堆型艾美耳球蟲微線蛋白3及其結(jié)構(gòu)域蛋白的免疫保護(hù)作用

劉佳斌,張楊,王茗悅,黃劍梅,靖傳旭,宋小凱,徐立新,嚴(yán)若峰,李祥瑞

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,江蘇 南京 210095)

雞球蟲病(Coccidiosis)是由頂復(fù)門艾美耳屬(Eimeria)的球蟲寄生于雞的腸道引起的重要寄生性原蟲病[1],其在世界范圍內(nèi)對養(yǎng)禽業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2],不同艾美球蟲的寄生部位表現(xiàn)出高度的特異性[3],如堆型艾美耳球蟲專一寄生于雞的十二指腸,嚴(yán)重感染時可寄生于小腸中段,入侵并在腸上皮細(xì)胞內(nèi)發(fā)育。流行病學(xué)調(diào)查顯示,感染艾美耳球蟲雞的發(fā)病率和死亡率可以高達(dá)80%以上[4]。雞球蟲病每年在世界范圍內(nèi)對家禽養(yǎng)殖業(yè)所造成的損失高達(dá)約30億美元[5-6],引起的全球性獸醫(yī)衛(wèi)生問題被高度關(guān)注。目前世界上得到公認(rèn)的雞球蟲有7種,其中巨型艾美耳球蟲(Eimeriamaxima)、堆型艾美耳球蟲(E.acervulina)、柔嫩艾美耳球蟲(E.tenella)、毒害艾美耳球蟲(E.necatrix)在世界范圍內(nèi)危害較為嚴(yán)重[4]。

不斷發(fā)展的基因操作和基因測序技術(shù)為研究頂復(fù)門原蟲的微線蛋白(micronemes,MIC)功能提供了便利?，F(xiàn)有研究顯示MIC與雞艾美耳球蟲入侵宿主靶細(xì)胞的能力相關(guān)[7-11]。雞艾美耳球蟲入侵宿主細(xì)胞的過程就是宿主上皮細(xì)胞的特異性受體與蟲體分泌釋出的微線蛋白的結(jié)合與脫離。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)[12]:堆型艾美耳球蟲的微線蛋白3(EaMIC3)能夠特異性結(jié)合十二指腸上皮細(xì)胞,且該蛋白對堆型艾美耳球蟲的入侵具有較好的免疫保護(hù)力;EaMIC3的7個微線蛋白黏附重復(fù)結(jié)構(gòu)域(microneme adhesive regions,MAR)中黏附重復(fù)結(jié)構(gòu)域3(EaMAR3)與雞十二指腸的結(jié)合能力最強(qiáng),而黏附重復(fù)結(jié)構(gòu)域6(EaMAR6)與十二指腸的結(jié)合能力較弱。因此,本研究對堆型艾美耳球蟲侵入過程中的關(guān)鍵蛋白MIC3及其結(jié)構(gòu)域蛋白進(jìn)行動物免疫保護(hù)試驗(yàn),對比EaMIC3蛋白和結(jié)構(gòu)域蛋白的免疫保護(hù)效果,為雞球蟲亞單位疫苗的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動物與蟲株

1日齡海蘭白蛋雞購自江蘇省海安市某雞場,新西蘭白兔購自江蘇省浦口萊芙養(yǎng)殖場。

E.acervulina江蘇分離株(JS strain)由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)寄生蟲病實(shí)驗(yàn)室分離、純化,保存于2.5 g·L-1重鉻酸鉀溶液中,于4 ℃放置,每5個月復(fù)蘇1次,確保卵囊的活性。

1.2 主要試劑

山羊抗兔IgG(Y)抗體購自BioWorld公司;弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、氨芐青霉素為南京生興公司產(chǎn)品;BSA購自DSBIO公司;His標(biāo)簽蛋白純化鎳柱為GE Healthcare公司產(chǎn)品;IPTG購自上海生工生物公司;TMB培養(yǎng)基購自Sigma公司;6× Protein Loading 購自Thermo scientific 公司。

