氨基酸代謝變化引起的c-di-GMP穩(wěn)態(tài)波動對大腸桿菌致病過程中菌毛合成的影響

孫敏,高興,任方勛,白乾坤,泮欣銘,馬家樂*,姚火春

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所,江蘇 南京 210014;2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,江蘇 南京 210095)

尿道感染(urinary tract infection,UTI)是世界范圍內(nèi)最普遍發(fā)生的泌尿科疾病之一,其中75%～90%的社區(qū)獲得性UTI是由尿道致病性大腸桿菌(UPEC)引起的[1-2]。此外,UPEC還是引起伴侶動物(寵物貓、狗等)尿路感染、子宮蓄膿等疾病的主要病原之一,在主人及伴侶動物之間存在相互傳播的風(fēng)險,應(yīng)作為人畜共患病原而引起重視。以往對UPEC致病機(jī)制的研究主要集中在病原特異性毒力因子,包括鐵攝取、毒素、黏附,免疫逃避機(jī)制及經(jīng)典毒力因子調(diào)控機(jī)制[3]。最近對宿主-UPEC交互及尿道環(huán)境適應(yīng)機(jī)制的探索拓展了對UPEC致病機(jī)制的理解,進(jìn)一步促進(jìn)了新型抗菌制劑靶標(biāo)鑒定的發(fā)展[4-7]。

氨基酸饑餓(amino acid starvation,AAS)是細(xì)菌氨基酸代謝的一種極端狀態(tài),包括氮元素攝取不足導(dǎo)致的各類氨基酸合成障礙,以及某一類必需氨基酸攝取及合成不足。細(xì)菌在致病過程中,往往會經(jīng)歷多個短暫的氨基酸饑餓狀態(tài),若致病菌突破了宿主的屏障則可迅速獲得氨基酸的補(bǔ)充并完成定殖,若突破失敗則被宿主清除。細(xì)菌能夠合成多種信號分子,包括ppGpp、sigma因子及第二信使環(huán)二鳥苷酸(cyclic diguanosine monophosphate,c-di-GMP)等,調(diào)控自身在氨基酸饑餓狀態(tài)的生長代謝及毒力發(fā)揮。c-di-GMP參與調(diào)控病原菌的多種生理活動并顯著影響其毒力發(fā)揮,是細(xì)菌中廣泛存在的第二信使[8]。不同于全局調(diào)控信號分子ppGpp在整個菌體內(nèi)發(fā)揮作用,c-di-GMP 多在菌體內(nèi)局部區(qū)域發(fā)揮作用,因此細(xì)菌編碼了很多c-di-GMP合成酶及降解酶基因[8-9]。c-di-GMP 在病原菌體內(nèi)的濃度受到嚴(yán)格調(diào)控,其合成依賴于包含GGDEF結(jié)構(gòu)域的鳥苷酸環(huán)化酶(diguanylate cyclase,DGC)實現(xiàn),而其降解則由含有EAL 或 HD-GYP結(jié)構(gòu)域的磷酸二酯酶(phosphodiesterases,PDE)完成[10]。通過DGC合成酶及PDE降解酶調(diào)控胞內(nèi)c-di-GMP濃度的瞬息變化,進(jìn)而快速調(diào)控其生物學(xué)特性[11-12]。

尿液是UPEC從腸道或體外環(huán)境進(jìn)入到尿道后首先遇到的一個重要的宿主體內(nèi)環(huán)境,營養(yǎng)相對匱乏。已有研究證實因為核酸代謝、糖代謝及三羧酸循環(huán)的紊亂而嚴(yán)重影響大腸桿菌在尿液中的生長[3]。正常機(jī)體尿液中的蛋白質(zhì)或氨基酸的含量極其微量,因此尿道致病性大腸桿菌必須通過自己的氨基酸合成網(wǎng)絡(luò)才能滿足自身生長對氨基酸的需求[13-14]。在尿液中生長的細(xì)菌是否面對氨基酸饑餓以及是否通過 c-di-GMP 實現(xiàn)對其生理功能的快速調(diào)控,值得進(jìn)一步研究。盡管小鼠UTI模型被認(rèn)為是一個研究UPEC致病機(jī)制的有效模型[15-16],但是在體外使用人尿液進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)能夠部分模擬宿主尿道環(huán)境,是一個更簡便易行的模型。尿液及LB培養(yǎng)UPEC的比較轉(zhuǎn)錄組試驗已經(jīng)成功鑒定許多上調(diào)基因是UPEC在尿道中最優(yōu)化生長所必需的[17-18]。通過對人尿液培養(yǎng)的UPEC進(jìn)行轉(zhuǎn)座子技術(shù)操作及蛋白組學(xué)分析則發(fā)現(xiàn)了許多有價值的信息[15,19]。

