TNF-α誘導小鼠乳腺上皮細胞凋亡和程序性壞死研究

楊彩霞,楊敏,王根林,李亞南,雷智琦,李蓮

(南京農(nóng)業(yè)大學動物科技學院乳?？茖W研究所/動物科學類國家級實驗教學示范中心,江蘇 南京 210095)

奶牛乳腺炎是由病原微生物侵入乳腺組織,導致乳腺組織感染所引起的一系列炎癥反應。乳腺炎可造成乳腺組織損傷,進而影響泌乳功能,使產(chǎn)奶量下降,嚴重時可造成乳房病變導致淘汰,是危害奶牛養(yǎng)殖業(yè)最為嚴重的疾病之一[1]。其中,乳腺上皮細胞在免疫過程中發(fā)揮十分重要的作用,當病原微生物感染組織時,腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)等炎性因子被識別后發(fā)出招募信號,乳腺上皮細胞將炎性信息傳遞至巨噬細胞及中性粒細胞等,招募免疫細胞轉移至炎性損傷部位,識別并結合病原體,吞噬并殺死病原體后引起乳腺組織局部炎癥,緩解病原體的致病作用[2]。目前,針對奶牛乳腺炎治療的最有效方法是抗生素治療法,但是抗生素治療后產(chǎn)生的細菌抗藥性以及抗生素殘留問題是一個非常嚴峻的全球問題[3-4]。因此,隨著分子生物學技術的發(fā)展,尋找乳腺炎感染分子調(diào)控的靶點,并結合抗病育種開發(fā)靶向藥物,可能是預防與治療奶牛乳腺炎的一個新途徑。

程序性壞死(necroptosis)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種受程序性調(diào)控的細胞死亡方式,與細胞凋亡共享上游信號元件,如死亡受體腫瘤壞死因子受體(tumor necrosis factor receptor,TNFR)、Fas相關死亡結構域(Fas associated death domain,FADD)等[5],由受體相互作用蛋白激酶1(receptor interacting serine/threonine protein kinase 1,RIP1)、受體相互作用蛋白激酶3(receptor interacting serine/threonine protein kinase 3,RIP3)和混合譜系激酶域樣蛋白(mixed lineage kinase domain like pseudokinase,MLKL)傳導通路所調(diào)控的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(cysteine-aspartic proteases,Caspase)非依賴型細胞死亡方式[6-7]。而細胞凋亡依賴于Caspase家族調(diào)控,發(fā)生凋亡的細胞間相互連接丟失,細胞皺縮聚集后變圓亮,細胞核凝集,DNA碎片化,細胞膜包圍形成凋亡小體,并最終被消化吞噬;細胞發(fā)生程序性壞死后細胞器腫脹,細胞內(nèi)出現(xiàn)空泡,細胞膜破裂,釋放的損傷相關分子模式(damage associated molecular patterns,DAMP)可以激發(fā)多種細胞(如巨噬細胞、中性粒細胞和成纖維細胞等)參與免疫反應,通過釋放炎性細胞因子加劇炎癥應答,從而導致程序性壞死在不同生理或病理過程中扮演重要角色[8-9]。近年的研究表明,細胞程序性壞死是凋亡被抑制情況下的一種細胞死亡方式。程序性壞死參與多種炎癥相關的生理和病理過程,如胚胎發(fā)育、缺血/再灌注損傷、炎癥反應和外源微生物(細菌和病毒)引起的感染,它在細胞存活和死亡中發(fā)揮十分重要的作用[10]。