1.3 重組蛋白EaMIC3、EaMAR3、EaMAR6的誘導(dǎo)表達(dá)及純化

按體積比1∶100的比例將含有pET-32a-EaMIC3、pET-32a-EaMAR3、pET-32a-EaMAR6質(zhì)粒的菌液和pET-32a菌液(本課題組張振超博士提供)分別接種至1 L含有50 μg·mL-1氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中,細(xì)菌培養(yǎng)至對數(shù)生長期(D600≈0.6),添加終濃度為1 mmol·L-1的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。離心后收集菌體沉淀,用PBS洗滌菌體3次,用上清結(jié)合緩沖液重懸沉淀,-20 ℃反復(fù)凍融3次后,超聲破碎。7 800 r·min-1離心15 min,上清液轉(zhuǎn)移至新的50 mL離心管,上清液用上清結(jié)合緩沖液重懸、沉淀用包涵體結(jié)合緩沖液重懸,4 ℃溶解過夜。分別取上清液和包涵體,加入5×蛋白樣上緩沖液,沸水浴中作用5～8 min,進(jìn)行SDS-PAGE。檢測上清液和包涵體的表達(dá)情況,以確定蛋白的表達(dá)部位。

包涵體結(jié)合緩沖液溶解的蛋白沉淀在4 ℃、7 800 r·min-1離心15 min,收集上清液,經(jīng)0.22 μm濾器過濾雜質(zhì)后,通過His標(biāo)簽蛋白純化柱(His-Trap FF)純化重組蛋白[12]。

1.4 重組蛋白EaMIC3、EaMAR3、EaMAR6多克隆抗體制備

將純化后的pET-32a標(biāo)簽蛋白、pET-32a-EaMIC3、pET-32a-EaMAR3、pET-32a-EaMAR6重組蛋白(500 μg)分別免疫2只6周齡的雄性健康新西蘭白兔,制備抗血清。初次免疫時,在乳化儀中加入蛋白和等量的弗氏完全佐劑,乳化10～15 min,采用背部多點(diǎn)法皮下注射。2周后,加入等量蛋白和弗氏不完全佐劑混勻后充分乳化,加強(qiáng)免疫1次,然后每周免疫1次。5次免疫后采用心臟采血法收集血液,分離血清,獲得多克隆抗體。

1.5 重組蛋白抗血清抗體效價檢測

多克隆抗體效價檢測:以3種重組蛋白和pET-32a標(biāo)簽蛋白分別為抗原包被ELISA板,每孔100 ng,用間接ELISA方法檢測兔抗重組蛋白血清的抗體效價。

免疫后雞血清中特異性抗體水平檢測:以pET-32a-EaMIC3為抗原包被ELISA板,將其溶于0.05 mol·L-1碳酸鹽溶液(pH9.6),調(diào)節(jié)其蛋白濃度為50 μg·mL-1,在96孔酶標(biāo)板中每孔加入100 μL,4 ℃過夜;棄去包被液,用PBST洗3次,每次5 min。每孔加入200 μL含5% BSA的PBST,37 ℃封閉1 h;棄去封閉液,用PBST洗滌3次,每孔加入100 μL 1∶50稀釋過的各待測血清樣品,37 ℃孵育2 h;棄去液體,用PBST洗滌3次,每孔添加100 μL封閉液稀釋過(1∶10 000)的HRP標(biāo)記的二抗,室溫反應(yīng)37 ℃ 1 h;棄去液體,用PBST洗滌3次,每孔添加100 μL TMB培養(yǎng)液,室溫避光5 min后,每孔添加100 μL 2 mol·L-1H2SO4,終止反應(yīng);放入酶標(biāo)儀檢測D450值。

1.6 堆形艾美耳球蟲孢子化卵囊收集

取2周齡海蘭白雞20只,每只經(jīng)口灌服1.2×105個孢子化卵囊,收集感染后4～5 d的糞便[13],采用飽和鹽水漂浮法從糞便中收集卵囊,存于2.5g·L-1重鉻酸鉀溶液中,并在25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行卵囊孢子化,然后4 ℃保存待用。

1.7 分組與免疫

重組蛋白免疫:將健康狀況良好、體重差異不大的14日齡雛雞隨機(jī)分為6組(每組20只),設(shè)置pET32a載體蛋白(腿部肌肉注射載體蛋白)、感染非免疫(腿部肌肉注射PBS)和非感染非免疫3個對照組;另外 3組分別用原核表達(dá)蛋白EaMIC3、EaMAR3、EaMAR6在14日齡時進(jìn)行首次免疫,腿部肌肉注射,每羽 200 μg。21日齡時進(jìn)行第2次免疫。28日齡時進(jìn)行攻蟲,每只雞經(jīng)口感染1.2×105個孢子化卵囊,7日后剖殺。

