低聚木糖和包膜丁酸鈉對肉雞腸道發(fā)育、腸黏膜免疫功能和盲腸微生物組成的影響

羅丹,李蛟龍,邢通,張林,高峰

(南京農(nóng)業(yè)大學動物科技學院/江蘇省動物源食品生產(chǎn)與安全保障重點實驗室/江蘇省肉類生產(chǎn)與加工質量安全控制協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇 南京 210095)

腸道是機體具有消化、吸收和免疫防御雙重功能的器官,在機體和腸腔內容物間起著重要的屏障作用。腸黏膜免疫和腸道菌群是腸道健康的重要組成部分,腸黏膜免疫屏障主要由相關免疫細胞和細胞因子構成[1]。在當前我國飼料中禁用抗生素的背景下,在日糧中添加營養(yǎng)調控劑來增強腸道黏膜免疫功能、改善腸道菌群是提高肉雞抗病力的一種重要手段。

低聚木糖(xylo-oligosaccharides,XOS)是一種具有益生元活性的功能性寡糖,具有調節(jié)血糖、降血脂、優(yōu)化腸道菌群等生理活性功能[2-3],已被廣泛應用于畜禽飼料中。低聚木糖具有選擇性促進有益菌、刺激免疫系統(tǒng)、促進免疫細胞增殖分化及抑制炎癥等功能[4-5]。研究發(fā)現(xiàn)日糧中添加低聚木糖可提高肉雞平均日增重、促進雙歧桿菌的生長,降低炎癥因子的表達[6-7]。丁酸鈉作為一種重要的有機酸添加劑,在動物機體中具有類似抗生素的預防疾病及促生長作用,且安全、無殘留。目前,丁酸鈉不僅可為腸上皮細胞提供能源,還可降低腸道pH值、抑制有害菌生長繁殖、增強腸黏膜免疫等[8-9]。有研究表明,日糧中添加丁酸鈉可促進肉雞生長、腸道發(fā)育及腸道杯狀細胞數(shù)量,調節(jié)腸道菌群[10-12]。包膜丁酸鈉(coated sodium butyrate,CSB)可減少丁酸本身具有的刺鼻氣味,在腸道進行緩慢釋放,相比未包被的丁酸鈉具有更穩(wěn)定的效果。

低聚木糖和丁酸鈉對腸道的主要作用機制不同,但具有相似效果:均可影響腸道相關細胞增殖,發(fā)揮抗炎效果,促進腸道有益菌的增殖。同時,有研究表明在斷奶仔豬日糧中添加低聚木糖和丁酸鈉組合對生長性能的促進效果和腸道菌群的調節(jié)效果優(yōu)于對照組和單獨添加,同時可提高腸道sIgA的分泌量[13]。目前,關于低聚木糖和丁酸鈉對家禽影響的研究多為單一組分,有關其聯(lián)合添加對肉雞腸道黏膜免疫的應用研究報道較少。因此本試驗旨在研究低聚木糖、包膜丁酸鈉單獨或聯(lián)合添加對肉雞腸道發(fā)育、黏膜免疫及腸道菌群的影響,為其在肉雞生產(chǎn)中科學應用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

低聚木糖(XOS),含量35%,購于江蘇康維生物有限公司;包膜丁酸鈉(CSB),含量30%,購于杭州康德權飼料有限公司;羅斯308肉雞,購買于江蘇圣農(nóng)禽業(yè)發(fā)展有限公司。

1.2 試驗設計與飼養(yǎng)管理

本試驗采取2×2雙因素試驗設計,選取192只1日齡健康狀況良好、體重相近的羅斯308公雛雞,隨機分為4組,每組6個重復,每個重復8只雞。4個分組:1)對照組(Con):基礎日糧;2)XOS組:基礎日糧+150 mg·kg-1XOS;3)CSB組:基礎日糧+400 mg·kg-1CSB;4)XOS+CSB:基礎日糧+150 mg·kg-1XOS+400 mg·kg-1CSB(XOS和CSB的添加水平參照文獻[14-15]。試驗期42 d?；A日糧為玉米-豆粕型日糧,參照NRC(1994)標準配制,料型為粉料。日糧配方組成及營養(yǎng)水平見表1。飼養(yǎng)期內自由采食,自由飲水。試驗雞按常規(guī)免疫程序進行免疫。