本課題組前期使用mini-Tn5轉(zhuǎn)座系統(tǒng)在UPEC強(qiáng)毒分離株構(gòu)建了一個轉(zhuǎn)座子突變體文庫來測定這些突變體在人尿液中的生長缺陷[20],發(fā)現(xiàn)總計有20余個突變體菌株在尿液中顯現(xiàn)可重復(fù)的及實質(zhì)性的生長能力減弱,通過對插入失活基因的鑒定發(fā)現(xiàn)它們中的半數(shù)涉及氨基酸合成?；谏鲜霭l(fā)現(xiàn),本研究希望鑒定與UPEC在人尿液中最優(yōu)化定殖相關(guān)的氨基酸代謝機(jī)制,并探索c-di-GMP感應(yīng)氨基酸代謝變化調(diào)控UPEC致病性的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以UPEC強(qiáng)毒株UTI89為對象,構(gòu)建轉(zhuǎn)座子突變體文庫及相關(guān)的缺失株,進(jìn)行后續(xù)的驗證試驗。大腸桿菌DH5α、BL21(DE3)購自上海Invitrogen公司。大腸桿菌菌株在Luria-Bertani(LB)肉湯(Oxoid)37 ℃培養(yǎng),需要時添加50 μg·mL-1卡那霉素、100 μg·mL-1氨芐青霉素、25 μg·mL-1氯霉素或30 μg·mL-1萘啶酸。pGEN-pcm由美國愛荷華州立大學(xué)李干武教授饋贈。原核表達(dá)載體pET21a(+)購自Novagen公司。異亮氨酸、蛋氨酸、精氨酸等使用生理鹽水配制成工作濃度的20×溶液,經(jīng)過0.22 μm濾器2次過濾除菌后備用。試驗用菌株詳見表1。

表1 試驗中用到的菌株Table 1 Summary of bacterial strains used in this study

1.2 主要試劑和儀器

2×TaqPCR Master Mix、GoldView核酸染色劑為南京諾唯贊生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品;質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒、DNA Marker、限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶購自大連TaKaRa生物工程公司;細(xì)菌RNA提取試劑盒購自O(shè)mega生物技術(shù)公司;其余試劑為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純;引物由蘇州金唯智引物合成部合成。

MyCycler PCR儀、紫外分光光度計、電擊轉(zhuǎn)化儀、電擊杯、凝膠成像系統(tǒng)均為Bio-Rad公司產(chǎn)品;Step-one plus熒光定量PCR儀為ABI公司產(chǎn)品;NANODROP 2000微量分光光度計購自Thermo Scientific公司。96孔分光光度計(GloMax-Multi,Promega)用于測定突變體文庫在人尿液中生長的D600數(shù)據(jù)[21]。

1.3 DNA編輯操作

DNA片段擴(kuò)增、連接和電轉(zhuǎn)化按照分子克隆的標(biāo)準(zhǔn)方法執(zhí)行。缺失株的構(gòu)建采用本課題組成熟的λ Red同源重組技術(shù)[22],構(gòu)建了ilvGMEA、metJBL、argBCH、leuDCBA、proBA、cysCND、pheAL、asnAC、serB、glnGA、glyA、hisP-J、lysAR、glyA、tyrA及thrABC涉及16種氨基酸合成基因或基因簇的16個缺失株,以及涉及yciR、mlrA、ycgF及ycgE這4個基因的6個缺失株。互補(bǔ)菌株的構(gòu)建選擇pGEN MCS質(zhì)粒作為載體,在其EcoRⅠ和NdeⅠ酶切位點間插入一個在大腸桿菌可恒定表達(dá)的Pcm啟動子,目的基因被克隆進(jìn)入NdeⅠ和BamHⅠ酶切位點之間,受Pcm啟動子控制。

