顱內(nèi)動(dòng)脈瘤組織中Septin4 的表達(dá)及其通過(guò)調(diào)節(jié)自噬對(duì)人腦血管平滑肌細(xì)胞的作用研究

楊明環(huán)，張波，鄧愛(ài)平，張力，曹剛

[1.十堰市太和醫(yī)院(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院),湖北 十堰 442000；2.珠海市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院(南方醫(yī)科大學(xué)附屬珠海醫(yī)院)腦外科，廣東 珠海 519000]

顱內(nèi)動(dòng)脈瘤(intracranial aneurysm，IA)是一種嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，生存率低，預(yù)后差[1]。IA是由血管畸形引起的，在全世界范圍內(nèi)患病率為3.2%。除了先天性因素外，后天性因素如吸煙、高血壓和過(guò)度飲酒等其他因素也有助于IA的形成和發(fā)展[2]。IA由于其高發(fā)病率，高致殘、致死率的特點(diǎn)，一直以來(lái)備受人們的關(guān)注。血管細(xì)胞功能障礙、血管壁退行性改變、炎癥和免疫反應(yīng)等內(nèi)在因素也在IA的發(fā)生中起重要作用[3]。血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)的表型調(diào)控與IA的破裂和形成有關(guān)[4]。Septin4是Septins家族的一個(gè)亞型，具有GTPase活性，有多個(gè)剪接體。Septin4是細(xì)胞骨架的重要組成部分，參與許多重要的生理過(guò)程，如細(xì)胞運(yùn)輸和凋亡[5]。最近的研究[6]表明，Septin4通過(guò)調(diào)節(jié)人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化調(diào)控動(dòng)脈粥樣硬化疾病進(jìn)展。目前，關(guān)于Septin4在IA中的作用及其可能的作用機(jī)制尚不明確。因此，本研究以IA和人腦血管平滑肌細(xì)胞(human brain vascular smooth muscle cells，HBVSMCs)為研究對(duì)象，旨在探究Septin4在IA中的表達(dá)，及對(duì)HBVSMCs表型轉(zhuǎn)化的作用及其可能的作用機(jī)制，以期為探明IA的發(fā)病機(jī)制及開(kāi)發(fā)新的臨床治療策略提供新的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 組織樣本

選取2017年1月至2018年3月行開(kāi)顱動(dòng)脈瘤夾閉術(shù)切除的32份IA組織樣本，患者中男21例，女11例，年齡37～69歲，平均(49.69±8.26)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：數(shù)字減影血管造影、CT血管成像確診為IA患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)有高血壓、糖尿病、腫瘤等病史者；(2)就診前接受動(dòng)脈瘤夾閉手術(shù)或血管治療者；(3)有顱內(nèi)多發(fā)動(dòng)脈瘤者。此外，收集同期行顱內(nèi)血腫清除術(shù)或內(nèi)減壓術(shù)的顱腦外傷患者的正常顱動(dòng)脈組織32份，患者中男18例，女14例，年齡27～63歲，平均(43.38±10.09)歲。IA患者與正常顱動(dòng)脈患者性別、年齡等一般情況比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 主要材料與試劑

原代HBVSMCs購(gòu)自上海信裕生物科技有限公司；平滑肌22α(SM22α)和平滑肌α肌動(dòng)蛋白(αSMA)抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；Lipofectamine2000TM轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒購(gòu)自日本TAKARA公司；過(guò)表達(dá)Septin4載體(簡(jiǎn)稱(chēng)Septin4)及其陰性對(duì)照(NC)、Septin4 si-RNA干擾序列(si-Septin4-1和si-Septin4-2)及其陰性對(duì)照(si-NC)購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司；Septin4、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)2、MMP9、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(LC3)、sequestosome 1(p62)和磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)抗體購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶[p-AMPK(Thr172)]、腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)、磷酸化哺乳動(dòng)物類(lèi)雷帕霉素靶蛋白[p-mTOR(Ser2448)]和哺乳動(dòng)物類(lèi)雷帕霉素靶蛋白(mTOR)抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technologies公司。

1.3 免疫組化檢測(cè)Septin4蛋白表達(dá)