奶牛生產(chǎn)主要是指利用奶牛乳房高效生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)牛奶,高效優(yōu)質(zhì)的牛奶主要是由乳房乳腺上皮細胞合成和分泌。有研究表明,奶牛乳腺炎的發(fā)生與TNF誘導的信號通路造成的急性炎性損傷相關[11]。作為一種具有多種生物學功能的細胞炎性因子,TNF-α既可以誘導細胞凋亡,也可以啟動細胞程序性壞死[10],因此通過TNF-α誘導小鼠乳腺上皮細胞凋亡或程序性壞死對奶牛生產(chǎn)具有十分重要的指導意義。但TNF-α在何種條件下誘導小鼠乳腺上皮細胞凋亡,又在何種條件下轉向誘導細胞程序性壞死,其中的作用機制尚未清晰。環(huán)己酰亞胺(cycloheximide,CHX)是一種阻斷真核細胞翻譯延伸階段的蛋白質(zhì)合成抑制劑,Z-VAD-FMK是一種廣譜Caspase家族抑制劑,通過TCZ混合處理成功誘導了TPKTS小鼠近端腎小管細胞的程序性壞死,表明TCZ聯(lián)合誘導可引起細胞炎癥并激活程序性壞死途徑[12]。本研究采用TNF-α單獨或與CHX、Z-VAD-FMK聯(lián)合處理小鼠乳腺上皮細胞,旨在研究TNF-α誘導對小鼠乳腺上皮細胞凋亡和程序性壞死的調(diào)控機制,為后續(xù)探究細胞程序性壞死通路在奶牛急性乳腺炎發(fā)生過程中的作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗所用小鼠乳腺上皮細胞(HC-11細胞系)購于美國典型培養(yǎng)物保藏中心。TNF-α購于南京金斯瑞公司;CHX、Z-VAD-FMK(Caspase家族抑制劑)購自Med Chem Express(MCE)公司;胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶購于Gibco公司;細胞凍存液購自新賽美公司;CCK-8細胞活力檢測試劑盒購自同仁化學(Dojindo)公司;RPMI 1640培養(yǎng)基購自上海源培公司;PBS購于Hyclone公司;青霉素和鏈霉素購自合肥Biosharp公司;RNA提取試劑盒購自百泰克公司;RT Super Mix和ChamQ SYBR qPCR Master Mix購自南京諾唯贊公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 小鼠乳腺上皮細胞系的凍存、復蘇、培養(yǎng)將對數(shù)生長期融合度大于80%的HC-11細胞用胰蛋白酶消化,加入1 mL凍存液,將凍存管置于凍存盒中-80 ℃低溫保存24 h后,轉移至液氮中長期保存。將裝有 HC-11細胞的凍存管從液氮罐中取出后,置于37 ℃水浴,輕輕搖晃使其快速溶解,加入含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基至10 mL,1 000 r·min-1離心5 min,接種至T25培養(yǎng)瓶,置于37 ℃ 、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。大約12 h待細胞貼壁后,更換新鮮的完全培養(yǎng)基除去死細胞。每48 h換1次培養(yǎng)基,待細胞長至80%～90%匯合時,進行細胞消化傳代培養(yǎng)。

1.2.2 TNF-α濃度的篩選將TNF-α粉末溶解在含有0.1% BSA的PBS中使其終質(zhì)量濃度為100 μg·mL-1,CHX和Z-VAD-FMK溶解在DMSO中使其終濃度分別為10、20 mmol·L-1,分裝于200 μL無菌離心管中,并在使用時用RPMI 1640培養(yǎng)基稀釋成工作濃度。將對數(shù)期生長的小鼠乳腺上皮細胞接種于96孔細胞培養(yǎng)板,培養(yǎng)24 h以達到80%～90%匯合。對照組用DMSO處理(添加量為總體積的0.1%),其他各組用TNF-α(20、50、100 ng·mL-1)單獨或與CHX(4 μmol·L-1)、Z-VAD-FMK(20 μmol·L-1)聯(lián)合處理12 h和 24 h,然后將10 μL CCK-8溶液加入到100 μL細胞培養(yǎng)基中,37 ℃孵育2～3 h,用酶標儀測量450 nm處的吸光值A450。每組5個重復,結果取平均值。

1.2.3 試驗分組及處理細胞分為4組:對照(Ctrl)組、TNF-α(T)組、TNF-α+CHX(TC)組和TNF-α+CHX+Z-VAD-FMK(TCZ)組,每組3個重復。對照組添加DMSO(添加量為總體積的0.1%),T組添加100 ng·mL-1TNF-α;TC組添加100 ng·mL-1TNF-α+4 μmol·L-1CHX;TCZ組添加100 ng·mL-1TNF-α+4 μmol·L-1CHX+20 μmol·L-1Z-VAD-FMK。處理24 h后進行后續(xù)試驗。

1.2.4 RNA提取與RT-qPCR檢測細胞凋亡、程序性壞死及炎癥因子相關基因的表達收集細胞,按RNA提取試劑盒說明書提取細胞總RNA。取1 000 ng總RNA用RT Super Mix反轉錄成 cDNA,-80 ℃保存?zhèn)溆?。用ChamQ SYBR qPCR Master Mix檢測凋亡和程序性壞死相關基因mRNA的表達水平,反應產(chǎn)物經(jīng)熔解曲線檢測特異性,用 2-ΔΔCT法計算各基因mRNA相對表達量。引物序列見表1。