1.4 野毒株及缺失菌株在體外人尿液中的生長比較

人尿液采集參考文獻(xiàn)[20]進(jìn)行:征集20～50歲身體健康的男性及女性志愿者各10名,簽訂知情同意書后,收集晨尿的中段尿,混合后進(jìn)行過濾除菌,-80 ℃保存?zhèn)溆?。從新鮮培養(yǎng)的平板上點取UPEC單菌落轉(zhuǎn)接至2 mL人尿液中,37 ℃培養(yǎng)8 h后,使用分光光度計測定D600值,比較野毒株及缺失菌株在體外人尿液中的生長差異。

1.5 尿道感染試驗比較基因缺失株與野毒株的致病力差異

將所需菌株按1∶100(體積比)分別接種于LB培養(yǎng)基,待其生長至對數(shù)生長期(D600≈0.6～0.8)時收集菌體,用無菌PBS洗滌2～3次,用PBS重懸備用。用異氟醚麻醉CBA/J小鼠,待小鼠呼吸均勻并對銳器刺激無反射時,將其仰臥,輕輕按下腹部,排除剩余尿液,尿道外口用酒精棉消毒。左手用鑷子輕輕夾住陰蒂上部并向斜上方提起約45°,將套有軟管的針頭浸潤醫(yī)用潤滑劑后緩緩插入尿道外口。插入時可左右移動針頭找到無阻力的方向使軟管緩緩滑入約1.0～1.5 cm。緩慢降低注射器至接近小鼠水平時注射50 μL菌液(109CFU),操作結(jié)束后小鼠斷水2 h,定時觀察并記錄小鼠生存狀況。對照組小鼠以同樣的方式灌注無菌PBS。同時,為了分析氨基酸代謝失衡對大腸桿菌尿道定殖的影響,將相應(yīng)的突變株與野毒株1∶1(體積比)混合,然后通過尿道注射(109CFU)感染小鼠。接種48 h后處死小鼠,無菌取膀胱及腎臟,組織勻漿后進(jìn)行10倍比稀釋,再均勻涂布麥康凱瓊脂平板,37 ℃培養(yǎng)24 h后統(tǒng)計結(jié)果。

1.6 熒光定量PCR

用Omega公司的細(xì)菌RNA提取試劑盒,提取大腸桿菌RNA;NANODROP 2000分光光度計測定RNA樣品純度與濃度。使用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser Kit 除去基因組DNA污染后,將上述產(chǎn)物反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。具體步驟參照試劑盒說明書。反應(yīng)體系為20 μL,反應(yīng)程序:37 ℃ 15 min,85 ℃ 5 s,冰上快速冷卻后-20 ℃保存待用。

使用試劑盒進(jìn)行qPCR試驗,反應(yīng)體系為20 μL。Step-one plus熒光定量PCR儀的反應(yīng)參數(shù)設(shè)置為40個循環(huán)。使用tus基因作為內(nèi)參[23],實時定量擴(kuò)增papB、fimB、fyuA、chuA、sitA、iutA、kpsC、hlyA、tsh、pic、flhD、fliC、bcsA、sat、upaB、upaC、csgB等重要的毒力相關(guān)基因,再根據(jù)2-ΔΔCT法計算目的基因相對表達(dá)量。所有反應(yīng)均在相同條件下進(jìn)行,每個樣品重復(fù)3次。

1.7 凝膠阻滯試驗(EMSA)測定轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子與DNA靶標(biāo)的互作關(guān)系