重組蛋白抗血清保護(hù)試驗(yàn):將60只體重差異不大、健康狀況良好的28日齡雛雞攻蟲,每只雞經(jīng)口感染1.2×105個孢子化卵囊,隨機(jī)均分為3組,并設(shè)置抗pET-32a標(biāo)簽蛋白血清組(翅靜脈注射抗標(biāo)簽蛋白血清)、感染非免疫(翅靜脈注射PBS)和非感染非免疫組,連續(xù)7 d進(jìn)行翅靜脈注射,每羽注射0.5 mL效價為212的抗重組蛋白多抗血清,第8天剖殺。

1.8 免疫保護(hù)性效果觀察

堆型艾美耳球蟲致病程度與雞的增重、腸道病變等指標(biāo)相關(guān),通過觀察增重、腸道病變計(jì)分、腸道內(nèi)容物卵囊數(shù)等得出抗球蟲指數(shù),繼而進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,對此次動物試驗(yàn)的免疫效果進(jìn)行全面評價。

1.8.1 增重指標(biāo)試驗(yàn)動物逐只稱量、攻蟲時體重(m1)和剖殺時體重(m2)并記錄,計(jì)算平均增重(W1)、增重率、相對增重率及存活率,參照索勛等[14]的計(jì)算方法進(jìn)行。

1.8.2 腸內(nèi)容物卵囊數(shù)(OPG)使用麥克馬斯特法(McMaster’s method)計(jì)算每克腸道內(nèi)容物的卵囊數(shù),以對數(shù)(lg)表示;根據(jù)試驗(yàn)組卵囊數(shù)占感染非免疫組比例,進(jìn)行分?jǐn)?shù)換算[12],得出卵囊值。

1.8.3 卵囊減少率與病變值參照文獻(xiàn)[14]的方法計(jì)算卵囊的減少率。E.acervulina病變位置為十二指腸,肉眼病變計(jì)分參照索勛等的方法[14]。病變值(0～40)=每組動物平均病變記分(0～4)×10。

1.8.4 抗球蟲指數(shù)(ACI)抗球蟲指數(shù)(ACI)是將存活率、增重變化效果、腸道病變值和卵囊數(shù)量等多項(xiàng)參數(shù)進(jìn)行綜合分析和評定,是判定球蟲耐藥性、藥物抗球蟲效力或球蟲疫苗免疫效果等的指標(biāo)。參數(shù)和判定公式:ACI=(存活率+相對增重率)-(病變值+卵囊值)。ACI≥180,表示保護(hù)效果明顯;160

1.9 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析

使用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析,組間差異顯著性分析使用單因素鄧肯多重比較分析(ANOVA)。分析0.05、0.01和0.001水平的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組蛋白EaMIC3、EaMAR3、EaMAR6的誘導(dǎo)表達(dá)及純化

構(gòu)建成功的原核表達(dá)質(zhì)粒pET-32a-EaMIC3、pET-32a-EaMAR3、pET-32a-EaMAR6轉(zhuǎn)入BL21大腸桿菌,用IPTG誘導(dǎo)小量表達(dá),以pET-32a為空載體對照,探索表達(dá)條件。誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果如圖1。純化結(jié)果如圖2,pET-32a-EaMIC3(圖2-a)、pET-32a-EaMAR3(圖2-b)、pET-32a-EaMAR6(圖2-c)分別在相對分子質(zhì)量111×103、29×103、29×103附近出現(xiàn)單一條帶,說明純化效果良好。

圖1 SDS-PAGE分析pET-32a(+)-EaMIC3(a)、pET-32a(+)-EaMAR3(b)、pET-32a(+)-EaMAR6(c)的時相表達(dá)Fig.1 The expression of pET-32a(+)-EaMIC3(a),pET-32a(+)-EaMAR3(b)and pET-32a(+)-EaMAR6(c) in different time analyzed by SDS-PAGE M. 標(biāo)準(zhǔn)蛋白Standard protein molecular marker;1～6. 蛋白誘導(dǎo)表達(dá)0～5 h后的BL21裂解物 Protein induced by IPTG for 0-5 h;7～8. pET-32a(+)在誘導(dǎo)表達(dá)0和5 h后的BL21裂解物 pET-32a(+)induced by IPTG for 0 and 5 h.

