宮內(nèi)發(fā)育遲緩對(duì)豬胎盤細(xì)胞增殖、凋亡及抗氧化基因和蛋白表達(dá)的影響

齊麗娜,蔣靜樂,陶生祥,張婧菲,張莉莉,王恬

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,江蘇 南京 210095)

母豬的繁殖力是影響其養(yǎng)殖效益的重要因素。宮內(nèi)發(fā)育遲緩(intrauterine growth retardation,IUGR)是指妊娠期胎兒生長發(fā)育遲緩,通常表現(xiàn)為初生體重低和組織器官發(fā)育受損[1]。目前常用于判斷IUGR的標(biāo)準(zhǔn)為初生體重低于群體平均值的10%或低于平均值的2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差。IUGR不僅導(dǎo)致胎兒在新生期的發(fā)病率與死亡率升高,而且對(duì)其出生后的生長發(fā)育也會(huì)產(chǎn)生不良影響[2]。

胎盤是妊娠期母體和胎兒之間營養(yǎng)物質(zhì)和氣體交換的重要組織器官,對(duì)胎兒的發(fā)育至關(guān)重要[3]。胎盤功能不全是宮內(nèi)發(fā)育遲緩的重要原因。Finch等[4]的研究表明,低胎盤重會(huì)損傷胎盤功能從而提高胎兒IUGR的發(fā)生率。Chen等[5]也研究報(bào)道稱,妊娠期維生素D缺乏可通過誘發(fā)胎盤炎癥引起胎盤功能不全和胎兒宮內(nèi)生長受限。豬作為一種多胎家畜,發(fā)生IUGR的概率較大,因?yàn)檠芊植紨?shù)量的差異,子宮末端的IUGR發(fā)生率要高于子宮角中部[6-7]。豬器官結(jié)構(gòu)和生理功能與人類相比極為相似,因此,IUGR豬常被用作研究人類IUGR的動(dòng)物模型。

本試驗(yàn)以豬胎盤為研究對(duì)象,應(yīng)用免疫組織化學(xué)和末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的脫氧尿苷三磷酸缺口末端標(biāo)記(Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated deoxyuridine triphosphate nick-end labeling,TUNEL)法研究宮內(nèi)發(fā)育遲緩對(duì)豬胎盤細(xì)胞增殖及凋亡的影響,同時(shí)應(yīng)用熒光定量PCR和蛋白免疫印跡等技術(shù),研究宮內(nèi)發(fā)育遲緩對(duì)豬胎盤抗氧化基因及蛋白表達(dá)的影響,為深入研究胎盤發(fā)育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)樣本

從江蘇鎮(zhèn)江丹陽市采集剛分娩的豬胎盤,部分胎盤組織置液氮速凍后,于-80 ℃冰箱中保存,用于提取蛋白質(zhì)和RNA;部分胎盤組織置4%多聚甲醛溶液中固定。根據(jù)Hu等[8]的研究結(jié)果將胎盤分為對(duì)照組和宮內(nèi)發(fā)育遲緩組。

1.2 主要試劑與器材

Trizol購自TaKaRa,TUNEL-BrightRed凋亡檢測(cè)試劑盒購自南京諾唯贊,鼠抗PCNA購自Abcam(AB29),SABC免疫組化試劑盒(羊抗兔/鼠)購自武漢博士德,HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG(SA00001-2)和羊抗小鼠IgG(SA00001-1)購自Proteintech。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 免疫組織化學(xué)法分析胎盤細(xì)胞增殖

采用SABC法測(cè)定胎盤細(xì)胞增殖。具體方法如下:胎盤樣品室溫固定24 h,經(jīng)過一系列濃度梯度的乙醇和二甲苯分別脫水和透化處理,石蠟包埋,切成5 μm厚度的組織切片,置于經(jīng)3-氨丙基三乙氧基硅烷處理之后的玻片上,于37 ℃烘片機(jī)烘24 h。制作好的石蠟切片再經(jīng)系列濃度梯度的二甲苯和乙醇分別脫蠟和水化處理,流水沖洗后,浸在預(yù)熱的檸檬酸鈉中繼續(xù)煮沸修復(fù)抗原,冷卻后流水沖洗5 min。用含甲醇和30% H2O2的PBS溶液裂解細(xì)胞并滅活內(nèi)源性過氧化氫酶。洗凈后,用5%(體積分?jǐn)?shù))的小牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)封閉1 h,加PCNA一抗(鼠抗,1∶10 000稀釋),4 ℃孵育過夜。以PBS緩沖液代替一抗作為陰性對(duì)照。取出后用PBS洗3次,每次5 min,加入生物素標(biāo)記的兔抗IgG抗體(1∶100 稀釋),室溫孵育2 h,再洗凈與SABC試劑反應(yīng)1 h,3,3-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色2 min,在顯微鏡下掌握染色深淺程度,流水沖洗5 min,蘇木素復(fù)染,脫水透明,封片。顯微鏡下觀察,有棕黃色者為陽性,使用尼康相機(jī)(Nikon YS100)采集圖像。

