妊娠期糖尿病孕婦血清miRNA-137表達(dá)與新生兒高膽紅素血癥的關(guān)系研究

董小菡，王亮，杜曉琴，于文亮，高迎春

(電子科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬綿陽(yáng)醫(yī)院·綿陽(yáng)市中心醫(yī)院 婦產(chǎn)科，四川 綿陽(yáng) 621000)

妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus，GDM)是一種常見的妊娠期疾病，對(duì)母親和新生兒都會(huì)造成較高的并發(fā)癥風(fēng)險(xiǎn)，例如新生兒高膽紅素血癥[1]。修正的Pedersen 假說(shuō)提出，母體的高糖環(huán)境易過(guò)度刺激胎兒胰腺 b 細(xì)胞，加速有氧代謝，增加胎兒的需氧量。但同時(shí)高糖環(huán)境又進(jìn)一步減少母胎供氧量，從而造成胎兒相對(duì)缺氧的狀態(tài)[2-3]。這可能是導(dǎo)致新生兒發(fā)生高膽紅素血癥的重要生理機(jī)制之一。GDM的發(fā)病原因十分復(fù)雜，其中微小RNA(microRNA，miRNAs)在其中的作用不容忽視。Peng等[4]通過(guò)多項(xiàng)研究證實(shí)miR-137表達(dá)上調(diào)與GDM 誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙有關(guān)，而且下調(diào) miR-137可以保護(hù)人類胚胎免受高糖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷；此外Chen等[5]通過(guò)小鼠實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miR-137是結(jié)構(gòu)性雄烷受體(constitutive androstane receptor,CAR)的抑制因子，因此是膽紅素清除率的關(guān)鍵性決定因素，并有望成為治療新生兒高膽紅素血癥的潛在分子靶點(diǎn)。我們?cè)谇捌陬A(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)miR-137不僅在GDM孕婦的胎盤組織中有異常表達(dá)，而且也穩(wěn)定存在于孕婦的血液循環(huán)中。因此本研究旨在檢測(cè)GDM孕婦孕晚期血清 miR-137的表達(dá)，并探討其是否有望成為新生兒高膽紅素血癥潛在的預(yù)測(cè)指標(biāo)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2018年6月至2019年6月入院的73例GDM孕婦[年齡22～44歲，平均(31.62±5.03)歲]作為GDM組。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合美國(guó)糖尿病協(xié)會(huì)最新制定的GDM診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]，在孕24～28周完成口服葡萄糖耐量試驗(yàn)(oral glucose tolerance test，OGTT)，空腹血糖≥5.1 mmol·L-1，1 h血糖≥10.0 mmol·L-1或2 h血糖≥8.5 mmol·L-1，被診斷為GDM；分娩孕周37～42周；自然受孕；單胎妊娠。排除標(biāo)準(zhǔn)：有溝通障礙或嚴(yán)重精神疾病者；有惡性腫瘤或嚴(yán)重心臟、肺、肝、腎及其他功能障礙者；妊娠前合并有糖尿病、高血壓或內(nèi)分泌和代謝疾病史者；合并妊娠期高血壓、妊娠期甲減、子癇前期等其他妊娠期合并癥者。另外將新生兒宮內(nèi)死亡或死胎者(缺少新生兒膽紅素或葡萄糖測(cè)量數(shù)據(jù))、產(chǎn)檢或產(chǎn)后數(shù)據(jù)記錄缺失、由已知溶血因素造成的高膽紅素血癥(如猴同種免疫接種和ABO血型不相容)者排除在本研究外。另外選擇80例年齡、分娩孕周相匹配[年齡20～45歲，平均(30.49±5.33)歲]、妊娠期無(wú)GDM的孕婦作為對(duì)照組。本研究獲得我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。在參與者簽署同意書后獲取其孕24～28周血清樣本以及分娩后新鮮的胎盤組織樣本。根據(jù)新生兒經(jīng)皮膽紅素監(jiān)測(cè)和血清總膽紅素(serum total bilirubin，TSB)檢測(cè)結(jié)果，將GDM組分為高膽紅素血癥組(n=23)，其診斷符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)兒科學(xué)分會(huì)新生兒學(xué)組相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]：出生后7 d每日7：30進(jìn)行經(jīng)皮膽紅素監(jiān)測(cè)，黃疸指數(shù)分別為出生24 h內(nèi)>6，24 h 后足月兒>12.9、早產(chǎn)兒>15；在出生時(shí)、光療前測(cè)定血清總膽紅素水平，以出生 24 h 內(nèi) >102 μmol·L-1，24 h后足月兒>220.6 μmol·L-1、早產(chǎn)兒>255 μmol·L-1作為診斷新生兒高膽紅素血癥的診斷標(biāo)準(zhǔn)；不符合上述高膽紅素血癥診斷標(biāo)準(zhǔn)的新生兒納入非高膽紅素血癥組(n=50)。

