早期食管鱗狀細(xì)胞癌患者循環(huán)血清外泌體circFNDC3B表達(dá)水平及其臨床意義

白梅，余灝東，王于梅，唐尚軍，孫華玲

(重慶市黔江中心醫(yī)院 消化內(nèi)科，重慶 黔江 409099)

食管癌是我國致死率最高的惡性腫瘤之一，其中以食管鱗狀細(xì)胞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)最為常見[1]。近年來，隨著精準(zhǔn)醫(yī)療的發(fā)展，液體活檢技術(shù)已經(jīng)用于食管癌的臨床篩查工作中。其中外泌體在腫瘤早期預(yù)警、診斷、預(yù)后評估中都表現(xiàn)出極大的潛力。事實(shí)上，眾多研究在食管癌患者的循環(huán)血中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了來源于腫瘤的外泌體，其中包含大量腫瘤相關(guān)的特異性分子，如mRNA、蛋白、脂質(zhì)、非編碼RNA等，使其具有強(qiáng)大的信號傳遞功能[2]。環(huán)狀RNA(circRNA)是一類廣泛存在于真核細(xì)胞胞漿中的非編碼RNA，不同于其他非編碼RNA，circRNA是以3′和5′端共價(jià)閉合的環(huán)狀形式存在，因此具有更高的穩(wěn)定性和保守性[3]。Ⅲ型纖維連接蛋白域蛋白3B(Fibronectin type III domain-containing protein 3B，F(xiàn)NDC3B)是一個(gè)新鑒定的原癌基因編碼的蛋白，Luo等[4]證實(shí)FNDC3B環(huán)狀RNA(circFNDC3B)可以激活多個(gè)癌變途徑，促進(jìn)食管癌細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移。目前關(guān)于circFNDC3B在早期食管癌中的表達(dá)意義尚缺乏研究。本研究旨在分析癌前病變和早期ESCC患者循環(huán)血漿外泌體中circFNDC3B水平的差異，從而為ESCC發(fā)病機(jī)制的研究及早期篩查工作提供新的生物學(xué)標(biāo)志分子。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2019年3月至2020年12月共收集了年齡40～72歲的74例早期ESCC患者、72例食管鱗狀上皮內(nèi)瘤變(esophageal Intraepithelial neoplasia，EIN)患者和75例健康志愿者的的血清樣本，分別作為ESCC組、EIN組和正常組。所有患者均符合普通白光纖維內(nèi)鏡篩查標(biāo)準(zhǔn)，隨后經(jīng)內(nèi)鏡下盧戈染色聯(lián)合異常區(qū)域靶向活檢明確診斷為ESCC或EIN。其中低級別EIN 42例，高級別EIN 30例；ESCC組病例均為早期/表淺(TisN0M0期或T1N0M0期)食管浸潤性癌。在收集血清樣本之前，所有患者從未接受過任何抗腫瘤治療，具有完整的臨床資料。正常組健康志愿者從常規(guī)體格檢查中招募，排除有重大疾病和長期用藥的受試者。所有受試者都有規(guī)律的飲食習(xí)慣。排除合并有其他類型惡性腫瘤、自身免疫性疾病、感染性疾病、嚴(yán)重肝腎功能不全、高血壓、糖尿病、妊娠或哺乳期人群。所有參與者均對本研究知情，并簽署書面同意書。本研究經(jīng)我院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 資料收集 收集所有研究對象的臨床資料，包括年齡、性別、體重指數(shù)、吸煙史、飲酒史、飲食習(xí)慣以及腫瘤大小、組織學(xué)分型、分化程度、TNM分期。其中吸煙定義為平均每天吸煙≥1支，連續(xù)或累積≥1年；飲酒定義為平均每周飲酒≥1次，連續(xù)或累積≥1年。