表1 熒光定量PCR引物序列Table 1 Primer sequences for quantitative real-time PCR

1.2.5 Western blot檢測細胞凋亡和程序性壞死相關蛋白的表達收集細胞,加入含苯甲基磺酰氟(PMSF)的裂解液,冰上裂解30 min,4 ℃、12 000 r·min-1離心15 min,上清液中為細胞總蛋白,按照BCA試劑盒(南京碧云天生物技術公司)測定蛋白濃度。吸取上清液并加入裂解液和上樣緩沖液將蛋白調(diào)整為統(tǒng)一濃度,95 ℃煮沸10 min變性,上樣后進行SDS-PAGE,然后將蛋白轉移至PVDF膜上,用50 g·L-1脫脂奶粉或牛血清白蛋白(BSA)室溫封閉1 h,加一抗,4 ℃孵育過夜,TBST洗滌 3次后加辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔/鼠IgG二抗(1∶5 000)室溫孵育1 h,TBST洗滌3次后用ECL試劑顯影發(fā)光。用Image J軟件進行條帶的灰度分析。試驗所用抗體Bcl-2、Bax和cleaved Caspase-3購自萬類生物科技有限公司,RIP3、MLKL和p-MLKL購自Cell Signaling Technology公司,PGAM5、Drp1和 β-actin 購自Proteintech公司。

1.2.6 透射顯微鏡觀察細胞超微結構變化培養(yǎng)好的細胞棄培養(yǎng)基,加入2.5%常溫戊二醛固定液避光固定5 min,用細胞刮刀沿一個方向輕輕刮下細胞,收集到15 mL離心管中,4 000 r·min-1離心2 min,棄上清液,加入新固定液1.5 mL,室溫避光固定2 h,轉移至4 ℃冰箱中保存。經(jīng)過漂洗—后固定—漂洗—脫水—滲透—包埋—超薄切片—染色后,用透射顯微鏡觀察并拍照。

1.3 統(tǒng)計分析

2 結果與分析

2.1 TNF-α、CHX和Z-VAD-FMK處理對小鼠乳腺上皮細胞增殖的影響

如圖1所示:用不同濃度的TNF-α、TNF-α+CHX、TNF-α+CHX+Z-VAD-FMK分別處理小鼠乳腺上皮細胞12 h和24 h。在處理時間為12 h時(圖1-A),T-100(100 ng·mL-1TNF-α)組的細胞活力極顯著低于對照組(P<0.001);所有的TC組和TCZ組細胞活力均極顯著低于對照組(P<0.001)。

在處理時間為24 h時(圖1-B):T-50(50 ng·mL-1TNF-α)組和T-100組的細胞活力均極顯著低于對照組(P<0.01或P<0.001);所有的TC組和TCZ組細胞活力均極顯著低于對照組(P<0.001);其中TC-100(100 ng·mL-1TNF-α+4 μmol·L-1CHX)組處理24 h后細胞活力最低為52%。因此,后續(xù)試驗采用的加藥劑量為TNF-α 100 ng·mL-1、CHX 4 μmol·L-1、Z-VAD-FMK 20 μmol·L-1,處理時間24 h。

圖1 TNF-α、CHX和Z-VAD-FMK處理12 h(A)和24 h(B)對小鼠乳腺上皮細胞增殖的影響Fig.1 Effects of TNF-α、CHX and Z-VAD-FMK treatment for 12 h(A)and 24 h(B) on proliferation of mouse mammary epithelial cells Ctrl:對照組Control group;T-20:TNF-α 20 ng·mL-1;T-50:TNF-α 50 ng·mL-1;T-100:TNF-α 100 ng·mL-1;TC-20:20 ng·mL-1 TNF-α+4 μmol·L-1 CHX;TC-50:50 ng·mL-1 TNF-α+4 μmol·L-1 CHX;TC-100:100 ng·mL-1 TNF-α+4 μmol·L-1 CHX;TCZ-20:20 ng·mL-1 TNF-α+4 μmol·L-1 CHX+20 μmol·L-1 Z-VAD-FMK;TCZ-50:50 ng·mL-1 TNF-α+4 μmol·L-1 CHX+20 μmol·L-1 Z-VAD-FMK;TCZ-100:100 ng·mL-1 TNF-α+4 μmol·L-1 CHX+20 μmol·L-1 Z-VAD-FMK. *P<0.05;**P<0.01;***P<0.001. 下同The same as follows.