臨床標(biāo)本用4%多聚甲醛固定72 h，梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋、切片。常規(guī)脫蠟至水，3% H2O2避光孵育15 min，PBS清洗后5%BSA避光孵育1 h，Septin4一抗稀釋液(1∶400)4 ℃孵育過(guò)夜。二抗稀釋液(1∶200)避光孵育1 h。DAB顯色液顯色，蘇木素染液染色5 min。自來(lái)水沖洗，1%鹽酸酒精溶液分化10 s,0.2%氨水做返藍(lán)處理8 s，自來(lái)水沖洗后切片進(jìn)行脫水、透明處理，中性樹(shù)膠封片，光學(xué)顯微鏡觀(guān)察分析。

1.4 免疫熒光染色檢測(cè)SM22α和αSMA表達(dá)

石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，3%H2O2避光孵育15 min，PBS清洗后5%BSA避光孵育1 h。SM22α(1∶400)和αSMA(1∶200)抗體4 ℃孵育過(guò)夜。熒光標(biāo)記二抗(1∶200)避光孵育30 min，DAPI室溫染核20 min。防熒光淬滅劑封片，熒光顯微鏡觀(guān)察。

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)

HBVSMCs用含10% FBS的DEMD(高糖)培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%時(shí)，0.25%胰酶液消化細(xì)胞，按1∶3比例傳代培養(yǎng)。

1.6 細(xì)胞分組與轉(zhuǎn)染

將HBVSMCs按4×105個(gè)·孔-1密度接種于6孔板，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后將細(xì)胞隨機(jī)分為空白對(duì)照組(NC組)、si-NC組、si-Septin4-1組、si-Septin4-2組，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)，按照Lipofectamine2000TM說(shuō)明書(shū)進(jìn)行si-NC、si-Septin4-1和si-Septin4-2的轉(zhuǎn)染。另外，將細(xì)胞隨機(jī)分為NC組、Septin4組、si-NC組和si-Septin4組，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)，按照Lipofectamine2000TM說(shuō)明書(shū)進(jìn)行NC、Septin4、si-NC和si-Septin4(干擾效率最高的si-Septin4)的轉(zhuǎn)染。37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)48 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.7 RT- PCR檢測(cè)Septin4 mRNA表達(dá)

收集臨床標(biāo)本或轉(zhuǎn)染后的HBVSMCs，Trizol法提取細(xì)胞總RNA，測(cè)定RNA濃度，將RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。按照SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行RT-PCR實(shí)驗(yàn)。反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40個(gè)循環(huán)。Septin4以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算其mRNA表達(dá)。Septin4上游引物5′-CAGATCTGCTTGGGTAGATCC-3′，下游引物5′-CTCGTTCATATCGTGAGTGATGG-3′；GAPDH上游引物5′-ATCCACGGGAGAGCGACAT-3′，下游引物5′-CAGCTGCTTGTAAAGTGGAC-3′。

1.8 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)蛋白表達(dá)

收集臨床標(biāo)本或轉(zhuǎn)染后的HBVSMCs，RIPA裂解液裂解外泌體或細(xì)胞，取上清，BCA法測(cè)定蛋白濃度。取30 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分離，隨后將膠中的蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上。10%脫脂奶粉室溫封閉3 h，Septin4(1∶2 500)、αSMA(1∶1 000)、SM22α(1∶2 000)、MMP2(1∶5 000)、MMP9(1∶5 000)、LC3(1∶2 000)、p62(1∶1 000)、p-AMPK(1∶2 000)、AMPK(1∶1 000)、p-mTOR(1∶1 000)、mTOR(1∶1 000)和GAPDH(1∶5 000)4 ℃孵育過(guò)夜，HRP標(biāo)記二抗(1∶5 000)室溫孵育1 h。ECL發(fā)光液顯色，暗室曝光。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，檢測(cè)所得數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用單因素方差分析，若組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義則采用LSD(L)檢驗(yàn)，以雙側(cè)P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 IA組織和正常顱動(dòng)脈組織中Septin4表達(dá)水平的比較

免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示，與正常顱動(dòng)脈組織相比，IA組織中Septin4陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯降低(P<0.05)(表1、圖1A)；RT-PCR和蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)結(jié)果顯示，與正常顱動(dòng)脈組織相比，IA組織中Septin4 mRNA和蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)(表1，圖1B、C)。