1.4 TUNEL法檢測(cè)胎盤細(xì)胞凋亡

參照J(rèn)iang等[9]的方法,采用TUNEL-BrightRed凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)胎盤細(xì)胞凋亡。對(duì)胎盤石蠟切片進(jìn)行脫蠟,再水化,在室溫下用蛋白酶K(20 μg·mL-1)孵育20 min;在黑暗環(huán)境下用含雙蒸水的重組末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(terminal deoxyribonucleotidyl transferase,TdT)緩沖液、平衡緩沖液、亮紅色標(biāo)記混合液和TdT酶在37 ℃孵育60 min;用DAPI染色5 min。陰性對(duì)照按上述方法進(jìn)行,但不孵育TdT酶緩沖液,以確保試驗(yàn)中不出現(xiàn)非特異性反應(yīng)。通過LSM900共聚焦激光掃描顯微鏡掃描獲得圖像。用Image Pro Plus 6.0軟件計(jì)算凋亡細(xì)胞數(shù)(紅色)和總細(xì)胞數(shù)(藍(lán)色)。凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.5 RT-PCR分析胎盤抗氧化相關(guān)基因mRNA表達(dá)

使用Trizol試劑提取胎盤總RNA,檢測(cè)其完整性。采用超微量分光光度計(jì)確定總RNA濃度和純度后,用DEPC水將RNA濃度統(tǒng)一配制至500 ng·μL-1。反轉(zhuǎn)錄(RT):用20 μL反應(yīng)體系,參照TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書的方法操作。反轉(zhuǎn)錄條件:37 ℃ 15 min,85 ℃ 5 s。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA保存于-20 ℃待用。qPCR基因引物序列見表1(由上海生工公司設(shè)計(jì)并合成)。采用20 μL qPCR 反應(yīng)體系:SYBR 10 μL,DEPC水6.8 μL,上、下游引物各0.4 μL,Rox參考染料(50×)0.4 μL,cDNA模板2 μL。qPCR反應(yīng)程序:95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s,60 ℃ 1 s,40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品各3個(gè)重復(fù)。以β-actin作為內(nèi)參基因,以對(duì)照(Con)組目的基因的表達(dá)為基準(zhǔn),用2-ΔΔCT法計(jì)算各目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)所用引物序列Table 1 The primer sequences for RT-qPCR

1.6 用Western blot技術(shù)分析胎盤抗氧化相關(guān)蛋白表達(dá)

用RIPA裂解法提取胎盤組織總蛋白,BCA法測(cè)定蛋白濃度。在每份蛋白樣品中加入等量的5×SDS上樣緩沖液,將樣品及蛋白標(biāo)準(zhǔn)品加入加樣孔中,70 V電泳40 min,然后90 V電泳約1.5 h,至目的條帶跑到理想位置。根據(jù)蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的指示標(biāo)記,將目標(biāo)膠塊切下,裁剪合適大小的PVDF膜,在甲醇中浸泡 1 min 后,通過濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,轉(zhuǎn)膜電壓70 V,時(shí)間70 min。封閉:將PVDF膜取出,TBST清洗3次后加入適量5% BSA,置于搖床上,室溫孵育2 h;加入一抗,4 ℃過夜(一抗NRF2購自 Proteintech,HO-1購自Abcam公司,β-actin抗體購自Proteintech公司);用TBST在搖床上清洗膜3次,加入適量二抗,置于搖床上室溫孵育2 h。顯影:使用ECL發(fā)光液浸泡PVDF膜,再放于熒光成像儀(Bio-Rad)下曝光并拍照。應(yīng)用Image J軟件進(jìn)行灰度分析。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