接種含有pET28a-mlrA或pET28a-ycgE質(zhì)粒的BL21(DE3)至100 mL LB培養(yǎng)基中,37 ℃搖床培養(yǎng)至D600≈0.6時,加入0.1 mmol·L-1IPTG,置于28 ℃搖床繼續(xù)培養(yǎng)6 h后。按照文獻(xiàn)描述的方法純化MlrA及YcgE融合蛋白[24],最終用EMSA 結(jié)合緩沖液(10 mmol·L-1Tris-borate,40 mmol·L-1KCl,體積分?jǐn)?shù)是7.5% glycerol,5 mmol·L-1MgCl2,100 μmol·L-1MnCl2,4 mmol·L-1DTT,BSA 100 μg·mL-1,pH 7.5)透析,分裝后于-80 ℃保存待用。通過設(shè)計特異引物從細(xì)菌基因組模板中擴(kuò)增獲得DNA探針。MlrA/YcgE蛋白與DNA探針的互作在25 μL體系中進(jìn)行,每個體系包含DNA探針100 ng,MlrA/YcgE蛋白自25 ng開始按 2倍比加至100 ng,補(bǔ)足結(jié)合緩沖液至25 μL,然后37 ℃孵育30 min。反應(yīng)液隨后在0.5×TBE緩沖液中進(jìn)行非變性60 g·L-1丙烯酰胺凝膠電泳(200 V 45 min)。蛋白膠在包含1×SYBR Green核酸染料的電泳緩沖液中染色30 min,觀察成像并拍照記錄。

1.8 lacZ融合菌株的構(gòu)建及β-半乳糖苷酶活性的測定

分別取2 mL供體菌(S17帶有pVIK112重組質(zhì)粒)和UPEC受體菌,4 000 r·min-1常溫離心10 min,棄上清液后用1 mL滅菌水重懸菌體。重復(fù)洗滌2次(以去除抗生素)后,分別用50 μL滅菌水重懸供體菌及受體菌,按1∶1(體積比)混合后接種于無抗性平板,37 ℃靜置培養(yǎng)4 h后輕輕刮下菌苔,用1 mL滅菌水洗2次后,將菌體重懸并均勻涂布雙抗平板(50 μg·mL-1卡那霉素及30 μg·mL-1萘啶酸)。37 ℃過夜培養(yǎng)后,挑取雙抗平板上的單菌落轉(zhuǎn)接至新的雙抗平板,經(jīng)PCR鑒定后保存?zhèn)溆谩?/p>

用滅菌水將過夜培養(yǎng)的帶有目的基因啟動子-lacZ融合質(zhì)粒的菌株通過離心重懸的方法洗滌2次,然后轉(zhuǎn)接相應(yīng)的培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)至對數(shù)生長后期或穩(wěn)定期。取一定量菌液,離心,棄上清液,沉淀重懸于Z緩沖液中,測定D600值。根據(jù)需要按1∶1或1∶9(體積比)用Z緩沖液進(jìn)行稀釋,加入適量的氯仿和十二烷基硫酸鈉(SDS),劇烈渦旋10 s,靜置5 min以充分裂解細(xì)胞。加入底物ONPG(鄰-硝基酚-β-D-半乳糖苷)后,統(tǒng)計變黃的時間(t)。加入1 mol·L-1碳酸鈉終止反應(yīng),測定D420、D550及D600值。β-半乳糖苷酶活性=1 000×(D420-1.75×D550)/t×0.1×D600)。每組試驗至少重復(fù)3次。

1.9 統(tǒng)計分析

采用GraphPad Prism 5.01統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理。細(xì)菌尿液生長試驗用雙尾t測驗進(jìn)行差異顯著性分析,尿道定殖試驗用Wilcoxon配對檢驗分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 精氨酸、異亮氨酸及蛋氨酸代謝失衡對大腸桿菌尿液生長的影響

根據(jù)前期轉(zhuǎn)座子突變文庫的尿液生長缺陷結(jié)果[20],進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)與尿液生存相關(guān)的氨基酸合成基因主要涉及精氨酸(carAB、argBC及argG)、蛋氨酸(metAB)及異亮氨酸(ilvB、ilvD及ilvE)。此外,涉及亮氨酸(leuA及l(fā)euC)和脯氨酸(proB)合成的個別基因的轉(zhuǎn)座失活對細(xì)菌在尿液的生長也有輕微影響。