表1 基礎日糧組成及營養(yǎng)水平Table 1 Ingredient composition and nutrient contents of basal diet %

1.3 樣品采集

于試驗42 d時,每個重復分別選取2只體重接近該重復平均體重的肉雞,頸靜脈放血致死,剖開腹腔,分離小腸(十二指腸、空腸、回腸)并測定其長度。截取3段小腸中間約1 cm腸段,用生理鹽水洗凈食糜后,放于4%多聚甲醛固定液中用于制作石蠟切片,然后擠出腸道食糜,稱重。將空腸、回腸剪開,用生理鹽水沖洗干凈后,刮取黏膜放入凍存管中于-80 ℃保存待測。

1.4 測定指標與方法

1.4.1 腸道指數(shù)腸道指數(shù)計算公式:腸道相對長度(cm·kg-1)=各腸段長度(cm)/活體重(kg);腸道相對質量(g·kg-1)=各腸段質量(g)/活體重(kg);單位長度質量(g·cm-1)=各段小腸質量(g)/各段小腸長度(cm)。

1.4.2 小腸上皮內淋巴細胞(IEL)和IgA陽性(IgA+)細胞數(shù)量參照Wang等[16]的研究,采用蘇木精和伊紅染色觀察上皮內淋巴細胞(intestinal intraepithelial lymphocyte,IEL)。在顯微鏡下觀察、拍照,每組觀察12張切片,每張切片選取5根絨毛,數(shù)出100個柱狀上皮細胞中IEL的數(shù)量,取平均值。對于IgA陽性(IgA-producing,IgA+)細胞,參照Wang等[16]的方法,制作好石蠟切片后用免疫組化方法進行染色,抗體采用鼠抗兔單克隆抗體(#8330-01,Southern Biotechnology Inc.,AL)。利用顯微鏡觀察,拍照,每組12張切片,每張切片選取5根絨毛,采用Image-Pro Plus 6.0軟件測量每根絨毛固有層的面積,并對固有層中IgA+細胞(IgA+細胞是由黃褐色細胞質包圍的顆粒,主要分布在黏膜固有層)進行計數(shù),取均值,計算IgA+細胞密度。

1.4.3 腸道RNA提取與熒光定量PCR檢測采用Trizol試劑提取空腸、回腸黏膜總RNA,用超微量分光光度計檢測RNA的純度和濃度。將RNA濃度統(tǒng)一為500 ng·μL-1后,根據(jù)反轉錄試劑盒說明書,將RNA反轉錄成cDNA。引物由上海生工合成。引物序列見表2。

表2 熒光定量PCR引物序列Table 2 Primer sequence used for real-time PCR

熒光定量PCR檢測依據(jù)TB Green?PremixExTaqTM試劑盒說明書進行操作。反應體系為20 μL:ROX Reference Dye Ⅱ(50×)0.4 μL,上、下游引物各0.4 μL,cDNA 1 μL,ddH2O 7.8 μL,SYBRPremixExTaqⅡ(2×)10 μL。反應程序:95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,40個循環(huán);95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min,95 ℃ 15 s。內參基因為β-actin。每個樣品重復3次,取平均值,參照2-ΔΔCT法[17]分析相關基因mRNA的表達水平。

