末（質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為75%綜纖維素、23%木質(zhì)素）、玉米芯粉末（質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為72%綜纖維素、18%木質(zhì)素）、麥麩粉末（質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為非淀粉多糖46%，蛋白質(zhì)14%）購(gòu)于東?？h白塔埠鎮(zhèn)長(zhǎng)遠(yuǎn)秸稈加工廠；棉籽殼（質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為54%綜纖維素、26%木質(zhì)素）購(gòu)于德州食用菌研究所。將棉籽殼放入多功能粉碎機(jī)中粉碎并過(guò)直徑為 19 cm的10目篩得到棉籽殼顆粒。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基是由木屑、棉籽殼、玉米芯、麥麩、石灰和石膏按照一定配比組成。碳源選擇為纖維素、玉米淀粉、葡萄糖、木質(zhì)素，購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；氮源選擇為酵母粉、氯化銨（NH4Cl）、磷酸二氫銨（NH4H2PO4），購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；無(wú)機(jī)鹽選擇硫酸鎂（MgSO4）、磷酸二氫鉀（KH2PO4），購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；生長(zhǎng)激素選擇為三十烷醇、萘乙酸、赤霉素，購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；活化培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基，購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

生長(zhǎng)培養(yǎng)基：為了觀察和測(cè)量菌絲生長(zhǎng)直徑，將基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的粉狀農(nóng)業(yè)廢棄物與瓊脂粉混合制備成生長(zhǎng)培養(yǎng)基，具體組成為：質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%基礎(chǔ)培養(yǎng)基、1.5%瓊脂粉、93.5%蒸餾水?？瞻捉M無(wú)任何營(yíng)養(yǎng)源添加的生長(zhǎng)培養(yǎng)基上菌絲體生長(zhǎng)速率為（5.62±1.3）mm/d。

試驗(yàn)儀器與設(shè)備：10目標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)篩，SZ-A3002分析天平（蘇州博泰偉業(yè)電子科技有限公司），VS-1300L-U超凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司），GX-ZGF101恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海賀德試驗(yàn)設(shè)備有限公司），BPS-50CH恒溫恒濕箱（上海一恒科技有限公司）ZY-150F反壓高溫蒸煮鍋（浙江新豐醫(yī)療器械有限公司），SU-500掃描電鏡（日本日立公司），DDL-100電子萬(wàn)能試驗(yàn)機(jī)（長(zhǎng)春機(jī)械科學(xué)研究院有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 菌種活化

在無(wú)菌超凈臺(tái)中，將平菇菌種轉(zhuǎn)接到PDA培養(yǎng)基上，置于25℃、90%相對(duì)濕度下培養(yǎng)10 d，挑選菌絲茂密、無(wú)雜菌污染的菌種備用。

1.2.2 碳、氮源種類及添加量篩選

在前期預(yù)試驗(yàn)研究的基礎(chǔ)上，在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中分別添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)的3%纖維素、葡萄糖、玉米淀粉、木質(zhì)素和質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%的酵母粉、NH4Cl、NH4H2PO4，設(shè)置3個(gè)平行組，在121℃，103.4 kPa條件下滅菌15 min，在無(wú)菌條件下，在PDA培養(yǎng)基中打孔取直徑5 mm菌塊接種于培養(yǎng)基中，置于25℃、90%相對(duì)濕度恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 d，每隔2 d測(cè)一次菌落直徑。

將篩選到的碳源以質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%、2%、3%、4%、5%添加量進(jìn)行篩選；將篩選到的氮源以質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%添加量進(jìn)行篩選。每組3個(gè)平行，置于25℃、90%相對(duì)濕度恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 d，每隔2 d測(cè)一次菌落直徑。

1.2.3 無(wú)機(jī)鹽及生長(zhǎng)激素添加量篩選

以MgSO4和KH2PO4為無(wú)機(jī)鹽，添加量為質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%；以三十烷醇、萘乙酸和赤霉素為生長(zhǎng)激素，添加量為質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%、1.0%、1.5%、2.0%。無(wú)機(jī)鹽和生長(zhǎng)激素的篩選試驗(yàn)都是在添加了質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%葡萄糖、質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%酵母粉的生長(zhǎng)培養(yǎng)基上進(jìn)行。每組3個(gè)平行，置于25℃、90%相對(duì)濕度恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 d，每隔2 d測(cè)一次菌落直徑。

1.2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化培養(yǎng)基

1）Plackett-Burman（PB）試驗(yàn)：根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果挑選出影響菌絲生長(zhǎng)的7個(gè)因素，每個(gè)因素取高低水平，響應(yīng)值為菌絲生長(zhǎng)速率，根據(jù)軟件分析結(jié)果確定影響菌絲生長(zhǎng)關(guān)鍵因素，PB試驗(yàn)方案如表1所示。

表1 PB試驗(yàn)中各因素及水平

注：%表示添加量，下同。

Note: % means addition, the same below.