2 結(jié)果與分析

2.1 宮內(nèi)發(fā)育遲緩對(duì)豬胎盤細(xì)胞增殖的影響

增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)是一種參與調(diào)控細(xì)胞周期的核蛋白,在增殖細(xì)胞中特異性表達(dá),細(xì)胞核內(nèi)PCNA的表達(dá)水平高低與細(xì)胞增殖活性密切相關(guān)[10-11]。PCNA在胎盤細(xì)胞中的表達(dá)采用棕黃色顯示,結(jié)果如圖1所示,對(duì)照組(Con)可以觀察到較強(qiáng)的PCNA的免疫染色,宮內(nèi)發(fā)育遲緩組PCNA染色較弱。說明對(duì)照組與宮內(nèi)發(fā)育遲緩豬胎盤細(xì)胞相比,細(xì)胞增殖活力較強(qiáng)[12]。

圖1 宮內(nèi)發(fā)育遲緩(IUGR)對(duì)豬胎盤細(xì)胞增殖的影響Fig.1 Effect of intrauterine growth retardation(IUGR)on proliferation of porcine placental cells

2.2 宮內(nèi)發(fā)育遲緩對(duì)豬胎盤細(xì)胞凋亡的影響

應(yīng)用TUNEL法檢測(cè)胎盤細(xì)胞凋亡,胎盤細(xì)胞凋亡用紅色表示。從圖2可見:IUGR組和Con組細(xì)胞凋亡率分別為19.63%與12.56%,IUGR組細(xì)胞凋亡率明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。

圖2 宮內(nèi)發(fā)育遲緩對(duì)豬胎盤細(xì)胞凋亡影響的染色觀察(A)和統(tǒng)計(jì)分析(B)Fig.2 Effect of IUGR on apoptosis of porcine placental cells with staining(A)and statistical analysis(B)*P<0.05. 下同The same below.

2.3 宮內(nèi)發(fā)育遲緩對(duì)豬胎盤抗氧化相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響

從圖3可見:與對(duì)照組相比,宮內(nèi)發(fā)育遲緩豬胎盤NRF2、NQO1、SOD1、SOD2、GCLC和GCLMmRNA的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05),HO-1mRNA的表達(dá)在正常豬胎盤和宮內(nèi)發(fā)育遲緩豬胎盤組間差異不顯著。

圖3 宮內(nèi)發(fā)育遲緩對(duì)豬胎盤抗氧化基因mRNA表達(dá)水平的影響Fig.3 Effect of IUGR on mRNA expression of antioxidant gene in porcine placenta

2.4 宮內(nèi)發(fā)育遲緩對(duì)豬胎盤抗氧化相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

應(yīng)用Western blot技術(shù)檢測(cè)宮內(nèi)發(fā)育遲緩對(duì)豬胎盤細(xì)胞抗氧化蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果如圖4所示:對(duì)照組與宮內(nèi)發(fā)育遲緩組NRF2和HO-1蛋白相對(duì)表達(dá)水平差異不顯著。

圖4 宮內(nèi)發(fā)育遲緩對(duì)豬胎盤抗氧化蛋白表達(dá)水平的影響Fig.4 Effect of IUGR on the expression level of antioxidant protein in porcine placenta

3 討論

3.1 宮內(nèi)發(fā)育遲緩對(duì)豬胎盤細(xì)胞增殖的影響

哺乳動(dòng)物胎盤不僅是母體和胎兒營養(yǎng)物質(zhì)交換的場所,同時(shí)也是胎兒代謝物排泄的場所[13]。胎盤發(fā)育異常將導(dǎo)致自然流產(chǎn)、先兆子癇、宮內(nèi)發(fā)育遲緩和葡萄胎等妊娠性疾病的發(fā)生發(fā)展。胎盤細(xì)胞的發(fā)育和功能依賴于細(xì)胞增殖與細(xì)胞死亡之間的平衡。Alqaryyan等[14]研究發(fā)現(xiàn),由地塞米松誘導(dǎo)的宮內(nèi)發(fā)育遲緩大鼠胎盤PCNA的表達(dá)顯著降低。de Unek等[15]研究發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組相比,IUGR組基底膜和絨毛膜中PCNA染色強(qiáng)度顯著下降。本試驗(yàn)的免疫組化染色結(jié)果顯示,宮內(nèi)發(fā)育遲緩豬胎盤PCNA的表達(dá)顯著下降,與上述結(jié)果相似,這可能是導(dǎo)致IUGR仔豬初生體重顯著降低的原因之一。

