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    用白花前胡戊素聯(lián)合氨茶堿對哮喘小鼠進(jìn)行治療對其肺組織中NF-κB和IL-6水平的影響

    2022-01-27 09:54:26甘連芳鐘立璠
    當(dāng)代醫(yī)藥論叢 2022年2期
    關(guān)鍵詞:氨茶堿灌胃小劑量

    甘連芳,鐘立璠,黃 凌

    (海南醫(yī)學(xué)院,海南 海口 571199)

    哮喘是一種涉及多種炎癥細(xì)胞相互作用、多種細(xì)胞因子參與的慢性氣道炎性疾病[1]。有研究指出,哮喘的發(fā)生與患者存在核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor-kappaB,NF-κB)和白細(xì)胞介素-6(interleukin-6,IL-6)等細(xì)胞因子表達(dá)水平的異常增高密切相關(guān)[2]。氨茶堿具有良好的平喘作用。用此藥治療哮喘可顯著改善患者的肺功能,緩解其氣道的炎癥反應(yīng)[3-4]。白花前胡具有鎮(zhèn)咳、化痰、平喘的功效。此藥是目前臨床上常用的各種鎮(zhèn)咳平喘中成藥的主要有效成分之一[5]。白花前胡戊素(Praeruptorin E,PE)是白花前胡的主要活性成分。藥理學(xué)研究表明,PE可抑制炎癥反應(yīng)發(fā)生時NF-κB的轉(zhuǎn)位及激活,降低IL-6的水平,減輕炎癥反應(yīng)[6]。本文主要是觀察用PE聯(lián)合氨茶堿對卵清蛋白(ovalbumin,OVA)致哮喘小鼠進(jìn)行治療對其肺組織中NF-κB和IL-6水平的影響。

    1 材料及方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)材料

    PE(上海源葉生物技術(shù)有限公司生產(chǎn));OVA(Sigma公司生產(chǎn));Al(OH)3(Thermo公司生產(chǎn));兔抗小鼠NF-κBp65多克隆抗體(Cell Signaling Technology,Inc生產(chǎn));二步法免疫組化試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司生產(chǎn));蘇木精、伊紅(Sigma公司生產(chǎn));TransZol、總RNA快速提取試劑盒(Generay公司生產(chǎn));逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Biosharp公司生產(chǎn));qPCR SYBR Green Master Mix(Yeasen公司生產(chǎn))。

    1.2 實(shí)驗(yàn)動物分組及處理

    將36只6周齡的雌性BALB/c小鼠隨機(jī)分為空白組、OVA組、氨茶堿組、氨茶堿+PE小劑量組、氨茶堿+PE中劑量組和氨茶堿+PE大劑量組,每組6只小鼠。對除空白組小鼠外的其余各組小鼠進(jìn)行哮喘造模,為其腹腔注射OVA致敏溶液〔含有OVA和Al(OH)3〕,0.2 mL/次,1次/d,連續(xù)注射7 d。之后使用2%的OVA激發(fā)溶液對其進(jìn)行霧化吸入激發(fā)處理,30 min/次,1次/d,連續(xù)吸入7 d。在對這些小鼠進(jìn)行造模的同時,為空白組小鼠使用等劑量的生理鹽水。完成上述造模處理后,為氨茶堿組小鼠使用氨茶堿(每次30 mg/kg)進(jìn)行灌胃處理,1次/d。為氨茶堿+PE小劑量組小鼠使用氨茶堿(每次30 mg/kg)和小劑量的PE(每次2.5 mg/kg)進(jìn)行灌胃處理,1次/d。為氨茶堿+PE中劑量組小鼠使用氨茶堿(每次30 mg/kg)和中劑量的PE(每次10 mg/kg)進(jìn)行灌胃處理,1次/d。為氨茶堿+PE大劑量組小鼠使用氨茶堿(每次30 mg/kg)和大劑量的PE(每次40 mg/kg)進(jìn)行灌胃處理,1次/d。各組小鼠均連續(xù)灌胃7 d,然后對其進(jìn)行剖檢。

    1.3 對各組小鼠進(jìn)行病理切片檢查

    對各組小鼠的肺組織進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋、切片處理,采用蘇木精-伊紅染色法對切片進(jìn)行染色,在400倍的顯微鏡下觀察切片中肺組織的結(jié)構(gòu)形態(tài)。

    1.4 采用免疫組化法檢測各組小鼠肺組織中NF-κBp65蛋白的表達(dá)

    將各組小鼠的肺組織浸泡在4%的中性甲醛溶液中固定72 h,然后進(jìn)行石蠟包埋、切片、脫蠟、水化、封閉處理。在切片中加入兔抗小鼠NF-κBp65多克隆抗體孵育過夜,然后進(jìn)行顯色、封片處理。觀察切片中的NF-κBp65蛋白,用專業(yè)的圖像分析軟件計算各組小鼠肺組織中NFκBp65蛋白的陽性表達(dá)率。

    1.5 采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法檢測各組小鼠肺組織中NF-κBp65mRNA和IL-6mRNA的表達(dá)

    提取各組小鼠肺組織中的總RNA,使用微量核酸檢測儀測定RNA的純度和濃度,取合格的總RNA樣品進(jìn)行cDNA的逆轉(zhuǎn)錄合成,并置于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)分析儀中進(jìn)行擴(kuò)增處理。引物設(shè)計如 下:NF-κBp65 F:5’-AGGATTTCGATTCCGCTACG-3’,R:5’-CCTGGTCCTGTGTAGCCATT-3’;IL-6 F:5'-TGTAGTGAGGAACAAGCCAGAG-3',R:5’-TACATTGCCGAAGAGCC-3’;Actin F:5’-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3’,R:5’-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3’。循環(huán)結(jié)束后,繪制溶解曲線。獲得NF-κBp65、IL-6和Actin的熒光域值循環(huán)數(shù)(Ct值)后,計算NFκBp65 mRNA和IL-6 mRNA的表達(dá)水平。