1.2.2 血清外泌體獲取 每個(gè)實(shí)驗(yàn)對象在采血前禁食8～10 h，早晨餐前用非抗凝真空管(5 ml)采集血樣。靜置30 min后，以2 000 r·min-1的速率離心10 min。將上清液轉(zhuǎn)移至-80 ℃儲存，直至分析。使用InvitrogenTM總外泌體分離試劑(美國Invitrogen公司)，取500 μl血清與外泌體分離試劑混合，混合物在10 000 r·min-1、4 ℃下一次離心30 min，15 000 r·min-1二次離心30 min，去除細(xì)胞碎片；120 000 r·min-1超速離心60 min，獲得外泌體沉淀，洗滌后用60 μl PBS重懸，通過Tecnai G2 Spirit(美國FEI公司)透射電鏡觀察外泌體的形態(tài)和粒徑分布。利用NanoSight NS300系統(tǒng)(英國Malvern公司)進(jìn)行納米顆粒跟蹤分析，檢測分離出的外泌體的濃度、大小分布和ζ電勢。通過流式細(xì)胞術(shù)檢測CD63和CD81外泌體標(biāo)記膜蛋白。

1.2.3 提取外泌體circRNAs[5]使用Trizol試劑和蛋白分離試劑(美國Invitrogen公司)從外泌體中分離出circRNAs，其RNA純度和濃度由紫外分光光度計(jì)測定。

1.2.4 CircRNAs微陣列分析[6]從ESCC組、高級別EIN組、低級別EIN組、正常組血清外泌體樣本中隨機(jī)選取4例血清樣本，進(jìn)行基因芯片分析。委托上海生物芯片有限公司基于Agilent circRNA表達(dá)譜芯片平臺完成檢測任務(wù)。簡單地說，每個(gè)樣本的總RNA被擴(kuò)增，并使用非特異性引物合成熒光標(biāo)記的cRNA。將標(biāo)記的cRNA與Agilent circRNA陣列雜交。在清洗完載玻片后，數(shù)組被Agilent G2565CA掃描系統(tǒng)獲取。然后將掃描圖像導(dǎo)入到Agilent 特征提取v10.7系統(tǒng)中，用于網(wǎng)格對齊和數(shù)據(jù)提取。采用Edger軟件包(R3.4.4)對數(shù)據(jù)進(jìn)行規(guī)范化處理，并進(jìn)行分析，確定不同分子間的差異表達(dá)。

1.2.5 外泌體circFNDC3B水平檢測[4]采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測外泌體circFNDC3B水平。以500 ng RNA為模板，采用逆轉(zhuǎn)錄技術(shù)，以Prime Script RT Master Mix試劑盒(美國Takara公司)和隨機(jī)引物進(jìn)行cDNA合成。在Real-Time PCR系統(tǒng)(美國Thermo公司)中使用SYBR Select Master Mix試劑盒(美國Applied Biosystems公司)完成實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)。用反向引物和發(fā)散引物分別對線性和環(huán)形RNA進(jìn)行分析。采用GAPDH作為內(nèi)部控制。circFNDC3B正向引物5′-CATCTCCATTCACCAAGTGGGG-3′,反向引物5′-AGCAGGTTATTCTCGTTCAAG-3′；GAPDH正向引物5′-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3′,反向引物5′-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3′。反應(yīng)條件：95 ℃反應(yīng)15 min，1次循環(huán)；95 ℃反應(yīng)30 s、55 ℃反應(yīng)34 s，50次循環(huán)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 3組一般資料的比較

3組年齡、性別、體重指數(shù)、飲酒史、喜食辛辣食物及蔬菜水果等資料比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性；而EIN組和ESCC組吸煙者、喜食腌制食物者比例高于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 3組一般資料的比較

2.2 循環(huán)血清外泌體獲取及鑒定

經(jīng)透射電鏡觀察，循環(huán)血清外泌體是一個(gè)雙層膜狀結(jié)構(gòu)的微小囊泡，粒徑大小為50～150 nm，符合外泌體的形態(tài)特征(圖1A)。經(jīng)NTA追蹤技術(shù)分析，外泌體平均粒徑為(89.50±5.33)nm(圖1B)。經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測，外泌體標(biāo)志蛋白CD63、CD81呈陽性表達(dá)，確定成功分離并純化外泌體囊泡(圖1C)。

A.具有代表性的離體外泌體透射電鏡照片；B.NTA追蹤技術(shù)分析典型樣品外泌體大小分布直方圖；C.流式細(xì)胞術(shù)測定外泌體表面標(biāo)志物(CD63和CD81的檢出率均在80%以上)