3.2 宮內(nèi)發(fā)育遲緩對(duì)豬胎盤細(xì)胞凋亡的影響

細(xì)胞凋亡作為維系器官細(xì)胞正常新陳代謝和器官正常生理功能的生物學(xué)現(xiàn)象,貫穿于胎盤發(fā)育的整個(gè)過程,對(duì)維持胎盤生長發(fā)育和生理功能至關(guān)重要[16]。IUGR與胎盤細(xì)胞過度凋亡密切相關(guān)[17]。筆者前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),由低蛋白日糧誘導(dǎo)的IUGR小鼠胎盤細(xì)胞顯著凋亡[18]。肖超群等[16]也通過低蛋白飲食喂養(yǎng)、皮下注射尼古丁及自然選擇的方法建立3種IUGR大鼠模型,結(jié)果發(fā)現(xiàn)3種因素所致大鼠胎兒生長受限胎盤細(xì)胞凋亡率均顯著升高。陳華等[19]采用HE染色和TUNEL等方法研究發(fā)現(xiàn)IUGR胎盤組織明顯發(fā)生凋亡。本試驗(yàn)中,IUGR胎盤細(xì)胞顯著凋亡,與前人研究結(jié)果相似。這些結(jié)果提示豬胎盤細(xì)胞凋亡可能是胎兒發(fā)生IUGR的原因之一。

3.3 宮內(nèi)發(fā)育遲緩對(duì)豬胎盤細(xì)胞抗氧化基因表達(dá)的影響

NRF2信號(hào)通路涉及多種代謝和抗氧化酶的調(diào)控,這些酶參與調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激和凋亡[20]。當(dāng)細(xì)胞處于穩(wěn)定狀態(tài)下,NRF2穩(wěn)定表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)中,并與組蛋白結(jié)合,其中包括胞漿抑制劑Keap1。當(dāng)受到刺激時(shí),它與Keap1分離,并游離到細(xì)胞核中與ARE結(jié)合,以調(diào)節(jié)下游抗氧化基因(SOD1、GCLC和GCLM)的轉(zhuǎn)錄[21]。SOD2位于線粒體基質(zhì)內(nèi),線粒體基質(zhì)是電子傳遞鏈產(chǎn)生超氧自由基的主要場所。SOD2介導(dǎo)的線粒體內(nèi)超氧陰離子向過氧化氫的轉(zhuǎn)化可以促進(jìn)過氧化氫從線粒體基質(zhì)中釋放,從而避免能量產(chǎn)生部位的氧自由基過多[22-23]。NRF2是機(jī)體抗氧化應(yīng)激的中樞調(diào)節(jié)者,在參與細(xì)胞抗氧化應(yīng)激和外源性有毒物質(zhì)誘導(dǎo)的防御機(jī)制中發(fā)揮重要作用[24]。當(dāng)其在體內(nèi)被有毒有害物質(zhì)激活后進(jìn)入細(xì)胞核與抗氧化反應(yīng)元件結(jié)合形成NRF2-ARE信號(hào)通路,使下游一系列起到保護(hù)機(jī)體的Ⅱ相解毒酶和抗氧化酶基因及蛋白表達(dá),包括HO-1、NQO1和SOD1等[25]。HO-1是該通路中發(fā)揮功能的主要酶,可以在體內(nèi)中和過量的亞鐵血紅素,從而在一定程度上緩解機(jī)體的氧化應(yīng)激[26]。筆者前期研究發(fā)現(xiàn),由低蛋白飲食誘導(dǎo)的IUGR小鼠胎盤NRF2和HO-1mRNA的表達(dá)量也顯著降低[18]。Kweider等[27]報(bào)道,NRF2敲除小鼠胎兒的體重顯著降低,表明NRF2對(duì)胎兒生長發(fā)育具有重要作用。本研究結(jié)果顯示,IUGR豬胎盤NRF2、SOD2、GCLC和GCLM的表達(dá)量顯著降低,與前人研究結(jié)果相似。因此,我們推測(cè)胎盤抗氧化基因表達(dá)量顯著降低也可能導(dǎo)致胎兒IUGR發(fā)生。

綜上,IUGR組豬胎盤PCNA表達(dá)量顯著降低,細(xì)胞凋亡率升高,且抗氧化基因表達(dá)量顯著降低,導(dǎo)致IUGR豬胎盤易發(fā)生氧化應(yīng)激,這可能是導(dǎo)致仔豬出生體重低的原因之一。