圖2 SDS-PAGE分析重組蛋白EaMIC3(a)、EaMAR3(b)、EaMAR6(c)的純化效果Fig.2 The purified effect of recombinant protein of EaMIC3(a),EaMIC3-MAR3(b)and EaMIC3-MAR6(c)analysed by SDS-PAGE M. 標(biāo)準(zhǔn)蛋白Standard protein molecular marker;1～3.純化后的重組蛋白EaMIC3、EaMAR3和EaMAR6 Purified protein of EaMIC3,EaMAR3 and EaMAR6.

2.2 EaMIC3、EaMAR3、EaMAR6重組蛋白兔抗血清的效價

第5次免疫后用間接ELISA法檢測兔血清中pET-32a-EaMIC3、pET-32a-EaMAR3、pET-32a-EaMAR6、pET-32a蛋白抗體的效價分別為216、216、213、216。

2.3 重組蛋白EaMIC3、EaMAR3、EaMAR6抗E.acervulina效果

2.3.1 增重變化感染非免疫與非感染對照組增重相比差異顯著降低,說明每組試驗(yàn)動物成功感染E.acervulina。pET-32a標(biāo)簽蛋白組與感染非免疫組增重變化差異不顯著,說明其對感染球蟲的雞無明顯保護(hù)作用。重組蛋白試驗(yàn)組雞的增重與感染非免疫組比較差異顯著,說明3種重組蛋白對感染雞E.acervulina具有保護(hù)效果(表1)。

表1 免疫雞以E.acervulina攻蟲后的抗球蟲指數(shù)分析Table 1 Protective effect of recombinant proteins against E.acervulina

2.3.2 腸道病變計(jì)分和卵囊產(chǎn)量腸道病變計(jì)分表示的是腸道受損傷程度。攻蟲后1周,取腸內(nèi)容物進(jìn)行卵囊計(jì)數(shù)。結(jié)果(表1)顯示:pET-32a標(biāo)簽蛋白組與感染非免疫組比較,病變計(jì)分和卵囊減少率差異不顯著,說明攻蟲成功且pET-32a標(biāo)簽蛋白沒有抗球蟲作用。重組蛋白試驗(yàn)組雞的病變計(jì)分和卵囊減少率與感染非免疫組比較均差異顯著,說明重組蛋白對雞抵抗球蟲感染具備一定保護(hù)作用。

2.3.3 抗球蟲指數(shù)(ACI)從表1可以看出:pET-32a標(biāo)簽蛋白組與感染非免疫組相比較ACI差異不顯著,說明pET-32a標(biāo)簽蛋白沒有抗球蟲作用。而EaMIC3,EaMAR3組ACI值都在160以上,說明其對雞具有抗球蟲保護(hù)效果,而EaMAR6組的ACI值在160以下,說明其對雞抗球蟲免疫保護(hù)效果不顯著。

2.3.4 雞血清中抗重組蛋白特異性抗體水平血清樣品于雛雞首免后14 d(二免后7 d)采集,使用ELISA方法檢測血清中EaMIC3、EaMAR3、EaMAR6特異性IgG濃度。試驗(yàn)結(jié)果(圖3)顯示:重組蛋白EaMIC3免疫組血清特異性抗體水平在二免后7 d均顯著高于各對照組(P<0.05)。證實(shí)EaMIC3、EaMAR3、EaMAR6可刺激體液免疫產(chǎn)生。

圖3 雞血清中EaMIC3、EaMAR3、EaMAR6 特異性IgG水平Fig.3 IgG level in chicken serum of EaMIC3, EaMAR3,EaMAR6

2.4 抗重組蛋白EaMIC3、EaMAR3、EaMAR6血清免疫保護(hù)性效果

2.4.1 增重變化感染非免疫組與非感染非免疫組相比增重差異顯著(表2),說明每組試驗(yàn)動物成功感染E.acervulina。pET-32a標(biāo)簽蛋白血清組與感染非免疫組比較差異不顯著,說明其對感染球蟲的雞無明顯保護(hù)作用。每個試驗(yàn)組雞的體重與感染非免疫組比較差異顯著,說明 3種抗重組蛋白血清對感染雞E.acervulina具有保護(hù)效果。