1.2 孕婦血清和胎盤組織中miR- 137的測(cè)定

收集孕24～28周的肘部靜脈血液樣本，留取血清，保存在血液樣本庫(kù)中用作后續(xù)的生物學(xué)分析。另外在分娩時(shí)留取新鮮的胎盤組織樣本，置于液氮中24 h 后，更換到-80 ℃保存?zhèn)溆?。在提取總RNA前，將血清樣本復(fù)溶。用Trizol試劑提取總RNA，提取后鑒定RNA濃度及純度，確保可以用于后續(xù)樣品檢測(cè)。再用miRNA first-strand cDNA試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，使用miRcute miRNA qPCR檢測(cè)試劑盒中的試劑、各0.5 μl上下游引物、1 μl cDNA樣本配制15 μl PCR反應(yīng)體系，用7300型熱循環(huán)儀進(jìn)行反應(yīng)，以小分子U6snRNA作為內(nèi)參，2-ΔΔCt法計(jì)算miR-137相對(duì)表達(dá)量。試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司。miR-137上游引物：5′-ATA GAG CGG CCA TTT GGA TT-3′，miR-137下游引物：5′-TCA AGG CCT TTC AGT CGT TC-3′。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 GDM組和對(duì)照組一般資料的比較

GDM組孕婦產(chǎn)前空腹血糖、新生兒出生身高以及Apgar 5 min評(píng)分<7分的新生兒比例顯著高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；兩組孕婦年齡、體重指數(shù)、吸煙史、家族糖尿病史、收縮壓、舒張壓、胎兒分娩孕周、出生體重、出生頭圍、生產(chǎn)方式等差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 GDM組和對(duì)照組一般資料的比較

2.2 GDM組和對(duì)照組孕婦血清及胎盤組織miR- 137表達(dá)水平的比較

與對(duì)照組比較，GDM組血清、胎盤組織miR-137表達(dá)水平顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。Pearson相關(guān)分析顯示，GDM組孕婦血清和胎盤組織中miR-137表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.623，P<0.05)，見圖1。

表2 GDM組和對(duì)照組孕婦血清和胎盤組織中miR-137表達(dá)水平的比較[M50(P25，P75)]

圖1 GDM組孕婦血清和胎盤組織中miR-137表達(dá)的相關(guān)性

2.3 GDM組孕婦血清miR- 137表達(dá)水平與新生兒高膽紅素血癥的關(guān)系

GDM組有23例新生兒發(fā)生高膽紅素血癥，高膽紅素血癥組孕婦血清miR-137表達(dá)水平高于非高膽紅素血癥組(2.12±0.79vs.1.13±0.31)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Pearson相關(guān)分析顯示，GDM組孕婦血清miR-137表達(dá)水平與新生兒血清膽紅素水平呈正相關(guān)(r=0.378，P<0.05)，見圖2。

圖2 GDM組孕婦血清miR-137表達(dá)水平與新生兒血清膽紅素水平的關(guān)系

2.4 新生兒發(fā)生高膽紅素血癥的影響因素

以新生兒是否發(fā)生高膽紅素血癥為因變量，進(jìn)行單因素和多因素Logistic回歸分析，結(jié)果顯示，孕婦吸煙史、巨大兒、新生兒Apgar 5 min評(píng)分<7分、孕婦血清miR-137水平升高都是影響新生兒高膽紅素血癥的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，見表3。