表1 兩組免疫組化檢測(cè)結(jié)果比較

2.2 IA組織和正常顱動(dòng)脈組織中SM22α和αSMA蛋白表達(dá)水平的比較

免疫熒光染色結(jié)果顯示，與正常顱動(dòng)脈組織相比，IA組織中SM22α和αSMA熒光強(qiáng)度明顯降低(P<0.05)(表2)。

a與正常顱動(dòng)脈組織比較，P<0.05

表2 兩組免疫熒光染色結(jié)果比較 AU

2.3 si- RNA沉默Septin4的效率檢測(cè)

RT-PCR和蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)結(jié)果顯示，與si-NC組相比，si-Septin4-1組和si-Septin4-2組細(xì)胞Septin4的mRNA和蛋白表達(dá)均明顯降低(P<0.05)(表3、圖2)，其中si-Septin4-2組細(xì)胞變化更為明顯，因此選取si-Septin4-2進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，簡(jiǎn)稱(chēng)為si-Septin4。

表3 不同si-RNA沉默Septin4效率的比較

2.4 Septin4對(duì)HBVSMCs表型轉(zhuǎn)化的影響

RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與NC組相比，過(guò)表達(dá)Septin4組細(xì)胞中Septin4 mRNA表達(dá)明顯升高(P<0.05)；與si-NC組相比，si-Septin4組細(xì)胞中Septin4 mRNA表達(dá)明顯降低(P<0.05)(表4、圖3A)。蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)結(jié)果顯示，與NC組相比，過(guò)表達(dá)Septin4組細(xì)胞中Septin4、αSMA和SM22α蛋白表達(dá)明顯升高αSMA和SM22α蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)，MMP2和MMP9蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05)(表5、圖3B、C)。

表5 4組 αSMA、SM22α、MMP2和MMP9的蛋白表達(dá)結(jié)果比較

a與si-NC組比較，P<0.05

表4 4組HBVSMCs表型轉(zhuǎn)化的結(jié)果比較

2.5 Septin4對(duì)HBVSMCs細(xì)胞自噬的影響

蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)結(jié)果顯示，與NC組相比，Septin4組細(xì)胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)，p62蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05)；與si-NC組相比，si-Septin4組細(xì)胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05)，p62蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)(表6、圖4)。

2.6 Septin4對(duì)AMPK/mTOR信號(hào)通路的影響

蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)結(jié)果顯示，與NC組相比，Septin4組細(xì)胞中p-AMPK/AMPK蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)，p-mTOR /mTOR蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05)；與si-NC組相比，si-Septin4組細(xì)胞中p-AMPK/AMPK蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05)，p-mTOR /mTOR蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)(表7、圖5)。

3 討 論

IA是由顱內(nèi)動(dòng)脈壁的病理性局部擴(kuò)張形成的腫瘤樣突起。IA的破裂是蛛網(wǎng)膜下腔出血的主要原因，其發(fā)病率和死亡率較高[7]。到目前為止，IA的確切發(fā)病機(jī)制仍不清楚。VSMCs具有可塑性高和收縮功能強(qiáng)的特點(diǎn)。在病理?xiàng)l件下，它可以從具有收縮功能的分化表型轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂休^強(qiáng)增殖和遷移能力的去分化表型。VSMCs通過(guò)表型調(diào)節(jié)參與IA形成、發(fā)展和破裂的發(fā)病機(jī)理[8]。因此，本研究旨在探究Septin4對(duì)HBVSMCs表型轉(zhuǎn)化的影響及其可能的作用機(jī)制，以期為IA確切發(fā)病機(jī)制的探明及治療提供新的科學(xué)依據(jù)。