2）最陡爬坡試驗(yàn)：根據(jù)PB試驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)最陡爬坡試驗(yàn)，確定因素的爬坡方向和步長(zhǎng)，快速逼近最大響應(yīng)區(qū)域。

3）Box-Behnken試驗(yàn)：根據(jù)最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果確定的中心點(diǎn)，設(shè)置三因素三水平試驗(yàn)，試驗(yàn)次數(shù)=17，對(duì)影響菌絲生長(zhǎng)的外源營(yíng)養(yǎng)物添加量進(jìn)行優(yōu)化。

1.2.5 根據(jù)響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果制備菌絲體生物質(zhì)材料

按照響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果的配比將外源營(yíng)養(yǎng)物添加到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，再與蒸餾水按一定比例均勻混合；高溫滅菌，滅菌條件：溫度115℃、壓力103.4 kPa和時(shí)間 15 min；冷卻至室溫后，在超凈臺(tái)中與平菇菌種接種，在恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d后，在70℃烘箱中干燥48 h得到菌絲體材料。同時(shí)對(duì)照組為未添加外源營(yíng)養(yǎng)物的菌絲體材料，因10 d培養(yǎng)時(shí)間復(fù)合材料無(wú)法成型，故對(duì)照組生長(zhǎng)時(shí)間為20 d。菌絲體生物質(zhì)材料制備方法如圖1所示。

1.0%質(zhì)量分?jǐn)?shù)三十烷醇、1.5%質(zhì)量分?jǐn)?shù)赤霉素和1.0%質(zhì)量分?jǐn)?shù)萘乙酸對(duì)菌絲生長(zhǎng)速率促進(jìn)效果良好。生長(zhǎng)激素具有誘導(dǎo)細(xì)胞分裂、促進(jìn)菌絲體呼吸的作用，提高細(xì)胞內(nèi)蛋白酶、脂肪酶和核酸酶的活性，從而促進(jìn)了平菇菌絲體生長(zhǎng)[25]。因此，適宜的無(wú)機(jī)鹽和生長(zhǎng)激素質(zhì)量分?jǐn)?shù)添加量為：0.15%MgSO4、0.10%KH2PO4、1.0%三十烷醇、1.5%赤霉素和1.0%萘乙酸。

圖1 菌絲體生物質(zhì)材料制備流程圖

1.3 菌絲體材料性能測(cè)試

1.3.1 掃描電鏡

使用掃描電鏡對(duì)菌絲體材料微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察。拍攝前，取5 mm×5 mm左右大小干燥樣品噴射鍍金后，使用掃描電鏡在10 kV加速電壓下進(jìn)行拍攝。用ImageJ軟件對(duì)拍攝照片進(jìn)行分析[18]。

1.3.2 壓縮強(qiáng)度

菌絲體材料在電子萬(wàn)能試驗(yàn)機(jī)上進(jìn)行壓縮試驗(yàn)。壓縮強(qiáng)度根據(jù)GB/T8813-2020 《硬質(zhì)泡沫塑料壓縮性能的測(cè)定》中方法A測(cè)試，以（12±3）mm/min 速度進(jìn)行壓縮。壓縮強(qiáng)度σ（kPa）計(jì)算公式為

式中F為相對(duì)形變?yōu)?0%時(shí)的最大壓縮力，N；0為試樣初始橫截面積，mm2。

1.3.3 回彈率

菌絲體材料回彈性能通過(guò)電子萬(wàn)能試驗(yàn)機(jī)測(cè)得。壓板以（12±3）mm/min速度沿材料厚度方向增加載荷，當(dāng)應(yīng)變?yōu)?0%時(shí)停止加載并保持3 min，卸載后靜置10 s測(cè)得樣品厚度，計(jì)算回彈率[19]?；貜椔使綖?/p>

式中為回彈率，%；T為樣品壓縮前厚度，mm；T為樣品回彈后厚度，mm。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用Design Expert.11軟件進(jìn)行PB試驗(yàn)和Box-Behnken試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析；使用SPSS 20軟件進(jìn)行方差分析，通過(guò)Duncan的極差檢驗(yàn)5%的顯著性水平；使用ImageJ軟件進(jìn)行掃描電鏡分析；使用Origin 2018軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 碳、氮源種類及添加量篩選