為了再次鑒定這些基因是否確實涉及UPEC的尿液生存,并且補(bǔ)充由于轉(zhuǎn)座子突變體庫覆蓋率不足導(dǎo)致的可能的遺漏,我們構(gòu)建了涉及16種必需氨基酸合成基因的非極性缺失株(圖1-A)。結(jié)果顯示:僅精氨酸(ΔargBCH)、蛋氨酸(ΔmetJBL)及異亮氨酸(ΔilvGMEDA)合成基因的缺失株與野毒株相比顯示出顯著的尿液生長缺陷,且在尿液中添加0.1 mmol·L-1對應(yīng)的氨基酸可以完全修復(fù)ΔilvGMEDA、ΔmetJBL和ΔargBCH的生長缺陷至野毒株的水平(圖1-A、B)。

假定通過精氨酸、蛋氨酸及異亮氨酸的合成,可以彌補(bǔ)大腸桿菌直接攝取尿液中上述氨基酸的不足,從而實現(xiàn)最優(yōu)化生長。為了驗證上述假設(shè),我們測定了ΔmetJBL在添加12.5 和25 μmol·L-1或不添加蛋氨酸的M9培養(yǎng)基(僅添加甘油作為碳源的培養(yǎng)基)中的生長特性。結(jié)果顯示:不添加蛋氨酸,ΔmetJBL完全不能生長;添加12.5 μmol·L-1蛋氨酸可以修復(fù)ΔmetJBL的生長至尿液中的水平;而添加25 μmol·L-1蛋氨酸則能夠完全修復(fù)其生長至野毒株水平(圖1-B)。此外,往尿液中添加12.5 μmol·L-1蛋氨酸可以修復(fù)ΔmetJBL的生長至野毒株的水平。上述結(jié)果提示尿液中蛋氨酸濃度大約為12.5 μmol·L-1,而UPEC的最優(yōu)化生長需要約25 μmol·L-1。隨后,我們在ΔilvGMEDA(上述基因缺失同時破壞亮氨酸及纈氨酸合成,故添加亮氨酸及纈氨酸補(bǔ)足)及ΔargBCH開展了類似的試驗,結(jié)果表明UPEC的最優(yōu)化生長需要約 25 μmol·L-1異亮氨酸及50 μmol·L-1精氨酸的(圖1-B),而尿液中的兩者實際濃度均顯著不足。上述結(jié)果表明精氨酸、蛋氨酸及異亮氨酸合成基因是UPEC在尿液中最優(yōu)化生長所必需的。

圖1 精氨酸、蛋氨酸及異亮氨酸對于維持大腸桿菌在尿液中生長的作用Fig.1 The arginine,methionine and isoleucine were required for the optimal growth of uropathogenic Escherichia coli(UPEC)in urine A. 驗證16種必需氨基酸合成基因缺失株的尿液生長情況(添加Ile、Met、Arg均為0.1 mmol·L-1)Recertified potential urine fitness genes by deletion mutants related with amino acids’ biosynthesis(Added 0.1 mmol·L-1Ile,Met and Arg);B. M9培養(yǎng)基、尿液中添加不同濃度精氨酸、蛋氨酸或異亮氨酸對各缺失株生長的影響 The supplement of arginine,methionine and isoleucine maintained the growth of indicated deletion mutant in M9 medium or urine.*P<0.05,**P<0.01. The same as follows.

2.2 氨基酸代謝失衡對大腸桿菌尿道定殖的影響

為了進(jìn)一步證實精氨酸、蛋氨酸及異亮氨酸合成在UPEC感染過程中的作用,我們比較了各突變菌株在小鼠尿道競爭定殖的能力。試驗結(jié)果顯示:UPEC缺失argBCH、metJBL或ilvGMEDA基因,可導(dǎo)致精氨酸、蛋氨酸或異亮氨酸合成被阻斷,顯示明顯的競爭定殖能力減弱,其在感染后48 h膀胱及腎臟中的定殖量下降至其1/10以下。甚至,ΔargBCH及ΔilvGMEDA在感染后48 h膀胱中的定殖量下降至其1/50左右(圖2)。上述結(jié)果表明精氨酸、蛋氨酸及異亮氨酸合成是UPEC在小鼠尿道感染定殖所必需的。

圖2 精氨酸(A)、異亮氨酸(B)及蛋氨酸(C)合成對大腸桿菌在尿道中定殖的影響Fig.2 The biosynthesis of arginine(A),isoleucine(B)and methionine(C)facilitated the optimal colonization of UPEC during urinary tract infectionc為UPEC菌數(shù);圖中數(shù)值為P值。c means the bacterial count of UPEC;the values in pictures mean P-value.