1.4.4 盲腸微生物測定稱取0.4 g盲腸食糜,采用CTAB法提取細菌的總DNA并構建質粒。采用超微量分光光度計測定提取細菌總DNA濃度和質量后,參照劉壯等[18]的方法,采用CFX 96儀(Bio-Rad,美國)進行定量分析。微生物引物見表3。將質粒進行10倍梯度稀釋建立標準曲線。反應體系20 μL:ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix(2×)10 μL,DNA模板2 μL,上、下游引物各0.4 μL,ddH2O 7.2 μL。PCR擴增程序:95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,40個循環(huán);95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min,95 ℃ 15 s。結果表示為每克盲腸食糜中細菌拷貝數(shù)的對數(shù)(lg[copies·g-1])。

表3 盲腸微生物引物序列Table 3 Primers for quantification real-time PCR of cecal microorganisms

1.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

2 結果與分析

2.1 低聚木糖(XOS)和包膜丁酸鈉(CSB)對肉雞小腸指數(shù)的影響

由表4 可知:添加XOS對小腸的相對長度、相對質量及單位長度質量均無顯著影響(P>0.05);添加CSB可顯著降低十二指腸和回腸的相對長度(P<0.05),并顯著提高十二指腸、空腸、回腸的單位長度質量(P<0.05)。聯(lián)合添加XOS和CSB對回腸的單位長度質量有顯著交互作用(P<0.05),XOS+CSB組回腸單位長度質量顯著高于對照組和XOS、CSB組(P<0.05)。

表4 低聚木糖(XOS)和包膜丁酸鈉(CSB)對肉雞小腸指數(shù)的影響Table 4 Effects of xylo-oligosaccharides(XOS)and coated sodium butyrate(CSB)on the intestine index of broilers

2.2 低聚木糖和包膜丁酸鈉對肉雞小腸上皮內淋巴細胞(IEL)數(shù)量的影響

如圖1所示:添加XOS顯著增加了空腸和回腸的IEL數(shù)量(P<0.05),添加CSB顯著增加十二指腸、空腸、回腸的IEL數(shù)量(P<0.05)。同時,添加XOS和CSB對回腸IEL數(shù)量存在顯著的交互作用,與對照組相比,XOS、CSB和XOS+CSB組均顯著增加IEL數(shù)量;CSB組、XOS+CSB組相比XOS組,IEL數(shù)量顯著增加(P<0.05)。

圖1 低聚木糖(XOS)和包膜丁酸鈉(CSB)處理后肉雞小腸上皮內淋巴細胞(IEL,↑)的染色觀察(A)和統(tǒng)計(B)Fig.1 The staining observation(A)and statistical number(B)of intraepithelial lymphocytes(IEL,↑)in small intestine of broilers treated with xylo-oligosaccharides(XOB)and coated sodium butyrate(CSB) PXOS、PCSB分別表示XOS和CSB為主效應的P值,Pint表示互作效應的P值;當P<0.05時差異顯著。下同。The PXOS and PCSB mean the main effect of XOS and CSB,respectively. Pint means an interactive effect between XOS and CSB,and P<0.05 mean significant difference. The same below.

2.3 低聚木糖和包膜丁酸鈉對肉雞小腸固有層IgA+細胞數(shù)量的影響

如圖2所示:添加XOS顯著增加空腸固有層中IgA+細胞數(shù)量(P<0.05);添加CSB顯著增加十二指腸、回腸固有層中IgA+細胞數(shù)量(P<0.05)。聯(lián)合添加XOS和CSB對小腸固有層中IgA+細胞數(shù)量無顯著的交互作用,但XOS、CSB和XOS+CSB組相比對照組均提高固有層中IgA+細胞數(shù)量。

圖2 低聚木糖(XOS)和包膜丁酸鈉(CSB)處理后肉雞小腸固有層IgA+細胞(↑)的染色觀察(A)和統(tǒng)計(B)Fig.2 The staining observation(A)and statistical number(B)of IgA+ cells(↑)in small intestine of broilers treated with xylo-oligosaccharides(XOS)and coated sodium butyrate(CSB)