VSMCs是血管壁中主要的細(xì)胞類(lèi)型，具有多種功能。VSMCs有收縮型和合成型兩種不同的類(lèi)型。收縮表型的標(biāo)志物包括SM22α、αSMA、平滑肌肌球蛋白重鏈(SM myosin heavy chain，MHC)、h1-calponin和smoollin，合成型的標(biāo)志物有MMPs[9]。在炎癥和氧化應(yīng)激等病理刺激下，收縮表型的VSMCs可以轉(zhuǎn)化為合成型，SM22α和αSMA等表達(dá)下調(diào)，MMPs以及其他炎癥介質(zhì)的表達(dá)上調(diào)。VSMCs失去收縮能力，但有助于促炎細(xì)胞的募集和血管壁細(xì)胞外基質(zhì)的重塑[10]。VSMCs表型調(diào)控與IA的形成、生長(zhǎng)和破裂有關(guān)。氧化應(yīng)激可以誘導(dǎo)表型轉(zhuǎn)換的VSMCs刺激促炎過(guò)程、細(xì)胞外基質(zhì)重塑和壁細(xì)胞凋亡，最終促進(jìn)IA的形成和破裂[11]。Septins除了具有胞質(zhì)分裂的作用和絲形成能力外，還參與膜動(dòng)力學(xué)、細(xì)胞骨架重建、囊泡運(yùn)輸和腫瘤發(fā)生等生物學(xué)進(jìn)程[12]。已有研究表明，Septin4參與調(diào)控VSMCs表型轉(zhuǎn)化[6]，該研究結(jié)果提示，Septin4可能在IA疾病進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果顯示，IA組織中SM22α和αSMA表達(dá)下調(diào)，提示IA組織中VSMCs向合成型表型轉(zhuǎn)化，此外IA組織中Septin4表達(dá)下調(diào)。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)Septin4可上調(diào)SM22α和αSMA表達(dá)，下調(diào)MMP2和MMP9表達(dá)，而干擾Septin4后則表現(xiàn)相反變化，該結(jié)果表明，Septin4可促進(jìn)HBVSMCs向收縮型表型轉(zhuǎn)化。

a與NC組比較，P<0.05；b與si-NC組比較，P<0.05

a與NC組比較，P<0.05；b與si-NC組比較，P<0.05

細(xì)胞自噬被認(rèn)為是調(diào)控VSMCs表型轉(zhuǎn)換的機(jī)制之一[13]。激活細(xì)胞自噬可促進(jìn)VSMCs由收縮表型轉(zhuǎn)化為合成表型，從而參與IA的發(fā)生發(fā)展[14]。研究表明，IA組織中miR-4735表達(dá)下調(diào)，過(guò)表達(dá)miR-4735通過(guò)靶向HIF-1α抑制HIF-1α介導(dǎo)的自噬，抑制VSMCs遷移和侵襲，從而抑制IA疾病進(jìn)展[15]。已有研究[16]表明，Septin4可抑制VSMCs向合成型表型轉(zhuǎn)化和細(xì)胞自噬。本研究結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)Septin4可上調(diào)自噬相關(guān)蛋白p62蛋白表達(dá)，抑制LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表達(dá)，而干擾Septin4后則表現(xiàn)相反作用。結(jié)果表明，Septin4可通過(guò)抑制自噬在IA中發(fā)揮保護(hù)作用。AMPK/mTOR信號(hào)通路是復(fù)雜信號(hào)網(wǎng)絡(luò)中介導(dǎo)自噬的經(jīng)典途徑。mTOR 是一個(gè)自噬的負(fù)性調(diào)節(jié)因子，mTOR磷酸化會(huì)抑制自噬起始分子ULK1功能。此外，AMPK可通過(guò)抑制mTOR活化、磷酸化ULK1激活其活性，從而促進(jìn)自噬的發(fā)生[17]。研究[18]表明，激活VSMCs中AMPK/mTOR/ULK1信號(hào)通路可激活自噬，最后誘導(dǎo)VSMCs表型轉(zhuǎn)化。本研究結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)Septin4可抑制AMPK磷酸化，促進(jìn)mTOR磷酸化，而干擾Septin4則表現(xiàn)出相反變化。結(jié)果表明，Septin4可能通過(guò)調(diào)節(jié)AMPK/mTOR信號(hào)通路抑制自噬，在VSMCs中發(fā)揮重要作用。

a與NC組比較，P<0.05；b與si-NC組比較，P<0.05

綜上所述，本研究結(jié)果表明Septin4在IA中低表達(dá)，其可能通過(guò)AMPK/mTOR信號(hào)通路抑制自噬和HBVSMCs向合成表型轉(zhuǎn)化，阻滯IA疾病進(jìn)程。該研究結(jié)果為進(jìn)一步明確Septin4在IA中的作用，及開(kāi)發(fā)新的臨床治療策略提供了科學(xué)依據(jù)。