2.3 氨基酸代謝失衡對大腸桿菌第二信使c-di-GMP合成網(wǎng)絡(luò)的影響

為了探求精氨酸、蛋氨酸及異亮氨酸合成障礙影響UPEC致病力的機(jī)制,我們測定了ΔilvGMEDA、ΔmetJBL及ΔargBCH在尿液中生長時各毒力因子的轉(zhuǎn)錄水平變化,包括菌毛、鞭毛、莢膜基因簇、鐵攝取系統(tǒng)編碼基因、黏附素合成基因以及溶血素等各類毒素合成基因。結(jié)果顯示:pap及fim菌毛合成基因,以及鐵攝取相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平由于ilvGMEDA、metJBL及argBCH的失活均表現(xiàn)為顯著下調(diào),下調(diào)至野毒株的1/16左右(圖3)。上述結(jié)果提示,精氨酸、蛋氨酸及異亮氨酸合成障礙激活了UPEC的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,實現(xiàn)對毒力因子編碼基因的系統(tǒng)調(diào)控。

圖3 ΔilvGMEDA、ΔmetJBL及ΔargBCH菌株中 重要毒力因子的轉(zhuǎn)錄水平變化Fig.3 The transcriptional analysis of the important virulence factors in ΔilvGMEDA,ΔmetJBL and ΔargBCH strains

研究發(fā)現(xiàn),氨基酸攝取不足時,細(xì)菌容易進(jìn)入氨基酸饑餓狀態(tài),從而影響許多信使小分子(包括ppGpp、sigma因子S及第二信使c-di-GMP等)的合成并調(diào)控細(xì)菌適應(yīng)營養(yǎng)匱乏的狀態(tài)進(jìn)入生長平臺期[25-27]。考慮到許多研究已經(jīng)闡明ppGpp及sigma因子S在細(xì)菌應(yīng)激過程中的調(diào)控作用機(jī)制[26,28],我們重點關(guān)注尿液中UPEC精氨酸、蛋氨酸及異亮氨酸合成障礙對第二信使 c-di-GMP體系的影響。通過全基因組生物信息學(xué)分析,我們調(diào)取了UTI89株編碼的所有與c-di-GMP相關(guān)的鳥苷酸環(huán)化酶(diguanylate cyclase,DGC)或磷酸二酯酶(phosphodiesterases,PDE)編碼基因,測定上述基因在缺失株ΔilvGMEDA、ΔmetJBL及ΔargBCH尿液生長時的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果顯示:ilvGMEDA、metJBL及argBCH的失活普遍導(dǎo)致 c-di-GMP體系相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平下調(diào),但是顯著下調(diào)的基因在不同缺失株間存在明顯不同(表2)。ΔilvGMEDA及ΔmetJBL引起的下調(diào)基因基本一致,但與ΔargBCH引起的下調(diào)基因存在明顯差異?？紤]到ilvGMEDA、metJBL及argBCH的失活均導(dǎo)致菌毛及鐵攝取相關(guān)基因呈現(xiàn)同趨勢的下調(diào),提示上述3個缺失株應(yīng)該激活了某個共同的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)。進(jìn)一步分析c-di-GMP體系相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平,發(fā)現(xiàn)ycgF及yciR基因在上述 3株缺失株中均顯著下調(diào)(表2),暗示可作為潛在的靶標(biāo)開展后續(xù)研究。

表2 精氨酸、蛋氨酸及異亮氨酸合成障礙對UTI89株c-di-GMP體系基因轉(zhuǎn)錄的影響Table 2 Effect of synthesis disorders of arginine,methionine and isoleucine on gene transcription of