2.4 低聚木糖和包膜丁酸鈉對肉雞空腸、回腸黏膜免疫因子mRNA表達的影響

如圖3所示:添加XOS可顯著降低空腸和回腸IFN-γmRNA表達水平(P<0.05);添加CSB可顯著降低空腸IL-1β和回腸IL-1β、IFN-γmRNA表達水平(P<0.05)。聯(lián)合添加XOS和CSB對回腸IL-1βmRNA表達水平有顯著的交互作用,相比對照組,XOS、CSB、XOS+CSB組IL-1βmRNA表達水平顯著降低(P<0.05)。

圖3 低聚木糖(XOS)和包膜丁酸鈉(CSB)對肉雞空腸和回腸黏膜細胞因子mRNA表達的影響Fig.3 Effects of xylo-oligosaccharides(XOS)and coated sodium butyrate(CSB)on the mRNA expression of cytokines in jejunum and ileum of broilers

2.5 低聚木糖和包膜丁酸鈉對肉雞腸黏膜TLR2、MyD88和NF-κB mRNA表達的影響

如圖4所示:日糧單獨添加XOS可顯著降低空腸和回腸TLR2mRNA的表達水平(P<0.05),對MyD88、NF-κBmRNA表達水平無顯著影響(P>0.05)。

圖4 低聚木糖(XOS)和包膜丁酸鈉(CSB)對肉雞腸黏膜TLR2、MyD88和NF-κB mRNA表達的影響Fig.4 Effects of xylo-oligosaccharides(XOS)and coated sodium butyrate(CSB)on the mRNA expression of TLR2,MyD88 and NF-κB in jejunum and ileum of broilers

2.6 低聚木糖和包膜丁酸鈉對肉雞盲腸菌群數(shù)量的影響

由表5可知:XOS可顯著增加盲腸中總菌和雙歧桿菌數(shù)量(P<0.05),但XOS和CSB及其互作對乳酸桿菌和大腸桿菌數(shù)量均無顯著影響(P>0.05)。CSB對雙歧桿菌有增加的趨勢(0.05

表5 低聚木糖(XOS)和包膜丁酸鈉(CSB)對肉雞盲腸菌群的影響Table 5 Effects of xylo-oligosaccharides(XOS)and coated sodium butyrate(CSB) on the cecal microorganism of broilers lg[copies·g-1]

3 討論

腸道是影響機體健康的重要器官,其發(fā)育狀況會對肉雞的生長性能和健康產(chǎn)生影響。本研究結果表明,添加CSB可顯著降低十二指腸和回腸長度,同時可顯著增加小腸的單位長度質量。單位長度質量的增加可能與促進腸道絨毛和腸黏膜細胞的發(fā)育有關。本課題組前期研究結果顯示,XOS、CSB及聯(lián)合使用均可改善小腸絨毛形態(tài)結構,同時在回腸存在互作效應[19]。另有研究發(fā)現(xiàn),XOS可降低隱窩深度,從而改善腸絨毛形態(tài)[20]。丁酸鈉可被腸細胞利用促進肉雞腸道發(fā)育[21]。XOS和CSB對回腸單位長度質量存在顯著交互效應,聯(lián)合添加效果優(yōu)于單獨使用,與小腸絨毛形態(tài)結果一致,具有一定的協(xié)同作用。這可能歸因于XOS被微生物利用后產(chǎn)生短鏈脂肪酸,可與丁酸鈉一同作為腸上皮能源,進一步促進了回腸發(fā)育。同時有研究表明,腸道質量或長度的減少,可以減小維持需要的能量,可能有利于飼料轉化率的提高[22]。本課題組前期結果表明,XOS、CSB和XOS+CSB組增加了肉雞平均增重,降低了料重比[19]。推測XOS和CSB通過減少肉雞腸道維持需要,促進腸道黏膜發(fā)育,改善生長性能。