表2是單因素碳、氮源及添加量的篩選結(jié)果。平菇菌種可以利用不同碳、氮源進(jìn)行生長(zhǎng)，但效果有顯著差異（＜0.05）。在不同碳源種類中，菌絲體生長(zhǎng)速率最快是葡萄糖，最慢是木質(zhì)素，其主要原因是平菇可以很好利用單糖，而對(duì)于纖維素、淀粉和木質(zhì)素的利用是先要經(jīng)過(guò)酶降解為單糖再利用，所以菌絲利用葡萄糖效率快且高[20]；在不同氮源種類中，菌絲體生長(zhǎng)速率最快是酵母粉，最慢是NH4H2PO4。這表明平菇利用有機(jī)氮的效率高于無(wú)機(jī)氮，可能是因?yàn)橛袡C(jī)氮中含有多肽、氨基酸、B族維生素及微量元素，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富[21]，且含有的碳元素也可以被當(dāng)做碳源使用，會(huì)雙重刺激菌種的生長(zhǎng)，而無(wú)機(jī)氮源成分單一，不能提供菌絲合成蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)的必需元素[22]。因此，選擇葡萄糖和酵母粉分別作為較適碳、氮源。

當(dāng)葡萄糖添加量為1%～5%時(shí)，菌絲生長(zhǎng)速率隨著添加量增加先增加后降低，在葡萄糖添加量為4%時(shí)，菌絲生長(zhǎng)速率最快（＜0.05）。隨著酵母粉添加量的增加，菌絲生長(zhǎng)速率也表現(xiàn)為先增加后降低，在添加量為0.5%時(shí)生長(zhǎng)速率最大（＜0.05）。因此，葡萄糖和酵母粉的較適添加量為4%和0.5%質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

表2 碳、氮源種類及添加量篩選結(jié)果

注：同類同列字母不同表示差異顯著（<0.05）。

Note: different letters in the same column and same type indicate significant differences (<0.05).

2.2 無(wú)機(jī)鹽及生長(zhǎng)激素篩選

圖2為不同無(wú)機(jī)鹽和生長(zhǎng)激素添加量對(duì)菌絲生長(zhǎng)速率的影響。圖2a表明0.15% 添加量MgSO4和0.10%添加量 KH2PO4對(duì)菌絲生長(zhǎng)促進(jìn)作用最大（＜0.05）。這歸因于細(xì)胞活動(dòng)中無(wú)機(jī)鹽離子是必不可少的，Mg2+對(duì)許多酶系的活化起到重要作用，而K+參加了營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)向細(xì)胞中運(yùn)輸活動(dòng)[23]。但總體來(lái)看，不同無(wú)機(jī)鹽對(duì)菌絲生長(zhǎng)促進(jìn)作用不明顯，其主要原因可能是菌絲生長(zhǎng)對(duì)無(wú)機(jī)鹽需求是微量的，且碳、氮源中可能含有一定量無(wú)機(jī)鹽，所以在不同添加量之間差異更為明顯，在不同種類之間不明顯[24]。

2.3 PB試驗(yàn)結(jié)果

PB試驗(yàn)結(jié)果表3。表3顯示菌絲生長(zhǎng)速率在6.41～9.19 mm/d，對(duì)表3數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析，結(jié)果見(jiàn)表4。對(duì)菌絲生長(zhǎng)速率影響極為顯著（＜0.05）的有葡萄糖、酵母粉，影響顯著（0.05＜＜0.10）的有KH2PO4，其余因素影響不顯著。因此，這3個(gè)因素是構(gòu)建響應(yīng)面模型的主要影響因子。

注：相同種類上標(biāo)不同字母表示生長(zhǎng)速率差異顯著（P＜0.05），下同。

表3 菌絲生長(zhǎng)速率PB試驗(yàn)結(jié)果

表4 菌絲生長(zhǎng)速率PB試驗(yàn)因素及顯著性分析

注：“*”差異顯著，0.05＜＜0.1，“**”差異極為顯著，＜0.05，下同。

Note: “*” significant difference, 0.05＜< 0.1, “**” very significant difference,<0.05. The same below.