    1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

    采用SPSS 25.0軟件對本研究中的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,采用t檢驗(yàn),計數(shù)資料用百分比(%)表示,采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 接受相應(yīng)處理后各組小鼠肺組織的結(jié)構(gòu)形態(tài)

    接受相應(yīng)處理后,各組小鼠肺組織的結(jié)構(gòu)形態(tài)如下:1)空白組小鼠:小鼠支氣管周圍細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)的形態(tài)正常,無形態(tài)學(xué)改變,結(jié)構(gòu)清晰;2)OVA組小鼠:小鼠支氣管壁周圍出現(xiàn)明顯的炎性細(xì)胞浸潤,其支氣管壁明顯增厚;3)氨茶堿組小鼠:小鼠支氣管壁周圍出現(xiàn)輕微的炎性細(xì)胞浸潤,其支氣管壁輕微增厚;4)氨茶堿+PE小劑量組小鼠:小鼠支氣管壁周圍出現(xiàn)輕微的炎性細(xì)胞浸潤,其支氣管壁結(jié)構(gòu)幾乎無改變;5)氨茶堿+PE中劑量組小鼠:小鼠支氣管壁周圍出現(xiàn)輕微的炎性細(xì)胞浸潤,其支氣管壁結(jié)構(gòu)無改變;6)氨茶堿+PE大劑量組小鼠:小鼠支氣管壁周圍無炎性細(xì)胞浸潤,其支氣管壁結(jié)構(gòu)無改變。詳見圖1。

    圖1 接受相應(yīng)處理后各組小鼠肺組織的結(jié)構(gòu)形態(tài)

    2.2 各組小鼠肺組織中NF-κBp65蛋白的表達(dá)情況

    與空白組小鼠相比,OVA組小鼠肺組織中NF-κBp65蛋白的陽性表達(dá)率較高,P<0.05。與OVA組小鼠相比,氨茶堿組小鼠接受治療后其肺組織中NF-κBp65蛋白的陽性表達(dá)率較低,P<0.05。接受治療后,氨茶堿+PE小劑量組小鼠肺組織中NF-κBp65蛋白的陽性表達(dá)率低于氨茶堿組小鼠,P<0.05;氨茶堿+PE中劑量組小鼠肺組織中NF-κBp65蛋白的陽性表達(dá)率低于氨茶堿+PE小劑量組小鼠,P<0.05;氨茶堿+PE大劑量組小鼠肺組織中NF-κBp65蛋白的陽性表達(dá)率低于氨茶堿+PE中劑量組小鼠,P<0.05。詳見圖2。

    圖2 各組小鼠肺組織中NF-κBp65蛋白的表達(dá)情況

    2.3 各組小鼠肺組織中NF-κBp65mRNA和IL-6mRNA的表達(dá)情況

    與空白組小鼠相比,OVA組小鼠肺組織中NF-κBp65 mRNA和IL-6 mRNA的表達(dá)水平均較高,P<0.05。與OVA組小鼠相比,氨茶堿組小鼠接受治療后其肺組織中NF-κBp65 mRNA和IL-6 mRNA的表達(dá)水平均較低,P<0.05。接受治療后,氨茶堿+PE小劑量組小鼠肺組織中NFκBp65 mRNA和IL-6 mRNA的表達(dá)水平均低于氨茶堿組小鼠,P<0.05;氨茶堿+PE中劑量組小鼠肺組織中NF-κBp65 mRNA和IL-6 mRNA的表達(dá)水平均低于氨茶堿+PE小劑量組小鼠,P<0.05;氨茶堿+PE大劑量組小鼠肺組織中NF-κBp65 mRNA和IL-6 mRNA的表達(dá)水平均低于氨茶堿+PE中劑量組小鼠,P<0.05。詳見圖3。

    圖3 各組小鼠肺組織中NF-κBp65 mRNA和IL-6 mRNA的表達(dá)情況

    3 討論

    PE是白花前胡的主要活性成分,具有良好的抗炎作用[6]。藥理學(xué)研究表明,PE可抑制NF-κB的核轉(zhuǎn)運(yùn),從而可起到減輕炎癥反應(yīng)的作用[7-8]。本研究的結(jié)果顯示,接受治療后,氨茶堿+PE小劑量組小鼠肺組織中NF-κBp65蛋白的陽性表達(dá)率、NF-κBp65 mRNA和IL-6 mRNA的表達(dá)水平均低于氨茶堿組小鼠,P<0.05;氨茶堿+PE中劑量組小鼠肺組織中NF-κBp65蛋白的陽性表達(dá)率、NF-κBp65 mRNA和IL-6 mRNA的表達(dá)水平均低于氨茶堿+PE小劑量組小鼠,P<0.05;氨茶堿+PE大劑量組小鼠肺組織中NFκBp65蛋白的陽性表達(dá)率、NF-κBp65 mRNA和IL-6 mRNA的表達(dá)水平均低于氨茶堿+PE中劑量組小鼠,P<0.05。這與相關(guān)研究的結(jié)果相符[9-10]。這表明,與單用氨茶堿、用小劑量的PE聯(lián)合氨茶堿、用中劑量的PE聯(lián)合氨茶堿相比,用大劑量的PE聯(lián)合氨茶堿對OVA致哮喘小鼠進(jìn)行治療的效果較好,可顯著降低其肺組織中NF-κB和IL-6的表達(dá)水平,減輕其氣道的炎癥反應(yīng)。

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