2.2 光學顯微鏡觀察T、TC、TCZ誘導小鼠乳腺上皮細胞形態(tài)學變化

如圖2所示:對照組細胞連接緊密,形態(tài)規(guī)整,細胞間界限清晰,而T、TC和TCZ組部分小鼠乳腺上皮細胞形態(tài)紊亂,少數(shù)細胞懸浮,呈現(xiàn)不同程度的死亡。

圖2 光學顯微鏡觀察小鼠乳腺上皮細胞形態(tài)學變化Fig.2 Mouse mammary epithelial cells morphology observed by optical microscopy Ctrl:對照組Control group;T:100 ng·mL-1TNF-α;TC:100 ng·mL-1 TNF-α+4 μmol·L-1 CHX;TCZ:100 ng·mL-1 TNF-α+4 μmol·L-1 CHX+20 μmol·L-1 Z-VAD-FMK. 下同The same as follows.

2.3 透射電鏡鑒定TCZ誘導小鼠乳腺上皮細胞死亡的方式

如圖3所示:對照組細胞圓潤,線粒體形態(tài)規(guī)整;TCZ組細胞內(nèi)出現(xiàn)空泡,線粒體腫脹、斷裂等壞死細胞所具有的細胞超微結構變化。

圖3 小鼠乳腺上皮細胞死亡方式的透射電鏡鑒定Fig.3 Mouse mammary epithelial cell death modalities identified by transmission electron microscopy 箭頭指線粒體斷裂,方框指細胞內(nèi)空泡Arrows indicate mitochondrial breakage,squares indicate intracellular vacuoles. 1～3:是指不同放大倍數(shù)的圖片Picture 1-3 refer to pictures with different magnification.

2.4 T、TC、TCZ處理對小鼠乳腺上皮細胞凋亡相關基因mRNA及蛋白表達的影響

如圖4所示:與對照組相比,在T組和TC組中觀察到Caspase-3mRNA表達水平極顯著升高(P<0.01或P<0.001),T、TC和TCZ組Bax/Bcl-2mRNA表達水平比值均極顯著升高(P<0.001)。

圖4 T、TC、TCZ對小鼠乳腺上皮細胞凋亡相關基因mRNA(A)及蛋白(B)表達的影響Fig.4 Effects of T,TC and TCZ on mRNA(A)and protein(B)expressions of apoptosis related genes in mouse mammary epithelial cells *P<0.05;**P<0.01;***P<0.001. 下同The same as follows.

與對照組相比,T、TC和TCZ組Bax蛋白表達沒有顯著變化,T組和TCZ組Bcl-2蛋白表達水平略有下調(diào),僅TC組Bcl-2蛋白表達水平顯著下降(P<0.05),T組和TC組Bax/Bcl-2蛋白表達水平的比值和cleaved Caspase-3蛋白表達水平顯著上升(P<0.05或P<0.001)。

2.5 T、TC、TCZ處理對小鼠乳腺上皮細胞程序性壞死相關基因mRNA及蛋白表達的影響

如圖5所示:與對照組相比,T和TC組Caspase-8mRNA表達水平極顯著升高(P<0.001或P<0.01),而TCZ組Caspase-8mRNA表達水平極顯著降低(P<0.001);TC組和TCZ組的RIP3和MLKLmRNA表達水平極顯著升高(P<0.001)。與對照組相比,T組RIP3蛋白表達水平顯著降低(P<0.05),而TCZ組RIP3蛋白表達水平極顯著升高(P<0.01),T和TC組MLKL和p-MLKL蛋白表達水平?jīng)]有顯著變化,而TCZ組MLKL和p-MLKL蛋白表達水平極顯著升高(P<0.01或P<0.001),且p-MLKL/MLKL的比值顯著升高(P<0.05)。

圖5 T、TC、TCZ對小鼠乳腺上皮細胞程序性壞死相關基因mRNA(A)及蛋白(B)表達的影響Fig.5 Effects of T,TC and TCZ on mRNA(A)and protein(B)expressions of necroptosis related genes in mouse mammary epithelial cells