2.3 血清外泌體差異性circRNAs篩選

ESCC組與正常組比較，有2 293個(gè)circRNA表達(dá)上調(diào)和15 707個(gè)circRNA表達(dá)下調(diào)。ESCC組與低級別EIN組血清外泌體circRNAs表達(dá)譜比較，有1 101個(gè)circRNA表達(dá)上調(diào)，8 384個(gè)circRNA表達(dá)下調(diào)。ESCC組與高級別EIN組比較，有258個(gè)circRNA表達(dá)上調(diào)和181個(gè)circRNA表達(dá)下調(diào)。其中有106個(gè)差異性circRNA表達(dá)譜重疊，在變化倍數(shù)≥3.0和P<0.05的標(biāo)準(zhǔn)下，我們選擇了變化倍數(shù)較大的circFNDC3B作為目標(biāo)物進(jìn)行進(jìn)一步研究。見圖2。

A.ESCC組vs正常組；B.ESCC組vs低級別EIN組；C ESCC組vs高級別EIN組

2.4 3組循環(huán)血清外泌體circFNDC3B表達(dá)水平比較

正常組、EIN組、ESCC組循環(huán)血清外泌體circFNDC3B表達(dá)水平分別為0.87(0.71，1.38)、1.43(0.91，2.19)、2.68(1.89，3.83)，EIN組和ESCC組患者血清外泌體circFNDC3B表達(dá)水平均高于正常組，且ESCC組患者血清外泌體circFNDC3B表達(dá)水平高于EIN組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.5 單因素和多因素Logistic回歸分析早期ESCC發(fā)生的影響因素

經(jīng)單因素和多因素 Logistic 回歸分析，年齡、性別、吸煙史、飲酒史、家族腫瘤史、喜辛辣食物、喜腌制食物、喜蔬菜水果、Charlson合并癥指數(shù)與早期ESCC發(fā)生無關(guān)(P>0.05)，而血清外泌體circFNDC3B表達(dá)水平升高是早期ESCC發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)。見表4。

表4 單因素和多因素Logistic回歸分析早期ESCC發(fā)生的影響因素

2.6 ROC曲線分析血清外泌體circFNDC3B水平對早期ESCC的診斷效能

血清外泌體circFNDC3B水平診斷早期ESCCROC曲線下面積為0.870(95%CI0.823～0.917)，對應(yīng)截?cái)嘀禐?.553，在該截?cái)嘀迪绿禺惗葹?2.1%，敏感度為87.8%，見圖3。

圖3 血清外泌體circFNDC3B水平對早期ESCC診斷的ROC曲線

3 討 論

對于ESCC的預(yù)防和控制在我國已成為一個(gè)日益重要的公共衛(wèi)生挑戰(zhàn)，因?yàn)槠漕A(yù)后和5年存活率仍然不能令人滿意[6]。到目前為止，雖然已經(jīng)進(jìn)行了大量蛋白組學(xué)和代謝組學(xué)研究，以確定差異生物標(biāo)志物對于早期ESCC的診斷價(jià)值，但是得到的生物學(xué)信息有限。circRNAs在食管癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)已經(jīng)被一些先前的研究所證實(shí)，但是關(guān)于它們作為食管癌生物標(biāo)志物的表達(dá)特異性和敏感性，以及它們的功能網(wǎng)絡(luò)和機(jī)制的信息還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)循環(huán)血清外泌體circFNDC3B對于早期ESCC具有良好的鑒別診斷能力，在常規(guī)體格檢查中也更具臨床實(shí)用性。