表3 單因素和多因素Logistic回歸分析新生兒發(fā)生高膽紅素血癥的影響因素

2.5 ROC曲線分析GDM孕婦血清miR- 137水平對(duì)新生兒高膽紅素血癥的預(yù)測(cè)價(jià)值

GDM孕婦血清miR-137水平預(yù)測(cè)新生兒高膽紅素血癥的曲線下面積(AUC)為0.904(0.825,0.983)，截?cái)嘀?.685，在該截?cái)嘀迪蚂`敏度為0.739，特異度為0.947，見圖3。

圖3 GDM孕婦血清miR-137水平預(yù)測(cè)新生兒高膽紅素血癥的ROC曲線

3 討 論

GDM是一種常見的妊娠期疾病，對(duì)母親和新生兒都會(huì)造成較高的并發(fā)癥風(fēng)險(xiǎn)，例如肥胖、糖代謝紊亂、心血管疾病等[8]。新生兒高膽紅素血癥是GDM常見的并發(fā)癥之一[9]。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)，診斷時(shí)孕婦血清miR-137水平升高、孕婦吸煙史、巨大兒以及新生兒出生時(shí)Apgar 5 min評(píng)分<7分都是GDM組發(fā)生新生兒高膽紅素血癥的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，尤其是檢測(cè)孕婦血清miR-137表達(dá)水平對(duì)于預(yù)測(cè)新生兒高膽紅素血癥發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)有一定的指導(dǎo)意義。

目前關(guān)于篩查GDM孕婦發(fā)生新生兒高膽紅素血癥的危險(xiǎn)因素研究相對(duì)較少。最近Thevarajah等[10]學(xué)者開展的一項(xiàng)單中心大樣本臨床調(diào)查研究結(jié)果顯示，診斷時(shí)較低的胎齡、多胎妊娠、子癇前期、巨大兒等都與高膽紅素血癥的發(fā)生獨(dú)立相關(guān)(P<0.05)。之前Langer[11]進(jìn)行臨床研究發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)治療的GDM孕婦的新生兒低血糖和高膽紅素血癥發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)較健康對(duì)照組孕婦增加2～4倍。根據(jù)修正的Pedersen 假說(shuō)，在母體高血糖情況下，母胎葡萄糖濃度梯度落差較大，葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1載體可將母體血清中過(guò)量的葡萄糖轉(zhuǎn)移至胎盤，通過(guò)過(guò)度刺激胎兒胰腺 b 細(xì)胞，進(jìn)而產(chǎn)生高胰島素血癥的胎兒環(huán)境。而這種高胰島素血癥環(huán)境可刺激有氧代謝，增加胎兒需氧量。但是GDM孕婦血清糖化血紅蛋白升高和胎盤血流量減少則導(dǎo)致母胎供氧量減少，從而造成了胎兒相對(duì)缺氧的狀態(tài)。高膽紅素血癥被認(rèn)為是這種相對(duì)缺氧狀態(tài)的反調(diào)節(jié)機(jī)制，它觸發(fā)了紅細(xì)胞分泌和促進(jìn)紅細(xì)胞產(chǎn)生。

目前已經(jīng)有越來(lái)越多的研究人員證實(shí)miR-137與機(jī)體代謝調(diào)控機(jī)制密切相關(guān)。Peng等[12]學(xué)者報(bào)道，重度GDM孕婦胎盤組織和高糖環(huán)境中的滋養(yǎng)層細(xì)胞系HTR-8/SVneo 細(xì)胞中 miR-137表達(dá)增加，同時(shí)FNDC5蛋白表達(dá)降低，而沉默HTR-8/SVneo 細(xì)胞中 miR-137表達(dá)后，F(xiàn)NDC5蛋白表達(dá)量則升高，說(shuō)明滋養(yǎng)層細(xì)胞的增殖和遷移活性受到 miR-137表達(dá)水平升高的抑制。另外同一課題組隨后還證實(shí)上調(diào)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)中miR-137表達(dá)，可以增強(qiáng)U937和 THP-1細(xì)胞對(duì)HUVECs的趨化性和黏附性，而高糖環(huán)境則可上調(diào)miR-137的表達(dá)，進(jìn)而抑制這種黏附性，同時(shí)可抑制 HUVECs血管生成和血管活性[13]。最終，作者推斷miR-137對(duì)高糖環(huán)境誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮功能障礙至關(guān)重要，可能參與了GDM的病理過(guò)程。在本研究中，我們分別檢測(cè)了GDM診斷時(shí)血清miR-137表達(dá)水平和新鮮胎盤組織中miR-137水平，兩者存在一定的相關(guān)性，且都較對(duì)照組孕婦樣本中的表達(dá)量升高，說(shuō)明GDM孕婦血清樣本中升高的miR-137可能多數(shù)來(lái)自于胎盤組織細(xì)胞的分泌，但是這一點(diǎn)仍然需要進(jìn)行更深入、更科學(xué)的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)結(jié)論支持。