2.6 T、TC、TCZ處理對小鼠乳腺上皮細胞線粒體裂變相關基因mRNA及蛋白表達的影響

如圖6所示:與對照組相比,TC組和TCZ組PGAM5和Drp1mRNA表達水平極顯著升高(P<0.001),TCZ組的PGAM5蛋白表達水平顯著升高(P<0.05),TC組和TCZ組Drp1的蛋白表達水平均極顯著升高(P<0.001或P<0.01)。

圖6 T、TC、TCZ對小鼠乳腺上皮細胞線粒體裂變相關基因mRNA(A)及蛋白(B)表達的影響Fig.6 Effects of T,TC and TCZ on mRNA(A)and protein(B)expressions of mitochondrial fission related genes in mouse mammary epithelial cells

3 討論

在本試驗中,我們發(fā)現(xiàn)用TNF-α處理小鼠乳腺上皮細胞,Caspase-8被激活并誘導細胞凋亡,但在Caspase-8抑制的條件下部分細胞被誘導激活程序性壞死通路,即TNF-α單獨處理、TNF-α與CHX聯(lián)合處理均誘導一定程度的細胞凋亡,但TNF-α+CHX+Z-VAD-FMK聯(lián)合處理能夠誘導小鼠乳腺上皮細胞發(fā)生程序性壞死,且線粒體裂變后的下游事件可能會決定細胞的死亡方式。

線粒體除了具有生物學和代謝中的傳統(tǒng)作用外,現(xiàn)在還被認為是細胞死亡的執(zhí)行者。在細胞凋亡過程中,細胞色素c、Smac/Diablo、Omi/HtrA2、EndoG和AIF從線粒體膜間釋放,引發(fā)一系列導致細胞凋亡的生化反應[13]。線粒體外膜對這些細胞凋亡因子的通透性由Bcl-2家族蛋白調(diào)控,其中Bax是重要的細胞凋亡基因[14],Bcl-2/Bax值決定細胞受到凋亡刺激時的生存狀態(tài),Bcl-2蛋白的比例大時細胞趨于存活,Bax蛋白的比例大時細胞趨于凋亡。Caspase家族是介導細胞凋亡過程中的重要組成部分,其中Caspase-3在細胞凋亡途徑中起著關鍵作用[15-16]。在本試驗中,與對照組相比,暴露于T、TC和TCZ誘導劑的小鼠乳腺上皮細胞增殖能力顯著降低,且細胞死亡率從大到小依次為為TC組、TCZ組、T組。T組和TC組Bax/Bcl-2mRNA表達水平比值、Caspase-8和Caspase-3mRNA表達水平均顯著上調(diào),T組和TC組Bax/Bcl-2和cleaved Caspase-3蛋白表達水平顯著上升,表明T組和TC組可誘導小鼠乳腺上皮細胞發(fā)生凋亡,其中TC組誘導較高水平的凋亡。

通常情況下,TNF-α與細胞膜受體TNFR1結合并誘導復合物Ⅰ形成,復合物Ⅰ中的RIP1泛素化可激活NF-κB途徑,進而調(diào)控細胞的生長與存活;但在某些病理條件下,RIP1會去泛素化,進而誘導復合物Ⅱa的形成并激活復合物Ⅱa中的Caspase-8,從而激活凋亡途徑并誘導細胞凋亡,而活化的Caspase-8也會阻止其形成復合物Ⅱb;然而,當Caspase-8或FADD被抑制時,它會轉向誘導程序性壞死的發(fā)生[17-20]。RIP1 和RIP3相互磷酸化形成RIP1/3復合物Ⅱb,MLKL平常主要分布在細胞質(zhì)、線粒體相關膜部位和細胞質(zhì)膜等部位,被RIP1/3復合物Ⅱb招募后,MLKL磷酸化并形成寡聚體,轉移到細胞膜并激活離子通道,促進細胞發(fā)生程序性壞死[21-23]。透射電鏡可以觀察細胞的超微結構變化,進而判斷細胞的死亡類型,這是目前判斷細胞死亡類型的金標準[9]。在本試驗中,為了驗證Caspase-8是否在細胞凋亡或程序性壞死過程中發(fā)揮“主開關”的作用,首先我們用透射電鏡觀察到TCZ組細胞內(nèi)出現(xiàn)空泡、線粒體腫脹、斷裂等壞死細胞所具有的細胞超微結構變化;檢測細胞程序性壞死相關基因和蛋白表達水平,結果發(fā)現(xiàn)與對照組相比,TCZ組Caspase-8的mRNA水平顯著降低,TC組和TCZ組RIP3、MLKLmRNA表達水平顯著上升,但只有TCZ組程序性壞死標志蛋白MLKL和p-MLKL表達量顯著上升,表明100 ng·mL-1TNF-α+4 μmol·L-1CHX+20 μmol·L-1Z-VAD-FMK混合物可成功誘導小鼠乳腺上皮細胞程序性壞死。