腸道黏膜作為抵御外來病原的第一道防線[23],其功能會受相關免疫細胞及免疫因子調節(jié)。IEL是位于腸上皮細胞之間的淋巴細胞群,是腸黏膜免疫系統(tǒng)中最先接觸穿過腸上皮的外來抗原的免疫活性細胞[24]。分泌型免疫球蛋白A(secretory immunoglobulin A,sIgA)是腸黏膜分泌的主要抗體類別,可以防止病原體黏附和進入腸道屏障,主要由腸上皮黏膜內的IgA+細胞分泌[25]。因此,IEL和IgA+細胞數(shù)量是評估腸黏膜免疫功能的重要指標。本研究發(fā)現(xiàn)添加XOS可顯著增加空腸、回腸的IEL數(shù)量,同時增加空腸IgA+細胞數(shù)量,對回腸IgA+細胞數(shù)量有增加的趨勢。Sais等[26]指出,IEL的增加反映了腸道黏膜反應的激活,以抵御外來病原的入侵。也有研究表明,日糧中添加低聚木糖可提高IL-2mRNA水平,降低IL-6mRNA水平[7,27]。同時Sun等[28]發(fā)現(xiàn)IEL可通過產(chǎn)生細胞因子(如IL-2、IL-10和IFN-γ等),誘導細胞凋亡來發(fā)揮免疫調節(jié)作用。Mantis等[29]報道sIgA可受到具有免疫活性的細胞因子的調節(jié)。因此低聚木糖作為外來抗原佐劑,通過刺激腸道免疫,影響IEL的增殖分化并調節(jié)細胞因子的合成分泌,從而影響IgA+細胞的數(shù)量。本試驗結果表明,CSB顯著提高小腸黏膜的IEL細胞數(shù)量及十二指腸、回腸的IgA+細胞數(shù)量,與劉麗華[30]的研究結果相似。劉麗華[30]在1日齡AA肉雞日糧中分別添加250和500 mg·kg-1丁酸鈉,飼喂21 d可顯著提高肉仔雞腸道IEL數(shù)量及sIgA水平,這可能與CSB在腸道解離為丁酸后促進腸黏膜細胞的發(fā)育有關。本研究結果顯示,XOS和CSB對回腸的IEL數(shù)量有顯著互作效應,聯(lián)合添加組與CSB組效果相當,且較XOS組有明顯提高,說明二者聯(lián)合對腸黏膜免疫細胞增殖分化的促進作用優(yōu)于單獨添加XOS,可改善腸黏膜免疫功能。但相比單獨添加CSB有所降低,不具有明顯的協(xié)同促進效果。在空腸,聯(lián)合添加組效果最好,而十二指腸和回腸的趨勢相同。這可能與兩者在不同腸段的聯(lián)合添加水平有關。