高膽紅素血癥在新生兒中十分常見，主要表現(xiàn)為皮膚中大量膽紅素沉積，這是紅細(xì)胞破壞增加和膽紅素排泄減少共同導(dǎo)致的結(jié)果[14]。膽紅素通常是通過(guò)肝臟排泄到膽汁中。膽紅素清除功能缺失導(dǎo)致這種黃色素在血液或皮膚中大量積累。新生兒高膽紅素血癥可導(dǎo)致腦部某些區(qū)域(特別是基底核)的膽紅素積聚，從而對(duì)這些區(qū)域造成不可逆轉(zhuǎn)的損害，表現(xiàn)為各種神經(jīng)功能缺陷、癲癇、聽力障礙和眼球運(yùn)動(dòng)[15-16]。因此，維持正常的膽紅素清除率是預(yù)防新生兒高膽紅素血癥和相關(guān)神經(jīng)毒性的關(guān)鍵過(guò)程，更好地了解膽紅素清除率的機(jī)制至關(guān)重要。最近有研究證實(shí)膽紅素解毒酶和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)受到孤兒核受體(pregnane X receptor，PXR)和CAR的轉(zhuǎn)錄調(diào)控[17]。CAR是肝臟清除膽紅素的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，因?yàn)樗{(diào)節(jié)與藥物代謝、激素、能量和脂質(zhì)平衡有關(guān)的基因的表達(dá)。但是CAR在新生小鼠和新生兒中的表達(dá)量極低，這在某些情況下可能產(chǎn)生明顯的病理后果，例如新生兒高膽紅素血癥和相關(guān)的神經(jīng)毒性。而Chen等[5]則發(fā)現(xiàn)，miR-137在調(diào)節(jié) CAR表達(dá)方面起到關(guān)鍵作用，敲低新生小鼠和成年小鼠肝組織/細(xì)胞中 miR-137表達(dá)，可以增加膽紅素清除率，這可能是因?yàn)閙iR-137表達(dá)的上調(diào)導(dǎo)致肝臟CAR表達(dá)水平降低，因此進(jìn)而使新生兒膽紅素的清除率降低，因此靶向 miR-137可能是一種提高肝臟組織CAR表達(dá)和加速膽紅素清除的方法，以降低新生兒高膽紅素血癥發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。我們的研究結(jié)果與之相符。在本研究中，我們通過(guò)臨床樣本證實(shí)，在GDM組中，高膽紅素血癥亞組孕婦血清miR-137水平較非高膽紅素血癥亞組孕婦升高明顯，而且孕婦血清miR-137表達(dá)水平與新生兒血清膽紅素水平表現(xiàn)出顯著的正相關(guān)性，說(shuō)明GDM孕婦高糖環(huán)境導(dǎo)致miR-137水平升高，而母體血清中高水平miR-137可能通過(guò)某種機(jī)制進(jìn)一步影響了新生兒出生后膽紅素的清除率，增加了高膽紅素血癥的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，但是這個(gè)結(jié)論尚需要擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步證實(shí)其可靠性。

綜上所述，GDM孕婦血清miR-137表達(dá)水平明顯上調(diào)，而且這也是新生兒高膽紅素血癥發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，因此檢測(cè)GDM孕婦血清miR-137有望成為預(yù)測(cè)新生兒高膽紅素血癥發(fā)生的有效措施。