2.4 最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果

由PB試驗(yàn)可知，葡萄糖、酵母粉和KH2PO4對(duì)菌絲生長(zhǎng)速率為正效應(yīng)，意味著隨著添加量增加，菌絲生長(zhǎng)速率提高，因此最陡爬坡試驗(yàn)中各因素取值增加，試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表5。結(jié)果表明第3組的菌絲生長(zhǎng)速率 最大，所以將該組的葡萄糖（4.5%）、酵母粉（0.9%）和KH2PO4（0.3%）添加量作為響應(yīng)面試驗(yàn)分析的中心點(diǎn)。

2.5 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果及分析

2.5.1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

使用BBD試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)菌絲生長(zhǎng)速率的3個(gè)顯著影響因子：葡萄糖、酵母粉和KH2PO4進(jìn)行3因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，表6為中心組合設(shè)計(jì)因素及水平。以菌絲生長(zhǎng)速率為響應(yīng)值進(jìn)行分析，具體試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表7。

表5 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表6 Box-Behnken中心組合因素及水平

表7 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

2.5.2 響應(yīng)面分析及優(yōu)化

利用Design Expert 11軟件對(duì)表7的數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到二次多項(xiàng)回歸模型方程為：=10.11+0.805+ 0.43–0.495+0.015+0.235+0.125–0.8872– 0.7972–1.152，方差分析見(jiàn)表8。由表8可知，模型極顯著（＜0.000 1），決定系數(shù)2=0.987 9，修正決定系數(shù)A=0.972 2表明建立的回歸方程有較好的擬合性，其中、、、、2、2、2極顯著，而失擬項(xiàng)＞0.05，說(shuō)明差異不顯著，意味著殘差均由隨機(jī)誤差引起，表明模型擬合度好、可信度高，可以用來(lái)分析菌絲生長(zhǎng)速率的變化。

圖3的等高線呈橢圓形，三維立體圖坡度較大，說(shuō)明（葡萄糖）和（KH2PO4）之間交互作用顯著[26-27]。此外，從圖中可以看出，當(dāng)其中一個(gè)因素固定時(shí)，菌絲生長(zhǎng)速率隨著另外一個(gè)因素增加呈先增加后減少的趨勢(shì)。

表8 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果及分析

圖3 葡萄糖和KH2PO4交互影響菌絲生長(zhǎng)速率的響應(yīng)面圖

通過(guò)對(duì)回歸模型的分析可知，影響平菇菌絲生長(zhǎng)速率的外源添加物優(yōu)化配比為：質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4.718%葡萄糖、0.952%酵母粉、0.284%KH2PO4，在此條件下，菌絲生長(zhǎng)速率為10.378 mm/d。為檢驗(yàn)響應(yīng)面結(jié)果的準(zhǔn)確性，考慮到實(shí)際配比，將上述配比修正為質(zhì)量分?jǐn)?shù)4.7%葡萄糖、1%酵母粉、0.3%KH2PO4，在實(shí)際條件下進(jìn)行5組平行試驗(yàn)，得到平菇菌絲生長(zhǎng)速率為(10.28±0.11)mm/d，與模型預(yù)測(cè)值接近，說(shuō)明該試驗(yàn)?zāi)Ｐ途哂休^好的精度和可靠性。試驗(yàn)結(jié)果相較于未添加營(yíng)養(yǎng)源組生長(zhǎng)速率(5.62±1.3)mm/d提高82.9%，說(shuō)明該試驗(yàn)可以加速菌絲體生物質(zhì)材料的生長(zhǎng)周期。

2.6 菌絲體材料性能表征

2.6.1 掃描電鏡觀察微觀結(jié)構(gòu)

菌絲體材料微觀結(jié)構(gòu)如圖4所示。圖4a和圖4d為 對(duì)照組和營(yíng)養(yǎng)組的菌絲體材料外觀照片。從外觀看，菌絲體材料整體呈白色，對(duì)照組材料可以看見(jiàn)內(nèi)部棕黃色基質(zhì)，說(shuō)明菌絲生長(zhǎng)數(shù)量不足以完全包裹基質(zhì)，而營(yíng)養(yǎng)組表面完全被菌絲體覆蓋，質(zhì)感類似泡沫。圖4c展示了菌絲體生長(zhǎng)附著在基質(zhì)上，因?yàn)榫z體可以產(chǎn)生纖維素酶、木質(zhì)素過(guò)氧化物酶和漆酶等[28]來(lái)降解基質(zhì)而獲得營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，部分菌絲可以穿透基質(zhì)使基質(zhì)互相粘結(jié)，形成更緊密的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。圖4f展現(xiàn)了在生長(zhǎng)后期，菌絲聚集交織在一起，孔隙逐漸縮小，菌絲體表面轉(zhuǎn)變?yōu)轭愃票∧そY(jié)構(gòu)，這樣的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)提供了材料良好的防水性能，也有利于提高菌絲體材料的整體壓縮強(qiáng)度。通過(guò)圖4b和圖4e的微觀結(jié)構(gòu)圖對(duì)比看出，對(duì)照組菌絲體材料相對(duì)疏松，菌絲之間孔隙大且多，而營(yíng)養(yǎng)組菌絲體材料相對(duì)致密，菌絲互相糾纏、扭結(jié)，菌絲之間孔隙小且少，幾個(gè)纖細(xì)的菌絲體集合成更大的菌絲體，形成了密集的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。利用ImageJ軟件分析對(duì)照組和營(yíng)養(yǎng)組菌絲纖維直徑，對(duì)照組平菇菌絲直徑在300～3 000 nm，平均直徑為 1 270 nm，而營(yíng)養(yǎng)組平菇菌絲直徑在300～6 000 nm，平均直徑為1 730 nm，添加了營(yíng)養(yǎng)源的平菇菌絲平均直徑增粗了 460 nm，并且營(yíng)養(yǎng)組生長(zhǎng)周期（10 d）僅為對(duì)照組（20 d）的一半，表明營(yíng)養(yǎng)物組菌絲生長(zhǎng)不僅粗壯且更快速。