2.4.2 腸道病變計(jì)分和卵囊產(chǎn)量腸道病變記分(表2)表示的是腸道受損傷程度。經(jīng)過分析比較發(fā)現(xiàn)抗pET-32a標(biāo)簽蛋白血清組與感染非免疫組比較,病變計(jì)分和卵囊減少率差異較小,說明攻蟲成功且pET-32a標(biāo)簽蛋白沒有抗球蟲作用。所有試驗(yàn)組雞的病變計(jì)分和卵囊減少率與感染非免疫組比較差異顯著,說明重組蛋白對雞抵抗球蟲感染具備一定保護(hù)作用。

2.4.3 抗球蟲指數(shù)(ACI)從表2可以看出:抗pET-32a標(biāo)簽蛋白血清組與感染非免疫組ACI差異不顯著,說明抗pET-32a標(biāo)簽蛋白血清沒有抗球蟲作用。其中試驗(yàn)組抗重組蛋白EaMIC3、EaMAR3血清組ACI都在160以上,說明其對雞球蟲具有一定抵抗力。抗重組蛋白EaMAR6血清組的ACI在160以下,說明其對雞不具有抗球蟲保護(hù)效果。

表2 免疫雞以E.acervulina攻蟲后的抗球蟲分析Table 2 Protective effect of recombinant protein against E.acervulina

3 討論

雞球蟲病在禽業(yè)生產(chǎn)中危害極大[14-15],現(xiàn)階段的養(yǎng)雞業(yè)中使用抗球蟲化學(xué)藥物是雞球蟲病的主要防治手段[16]。隨著耐藥性和食品安全問題逐漸顯現(xiàn),通過疫苗免疫來預(yù)防球蟲病已經(jīng)成為趨勢[17],目前用于防治的是球蟲活疫苗和亞單位疫苗[12]。由于活疫苗存在成本高、接種劑量不易掌控等風(fēng)險,因此尋求更高效、安全的途徑防治雞球蟲尤為關(guān)鍵。近年來,許多采用基因工程技術(shù)研制重組亞單位抗球蟲疫苗及其在家禽養(yǎng)殖中應(yīng)用的研究被報(bào)道[18-25]。除了CoxAbic以外,至今沒有其他任何商業(yè)化產(chǎn)品上市,CoxAbic是由以色列雅貝克公司從艾美耳球蟲的配子體中分離而得的亞單位疫苗[26-27]。國內(nèi)則相對缺少堆型艾美耳球蟲亞單位疫苗研發(fā)的信息。

本課題組致力于研究、開發(fā)抗球蟲的重組亞單位疫苗,以寄生蟲感染過程中先天性及適應(yīng)性的響應(yīng)機(jī)制等為基礎(chǔ)[28]。前期研究表明,EaMIC3在堆型艾美耳球蟲子孢子侵入腸上皮細(xì)胞過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用,其MAR3是侵入的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域。本試驗(yàn)選擇MIC3和MAR3蛋白為研究對象,利用重組蛋白及抗重組蛋白血清,通過動物保護(hù)性試驗(yàn)進(jìn)一步證明EaMIC3及MAR3在蟲體侵入中的關(guān)鍵作用,為亞單位疫苗篩選提供參考。

研究數(shù)據(jù)顯示,EaMIC3和結(jié)構(gòu)域蛋白的免疫保護(hù)作用有所差異,且全蛋白表現(xiàn)出良好的免疫保護(hù)作用,說明EaMIC3可以作為抗E.acervulina的候選疫苗抗原,結(jié)構(gòu)域蛋白的免疫保護(hù)能力與其同十二指腸上皮細(xì)胞結(jié)合能力有相關(guān)性,即在細(xì)胞ELISA試驗(yàn)中,與十二指腸上皮細(xì)胞結(jié)合能力最強(qiáng)的結(jié)構(gòu)域蛋白EaMAR3表現(xiàn)出具有免疫保護(hù)作用,而結(jié)合能力較弱的EaMAR6則未顯示出免疫保護(hù)作用,但若以EaMAR3為抗原制備亞單位疫苗,還需要更深入研究。對3種蛋白進(jìn)行比較分析,發(fā)現(xiàn)某些結(jié)構(gòu)域具有較好的免疫保護(hù)效果,但是要發(fā)揮更好的免疫作用,可能需要其他結(jié)構(gòu)域蛋白共同作用。