circRNA是一大組共價(jià)閉合的連續(xù)環(huán)，通常在人類細(xì)胞中表達(dá)，循環(huán)血清外泌體circRNA的引入，為新型生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)提供了更多啟示[7]。近年來circRNA功能分析的研究進(jìn)展表明，circRNA可以通過與海綿狀miRNAs相互作用以及調(diào)節(jié)RNA結(jié)合蛋白的活性，進(jìn)而影響基因的表達(dá)來發(fā)揮其生物學(xué)作用[8]。此外它們還被證實(shí)可以調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄，并被轉(zhuǎn)化成功能蛋白質(zhì)或多肽。這些結(jié)果表明，circRNAs可能主要作為基因轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后修飾的調(diào)節(jié)因子，通過它們可能影響與各種生物過程相關(guān)的多個(gè)基因[9]。circRNAs在食管癌中異常表達(dá)，這將為診斷和治療提供重要參考，可能用作新型食管癌生物標(biāo)志物。最近c(diǎn)ircFNDC3B已被證明通過不同的機(jī)制參與了各種生物學(xué)過程[10-11]。circFNDC3B是由位于人類基因組第7個(gè)染色體上的FNDC3B基因產(chǎn)生的，與線性形式相比，circFNDC3B結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定，且具有更長的半衰期[12]。CircFNDC3B長215個(gè)堿基，由FNDC3B基因的第2和第3外顯子通過反向剪接編碼和生成。已有較多研究發(fā)現(xiàn)circFNDC3B與癌癥密切相關(guān)，例如，Garikipati等[13]證實(shí)，在缺血性心肌病患者或動(dòng)物模型的心肌組織中，circFNDC3B表達(dá)均明顯下調(diào)。而心臟內(nèi)皮細(xì)胞過度表達(dá)circFNDC3B可增加血管內(nèi)皮生長因子-A的表達(dá)，增強(qiáng)其血管生成活性，減少心肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，因此靶向circFNDC3B可能是心肌梗死后促進(jìn)心功能和重塑的一個(gè)潛在策略。此外Hong等[14]發(fā)現(xiàn)circFNDC3B上調(diào)時(shí)通過circFNDC3B-IGF2BP3-CD44 mRNA三元復(fù)合物的形成和E-鈣黏著蛋白在胃癌中的調(diào)節(jié)而促進(jìn)胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲。最近Luo等[4]發(fā)現(xiàn)通過基因沉默的方式抑制了Eca109和KYSEL150食管癌細(xì)胞的表達(dá)，結(jié)果證明circFNDC3B是ESCC細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的重要調(diào)節(jié)因子，這些都是與細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化有關(guān)的重要細(xì)胞過程。這表明circRNAs作為一個(gè)群體，可能作為復(fù)雜信號網(wǎng)絡(luò)的重要上游組成部分，負(fù)責(zé)啟動(dòng)和促進(jìn)食管癌的發(fā)生過程。本研究中，早期ESCC患者和EIN組患者血清外泌體circFNDC3B表達(dá)水平較正常組升高，且ESCC患者升高更明顯，說明circFNDC3B在食管鱗狀上皮細(xì)胞癌變過程中，circFNDC3B扮演著關(guān)鍵角色，有望成為ESCC早期診斷的生物標(biāo)志物，這為早期EC的準(zhǔn)確診斷和精準(zhǔn)醫(yī)療提供了一定基礎(chǔ)。

外泌體與circRNA緊密相連，是近年來的一個(gè)研究熱點(diǎn)。外泌體是可以從大多數(shù)細(xì)胞類型產(chǎn)生的納米級膜囊泡[15]。細(xì)胞間信息傳遞對于微環(huán)境中的腫瘤進(jìn)展至關(guān)重要，這是外泌體的主要功能[16]。研究表明，許多循環(huán)circRNA是被動(dòng)地從凋亡和壞死細(xì)胞釋放，且易被RNA酶降解，這可能不能真正反映腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)變化[17]。而外泌體中的circRNA不僅含量豐富且結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，在外泌體被周圍細(xì)胞吸收后可以繼續(xù)發(fā)揮作用，這為外泌體circRNA在食管癌中具有作為生物標(biāo)志物的潛在能力提供了基礎(chǔ)[18]。在本研究中，我們分析了ESCC組、EIN組、正常組循環(huán)外泌體circRNAs微陣列，證實(shí)circFNDC3B在各組之間均存在差異性表達(dá)。進(jìn)一步通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測，提示循環(huán)血清外泌體circFNDC3B高表達(dá)水平與ESCC上皮組織癌變有關(guān)，是發(fā)生ESCC的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。經(jīng)ROC曲線分析顯示，血清外泌體circFNDC3B水平對早期ESCC具有一定的診斷效能。

綜上所述，本研究鑒定了血清外泌體circFNDC3B可用于ESCC的早期診斷，為ESCC的篩查工作和精準(zhǔn)醫(yī)療提供了一定的參考信息。但本研究仍處于初步探索階段，未來需要一個(gè)更大更多樣化的群體來進(jìn)一步驗(yàn)證新發(fā)現(xiàn)的生物標(biāo)志物的特異性和敏感性。本研究的策略也適用于其他臨床應(yīng)用。