2.6.2 力學(xué)性能

對(duì)照組和營(yíng)養(yǎng)組菌絲體材料的密度均在240～260 kg/m3范圍之間。添加營(yíng)養(yǎng)物的材料壓縮強(qiáng)度為114 kPa，這相當(dāng)于密度為20 kg/m3的EPS板的壓縮強(qiáng)度[29]，相比對(duì)照組材料的壓縮強(qiáng)度（79.3 kPa）提高了43.7%（＜0.05）。營(yíng)養(yǎng)組材料回彈率為61.4%，相較對(duì)照組（55.3%）有所增加（＜0.05）。有研究表明，菌絲體細(xì)胞壁中幾丁質(zhì)為材料提供了機(jī)械強(qiáng)度，因?yàn)閹锥≠|(zhì)可以聚集成纖維，在壓縮過(guò)程中支撐材料的結(jié)構(gòu)以減少裂縫形成[30]，而菌絲體中蛋白質(zhì)和脂質(zhì)可用作增塑劑以提高材料的回彈性[31]。結(jié)合掃描電鏡結(jié)果分析可知，菌絲體材料力學(xué)性能的提高歸因于添加營(yíng)養(yǎng)物后，菌絲生長(zhǎng)發(fā)育良好，菌絲體材料的表面和內(nèi)部孔隙中充滿菌絲，大量菌絲體包裹基質(zhì)，從而提供了復(fù)合材料良好的回彈性和壓縮強(qiáng)度。

3 結(jié) 論

本文以農(nóng)業(yè)廢棄物為基質(zhì)，利用平菇菌絲的生長(zhǎng)特性制得菌絲體生物質(zhì)材料。以菌絲生長(zhǎng)速率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，首先通過(guò)單因素試驗(yàn)篩選出適宜碳源（葡萄糖4%）和氮源（酵母粉0.5%），接著通過(guò)PB試驗(yàn)確定影響平菇菌絲生長(zhǎng)速率的關(guān)鍵因素，并由最陡爬坡試驗(yàn)確定最佳響應(yīng)區(qū)域，然后根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)，利用Design-Expert軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析，獲得了較優(yōu)外源添加物參數(shù)，最后比較了對(duì)照組和營(yíng)養(yǎng)組材料的結(jié)構(gòu)與性能，得到如下主要結(jié)論：

1）影響平菇菌絲生長(zhǎng)的主要外源營(yíng)養(yǎng)物為葡萄糖、酵母粉和KH2PO4，外源營(yíng)養(yǎng)物較佳組合：質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4.7%葡萄糖、1%酵母粉、0.3% KH2PO4，得到菌絲體生長(zhǎng)速率為10.28 mm/d，相較于對(duì)照組提高了82.9%，為菌絲體材料的快速制備提供了基礎(chǔ)。

2）對(duì)照組和營(yíng)養(yǎng)組的材料結(jié)構(gòu)與性能對(duì)比表明：與對(duì)照組相比，營(yíng)養(yǎng)組材料中菌絲粗壯且相對(duì)致密，菌絲平均直徑從1 270 nm增粗到1 730 nm；菌絲體材料的壓縮強(qiáng)度和回彈率分別從對(duì)照組的79.3 kPa和55.3%提高到114 kPa和61.4%，證明了外源營(yíng)養(yǎng)物的加入促進(jìn)了平菇菌絲的生長(zhǎng)，提高了菌絲體材料的強(qiáng)度和回彈性，為菌絲體生物質(zhì)材料的制備及其性能優(yōu)化提供參考。

[1] 朱亞凱，蔡文彬. 可降解塑料產(chǎn)業(yè)發(fā)展概述[J]. 塑料包裝，2021，31(3)：19-21.