細胞因子作為免疫調節(jié)的重要組成成分,在腸道黏膜免疫中發(fā)揮著重要的調節(jié)作用。IFN-γ具有抗病毒、調節(jié)細胞免疫應答的功能,同時也在炎癥反應發(fā)揮重要作用[31]。Yuan等[32]研究表明,日糧中添加XOS可下調脂多糖誘導的腫瘤壞死因子α、IFN-γ的表達水平,提高肉雞的免疫功能。在本試驗中,添加XOS可顯著降低空腸及回腸IFN-γ的表達水平,這歸因于XOS可能刺激淋巴細胞的增殖分化,通過影響細胞免疫應答過程,抑制IFN-γ表達,發(fā)揮抗炎作用。IL-1β、IL-6表達水平的升高常伴隨著腸道屏障功能受損。IL-10是一種關鍵的抗炎細胞因子,可抑制Th1細胞的免疫應答和IL-1β、IL-6的產(chǎn)生,發(fā)揮抗炎作用[33-35]。本試驗中,日糧添加CSB可顯著降低空腸IL-1β、回腸IL-1β和IFN-γmRNA表達水平,同時XOS和CSB的添加均一定程度上提高IL-10mRNA表達水平,與Zou等[36]在黃羽肉雞中添加300 mg·kg-1丁酸鈉的研究結果相似。這可能是因為丁酸鈉在腸道解離為丁酸后,其作為組蛋白去乙酰化酶抑制劑,通過誘導調節(jié)性T細胞的分化和促進IL-10的生成產(chǎn)生抗炎效果[37]。聯(lián)合添加XOS和CSB對回腸IL-1βmRNA表達存在顯著的互作效應,聯(lián)合添加組的IL-1βmRNA表達水平比對照組顯著降低,但相比單一添加無顯著差異,說明XOS和CSB 聯(lián)合添加對抑制促炎因子的生成有積極作用,但無顯著協(xié)同效果。TLR2介導的免疫應答可產(chǎn)生多種細胞因子,如TNF-α、IL-1β、IL-6等[38]。本試驗研究結果顯示,添加XOS可顯著下調TLR2mRNA表達水平,且所有添加劑組中TLR2mRNA表達水平均下降,其抗炎機制可能與影響TLR2介導的腸黏膜免疫屏障功能有關。

腸道菌群的穩(wěn)定對腸道健康和功能至關重要。本研究中,XOS可顯著提高盲腸的雙歧桿菌數(shù)量,CSB對盲腸雙歧桿菌數(shù)量有增加的趨勢。雖然XOS不能被肉雞消化吸收,但可作為營養(yǎng)物質被雙歧桿菌利用;此外,CSB的添加可降低腸道pH值,促進雙歧桿菌的生長繁殖。同樣,Ding等[7]報道,日糧中添加不同濃度梯度的XOS(0.01%～0.05%)均可顯著增加蛋雞盲腸的雙歧桿菌數(shù)量。Wu等[39]發(fā)現(xiàn),在高放養(yǎng)密度肉雞日糧中添加500 mg·kg-1的丁酸鈉可增加盲腸的乳酸桿菌和雙歧桿菌的豐度。在本研究中,相比對照組,XOS、CSB和XOS+CSB組均可增加盲腸中乳酸桿菌數(shù)量,說明添加XOS和CSB可通過促進乳酸桿菌的生長進一步改善腸道環(huán)境,從而影響腸道菌群的變化。周建[13]報道XOS和丁酸鈉聯(lián)合使用后,斷奶仔豬盲腸內的雙歧桿菌、乳酸桿菌數(shù)量顯著增加,大腸桿菌數(shù)量減少,但二者不存在互作效應,本研究結果與之類似。說明二者聯(lián)合使用效果可能受到不同動物及不同添加水平的影響。腸道免疫系統(tǒng)與腸道微生物間有著復雜的關系,腸道共生菌群可通過Toll樣受體途徑有效抑制腸道炎癥反應,增強機體免疫[40]。此外,在本試驗中,添加XOS后總菌數(shù)量顯著增加,大腸桿菌的數(shù)量無顯著變化。以上結果表明,XOS和CSB可通過促進腸道有益菌的生長,影響腸道菌群的組成,刺激腸黏膜相關免疫,從而發(fā)揮免疫調節(jié)作用,保護腸道健康。

綜上所述,飼糧中單獨添加低聚木糖、包膜丁酸鈉或聯(lián)合使用均能促進肉雞腸道發(fā)育,增加腸黏膜上皮內淋巴細胞和IgA+細胞的數(shù)量,調節(jié)腸黏膜細胞因子mRNA的表達;同時促進腸道有益菌增殖,改善腸黏膜免疫功能。此外,150 mg·kg-1低聚木糖和400 mg·kg-1包膜丁酸鈉對回腸發(fā)育和上皮內淋巴細胞存在互作效應,但對腸黏膜免疫未表現(xiàn)出明顯的協(xié)同效應。