值得注意的是,本研究結果中TNF-α可能主要以細胞凋亡和隨后晚期凋亡的方式誘導細胞死亡,CHX僅抑制細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的合成但不改變細胞死亡的方式[24],因此,TC誘導更加嚴重的細胞凋亡,而TCZ主要誘導程序性壞死。而且TCZ還可以在一些細胞中誘導細胞凋亡,這表明細胞凋亡和程序性壞死可能同時發(fā)生,并且程序性壞死甚至可以在特定條件下轉化為細胞凋亡[25]。如果是線粒體途徑引起的細胞凋亡,Caspase家族抑制劑如Z-VAD-FMK不能阻止哺乳動物細胞凋亡。相反,死亡受體激活引起的細胞凋亡完全可以被Caspase家族抑制劑挽救[21]。在本研究中,與TC組相比,添加Z-VAD-FMK后細胞活力顯著上升,表明Z-VAD-FMK可部分挽救小鼠乳腺上皮細胞免受TC誘導的細胞凋亡,轉而導致程序性壞死。這被認為是當細胞凋亡受到抑制時,程序性壞死起決定性作用的證據(jù)。

PGAM5是一種線粒體磷酸酶,是MLKL的下游效應基因,在程序性壞死的發(fā)生中可能起到重要作用。有研究表明,敲除PGAM5基因可以減弱細胞程序性壞死發(fā)生,通過抑制PGAM5S與RIP3-MLKL-PGAM5S的相互作用會影響細胞程序性壞死[13]。誘導壞死后,PGAM5去磷酸化并激活GTPase活性,進而募集線粒體裂變蛋白Drp1,使Drp1的637位(絲氨酸)磷酸化,造成線粒體整體結構被破壞,具體表現(xiàn)為線粒體腫脹斷裂和片段化,最終造成細胞程序性壞死的發(fā)生[26-27]。在本試驗中,與對照組相比,TC組和TCZ組PGAM5mRNA表達水平顯著升高,TCZ組PGAM5蛋白表達水平顯著升高。Drp1介導的線粒體斷裂似乎是凋亡和壞死的必需步驟[13]。在本試驗中,與對照組相比,TC組和TCZ組Drp1的mRNA和蛋白表達水平均顯著升高。在細胞凋亡過程中,線粒體片段化可能會改變線粒體外膜通透性,導致細胞色素c釋放和Caspase家族激活。然而在TNF誘導的程序性壞死過程中細胞色素c不會釋放[28],線粒體碎片在細胞核周圍聚集,導致核膜和細胞質(zhì)膜的破壞,即壞死的末期[13],這提示線粒體斷裂后的下游事件在凋亡和壞死之間可能有所不同。目前,由Drp1介導的線粒體片段如何導致壞死尚不清楚。線粒體破碎可能會減少能量產(chǎn)生,增加ROS生成或激活尚未定義的下游壞死執(zhí)行步驟。因此,闡明PGAM5和Drp1的壞死下游途徑仍然是很大的挑戰(zhàn)。

總之,本研究揭示了TNF-α在Caspase-8激活和抑制的條件下可分別誘導小鼠乳腺上皮細胞的凋亡和程序性壞死。我們首次證明程序性壞死參與調(diào)節(jié)TNF-α和環(huán)己酰亞胺誘導的小鼠乳腺上皮細胞死亡過程,且線粒體裂變后的下游事件可能會決定細胞的死亡方式。因此,更好地了解RIP3-MLKL-PGAM5-Drp1介導的程序性壞死分子途徑并研發(fā)其關鍵靶點抑制劑,可能是預防和治療奶牛臨床急性乳腺炎的有效方法。