Zhu Yakai, Cai Wenbin.Development of degradable plastics industry[J]. Plastics Packaging, 2021, 31(3): 19-21. (in Chinese with English abstract)

[2] Shen M, Song B, Zeng G, et al. Are biodegradable plastics a promising solution to solve the global plastic pollution?[J]. Environmental Pollution, 2020, 263: 114469.

[3] Rhodes C J. Plastic pollution and potential solutions[J]. Science Progress, 2018, 101(3): 207-260.

[4] Karana E, Blauwhoff D, Hultink E J, et al. When the material grows: A case study on designing (with) mycelium-based materials[J]. International Journal of Design, 2018, 12(2): 119-136.

[5] Elsacker E, Vandelook S, Van Wylick A, et al. A comprehensive framework for the production of mycelium-based lignocellulosic composites[J]. Science of the Total Environment, 2020, 725: 138431.

[6] Bayer E and McIntyre G. Method for producing rapidly renewable chitinous material using fungal fruiting bodies and product made thereby. U.S. Patent Application: US2009/0307969 A1[P]. 2009-12-17.

[7] Holt G A, McIntyre G, Flagg D, et al. Fungal mycelium and cotton plant materials in the manufacture of biodegradable molded packaging material: Evaluation study of select blends of cotton byproducts[J]. Journal of Biobased Materials and Bioenergy, 2012, 6(4):431-439.

[8] Jones M, Mautner A, Luenco S, et al.Engineered mycelium composite construction materials from fungal biorefineries: A critical review[J]. Materials and Design, 2020, 187:108397.

[9] Bruscato C, Malvessi E, Brandalise R N, et al. High performance of macrofungi in the production of mycelium-based biofoams using sawdust — sustainable technology for waste reduction[J]. Journal of Cleaner Production, 2019, 234: 225-232.

[10] Wimmers G, Klick J, Tackaberry L, et al. Fundamental studies for designing insulation panels from wood shavings and filamentous fungi[J]. BioResources, 2019, 14(3): 5506-5520.

[11] Elsacker E, Vandelook S, Brancart J, et al. Mechanical, physical and chemical characterisation of mycelium-based composites with different types of lignocellulosic substrates[J]. PLoS One, 2019, 14(7): e0213954.

[12] Ziegler A R, Bajwa S G, Holt G A, et al. Evaluation of physico-mechanical properties of mycelium reinforced green biocomposites made from cellulosic fibers[J]. Applied Engineering in Agriculture, 2016, 32(6): 931-938.

[13] 閆微，史田田，李少博，等. 木竹碎料/菌絲體原位成型材料的性能[J]. 木材科學(xué)與技術(shù)，2021，35(4)：57-63 .

Yan Wei, Shi Tiantian, Li Shaobo, et al.Properties of in-situ molding composites made of wood/bamboo splinter and mycelium[J]. Chinese Journal of Wood Science and Technology, 2021, 35(4): 57-63 . (in Chinese with English abstract)

[14] 吳豪，趙鵬，章琦，等. 基于菌絲體的緩沖包裝材料制備及性能研究[J]. 浙江科技學(xué)院學(xué)報(bào)，2015，27(1)：22-27.

Wu Hao, Zhao Peng, Zhang Qi, et al.Preparation and production of cushion packing material based on mycelium[J]. Journal of Zhejaing University of Science and Technology, 2015, 27(1): 22-27. (in Chinese with English abstract)

[15] 尚舒，牛宏震，林理量，等. 食用菌制全降解包裝材料的研究[J]. 云南化工，2015，42(6)：23-27.

Shang Shu, Niu Hongzhen, Lin Liliang, et al.Research on fully degradable packaging materials made from edible fungi[J]. Yunnan Chemical Technology, 2015, 42(6): 23-27. (in Chinese with English abstract)

[16] Appels F V W, Dijksterhuis J, Lukasiewicz C E, et al. Hydrophobin gene deletion and environmental growth conditions impact mechanical properties of mycelium by affecting the density of the material[J]. Scientific Reports, 2018, 8(1): 1-7.

[17] 裴海生，孫君社，王民敬，等. 木質(zhì)素對(duì)靈芝菌絲體生長(zhǎng)的影響[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2017，33(6): 309-314.

Pei Haisheng, Sun Junshe, Wang Minjing, et al. Effect of lignin on growth of Ganoderma lucidum[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2017, 33(6): 309-314. (in Chinese with English abstract)

[18] Joshi K, Meher M K, Poluri K M. Fabrication and characterization of bioblocks from agricultural waste using fungal mycelium for renewable and sustainable applications[J]. ACS Applied Bio Materials, 2020, 3(4): 1884-1892.

[19] 侯佳希. 真菌菌絲/玉米秸稈基多孔復(fù)合材料的制備[D]. 長(zhǎng)春：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，2020.

Hou Xijia.Preparation of Fungal Mycelium /Corn Straw Porous Composite Material[D]. Changchun: Jilin Agricultural University, 2020. (in Chinese with English abstract)

[20] 安琪，吳雪君，吳冰，等.不同碳源和氮源對(duì)金針菇降解木質(zhì)纖維素酶活性的影響[J]. 菌物學(xué)報(bào)，2015，34(4)：761-771. An Qi, Wu Xuejun, Wu Bing, et al. Effects of carbon and nitrogen sources on lignocellulose decomposition enzyme activities in flammulina velutipes[J]. Mycosystema, 2015, 34(4): 761-771. (in Chinese with English abstract)

[21] Vieira E F, Carvalho J, Pinto E, et al.Nutritive value, antioxidant activity and phenolic compounds profile of brewer's spent yeast extract [J].Journal of Food Composition and Analysis,2016,52:44-51.

[22] 孫瑞澤，張耀玲，王勝寶，等. 一株野生側(cè)耳菌種鑒定及生物學(xué)特性[J]. 安徽農(nóng)學(xué)通報(bào)，2019，25(9)：34-37.

Sun Ruize, Zhang Yaoling, Wang Shengbao, et al.Identification and biological characteristics of a wild pleurotus[J]. Anhui Agricultural Science Bulletin, 2019, 25(9): 34-37. (in Chinese with English abstract)

[23] Gadd G M.Fungi, rocks, and minerals [J].Elements, 2017, 13(3): 171-176.

[24] 范可章，陳靈，張振，等. 平菇菌種液體培養(yǎng)質(zhì)量的影響因素分析[J]. 中國(guó)食用菌，2015，34(4)：21-24，30.

Fan Kezhang,Chen Ling,Zhang Zhen,et al. Analysis of influencing factors on the quality of oyster mushroom’s hypha in liquid culture medium[J]. Edible Fungi of China, 2015, 34(4): 21-24，30. (in Chinese with English abstract)

[25] 倪騰鳳，陶文文，梁兵，等. 植物激素對(duì)平菇菌絲生長(zhǎng)及酶活性的影響[J]. 資源開(kāi)發(fā)與市場(chǎng)，2011，27(10)：871-873.

Ni Tengfeng, Tao Wenwen, Liang Bin，et al. Influences of auxin on growth of pleurtus ostreatus and enzyme activity[J]. Resource Development & Market, 2011,27(10): 871-873. (in Chinese with English abstract)

[26] 曾志恒，程翊，曾輝，等. 響應(yīng)面法優(yōu)化雙孢蘑菇菌株W38液體菌種培養(yǎng)的研究[J]. 福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2017，32(2): 161-166. Zeng Zhiheng, Cheng Yi, Zeng Hui, et al. Optimizatin by response surface metrology for agaricus bisporus W38 fermentation in liquid medium[J]. Fujian Journal of Agriculture, 2017, 32(2): 161-166. (in Chinese with English abstract)

[27] 張譽(yù)薺，許永華，文湘穗，等. 響應(yīng)面法優(yōu)化北五味子褐斑病內(nèi)生生防真菌淡紫擬青霉WG9發(fā)酵工藝及發(fā)酵產(chǎn)物穩(wěn)定性研究[J]. 菌物學(xué)報(bào)，2021，40(6)：1561-1574.

Zhang Yuqi, Xu Yonghua, Wen Xiangsui, et al. Response surface methodology for optimizing fermentation process of the endophytic fungus purpureocillium lilacinum WG9 preventing schisandra chinensis brown spot disease[J]. Mycosystema, 2021, 40(6): 1561-1574. (in Chinese with English abstract)

[28] Hoa H T, Wang C L. The effects of temperature and nutritional conditions on mycelium growth of two oyster mushrooms (pleurotus ostreatus and pleurotus cystidiosus)[J]. Mycobiology, 2015, 43(1): 14-23.

[29] Castiglioni A, Castellani L, Cuder G, et al.Relevant materials parameters in cushioning for EPS foams[J]. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects, 2017, 534: 71-77.

[30] Teixeira J L, Matos M P, Nascimento B L, et al. Production and mechanical evaluation of biodegradable composites by white rot fungi[J]. Ciência e Agrotecnologia, 2018, 42: 676-684.

[31] Haneef M, Ceseracciu L, Canale C, et al. Advanced materials from fungal mycelium: Fabrication and tuning of physical properties[J]. Scientific Reports, 2017, 7: 41292.

Effects of exogenous nutrients on the growth of mycelial biomass materials and its characterization

Chen Chenwei1,2,3, Ding Rong1, Peng Liucheng1, Xie Jing1,2,3※, Yang Fuxin1,2,3, Yang Xinyu1, Yu Qianhui1

(1.201306,; 2.201306;3.201306)

Biodegradable materials have been drawn great attention to reduce carbon emissions under the concept of carbon neutrality and serious environmental pollution. A mycelium material has been widely developed as a new type of green biomass for these requirements. A completely degradable porous material can be prepared as follows. Some agricultural wastes (rich in cellulose, hemicellulose, and lignin, and mycelium) are degraded to penetrate or wrap the substrate for better binder function. As such, the nutrients of mycelium can be obtained by secreting cellulase, lignin peroxidase, and laccase. Therefore, it is very necessary to clarify the mycelial growth during preparation, in order to obtain a mycelial material with excellent performance. In this study, exogenous nutrients were added to promote mycelial growth in the process of traditional edible fungus culture. The mycelial growth rate was also taken as the response index. The best exogenous nutrients were first screened out using a single factor experiment. Then, a Plackett-Burman experiment was used to determine the main influencing factors on the growth ofsuch as glucose, yeast powder, and KH2PO4. The steepest climbing test and Box-Behnken response surface method (RSM) were also used to obtain the best combination of exogenous nutrients. The results showed that the glucose, yeast powder, and potassium dihydrogen phosphate presented a significant effect on the growth rate of mycelium. Specifically, the model determination coefficient was 0.987 9, and the correction determination coefficient was 0.972 2, indicating an excellent performance and high reliability of the model. An optimal combination of parameters was also achieved, where 4.7% mass fraction glucose, 1% mass fraction yeast powder, and 0.3% mass fraction KH2PO4. The experiment showed that the average growth rate of mycelium was 10.28 mm/d, which was consistent with the predicted value. In addition, the structure and properties of mycelial materials were characterized in the control and nutrient groups. It was found that there was no significant difference in the density between 240-260 kg/m3. However, the Scanning Electron Microscope (SEM) images showed that the morphology of mycelium material with exogenous nutrients presented dense and tangled with each other, where the pores between the hyphae were reduced, compared with the control group. The shape was also the dense hyphal membrane structure in the nutrition group. Specifically, the average diameter of the hyphae in the nutrition group (1 730 nm) increased by 460 nm, compared with the control group (1 270 nm). The compression strength of the material in the nutrition group was 114 kPa, which increased by 43.7% over that in the control group. In terms of rebound rate, the material in the nutrition group (61.4%) was also slightly higher than that in the control group (55.3%). The mechanical properties demonstrated that the addition of exogenous nutrients promoted the growth ofmycelium, whereas, the increase in silk led to the increase in the strength and resilience of mycelial material. This finding can also provide a strong reference for the preparation and properties optimization of mycelial biomass materials.

degradable materials; optimization; mycelial materials; exogenous nutrients; response surface analysis; agricultural waste

10.11975/j.issn.1002-6819.2021.21.034

S216.2

A

1002-6819(2021)-21-0295-08

陳晨偉，丁榕，彭柳城，等. 外源營(yíng)養(yǎng)物對(duì)菌絲體生物質(zhì)材料的生長(zhǎng)研究及其性能表征[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2021，37(21)：295-302.doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2021.21.034 http://www.tcsae.org

Chen Chenwei, Ding Rong, Peng Liucheng, et al. Effects of exogenous nutrients on the growth of mycelial biomass materials and its characterization[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2021, 37(21): 295-302. (in Chinese with English abstract) doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2021.21.034 http://www.tcsae.org

2021-08-25

2021-10-10

國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系資助（CARS-47）；國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2018YFD0400701）；上海市科委公共服務(wù)平臺(tái)建設(shè)項(xiàng)目（19DZ2284000）；上海市大學(xué)生創(chuàng)新項(xiàng)目（S202110264033）

陳晨偉，副教授，研究方向?yàn)榭山到獍b材料、食品包裝與保鮮。Email：cwchen@shou.edu.cn

謝晶，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)槭称繁ｕr、食品包裝。Email：jxie@shou.edu.cn