2.4 YciR及YcgF相關(guān)c-di-GMP體系失衡對菌毛基因簇表達(dá)的影響

YciR在其氮端及碳端分別編碼了GGDEF及EAL結(jié)構(gòu)域,同時發(fā)揮合成酶DGC及降解酶PDE的功能。YcgF則僅編碼了EAL結(jié)構(gòu)域,發(fā)揮降解酶PDE的功能。因此,要研究精氨酸、蛋氨酸及異亮氨酸代謝障礙導(dǎo)致的yciR及ycgF轉(zhuǎn)錄水平下降對c-di-GMP體系平衡及菌毛基因簇表達(dá)的影響。尿液培養(yǎng)菌株的qPCR檢測結(jié)果顯示,yciR及ycgF的失活導(dǎo)致pap及fim菌毛基因簇的轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)至與ΔargBCH相似的水平(圖4)。同時,ΔyciR及ΔycgF互補(bǔ)菌株的菌毛基因簇轉(zhuǎn)錄水平則恢復(fù)到與野毒株相似的水平,進(jìn)一步證實上述結(jié)果的可靠性。需要注意的是,與主基因簇反向編碼的papI及fimE則沒有明顯的轉(zhuǎn)錄變化(圖4),表明上述下調(diào)作用主要針對pap及fim主基因簇。

圖4 失活YciR及YcgF對UPEC菌毛、攝鐵系統(tǒng)等 重要毒力因子編碼基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控Fig.4 The transcriptional regulation of YciR and YcgF to the pili gene clusters and iron uptake genes

2.5 YciR下游調(diào)節(jié)子MlrA對P菌毛基因簇表達(dá)的調(diào)控作用

以往的研究證實MlrA是YciR下游一個重要的調(diào)節(jié)子[29],因此我們構(gòu)建了ΔyciRΔmlrA雙缺失株及它的mlrA互補(bǔ)菌株ΔyciRΔmlrA+mlrA。β-半乳糖苷酶活性測定結(jié)果顯示:在ΔargBCH及ΔyciR突變株中,papB(P菌毛基因簇代表基因)及fimB(I型菌毛基因簇代表基因)的表達(dá)量下降至野毒株的1/10左右(圖5-A、B),這一結(jié)果與qPCR結(jié)果基本一致(圖4)。將攜帶yciR的互補(bǔ)質(zhì)粒導(dǎo)入ΔyciR后,papB及fimB的表達(dá)量恢復(fù)到與野毒組相似的水平。但是,YciR及其下游抑制子MlrA的同時失活僅導(dǎo)致papB的表達(dá)量恢復(fù)到與野毒株相似的水平,而fimB的表達(dá)量仍然與ΔyciR相當(dāng)。在ΔyciRΔmlrA突變株中互補(bǔ)mlrA,可以使papB的表達(dá)量重新下降至野毒株的1/10左右。為了進(jìn)一步明確MlrA是否直接調(diào)控pap基因簇的表達(dá),我們進(jìn)行了凝膠阻滯實驗(EMSA):用PCR擴(kuò)增含有潛在結(jié)合位點的啟動子區(qū)域片段作為探針,以從papB編碼區(qū)域擴(kuò)增的片段作為陰性對照。結(jié)果如圖5-C所示:MlrA融合蛋白可以和pap啟動子區(qū)域結(jié)合而不能和對照片段結(jié)合,證實MlrA可以直接調(diào)控pap基因簇的轉(zhuǎn)錄。上述結(jié)果表明YciR通過下游抑制子MlrA直接調(diào)控pap基因簇的表達(dá),但是其調(diào)控fim基因簇表達(dá)的接頭分子需要進(jìn)一步篩選分析。

圖5 YciR及下游抑制子MlrA對P菌毛(papB)及I型菌毛(fimB)基因簇的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用Fig.5 The transcriptional analysis of YciR and the downstream repressor MlrA to Type P(papB) and Type I pili(fimB)gene clusters A. YciR及MlrA對P菌毛基因簇(以papB為代表)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用The transcriptional analysis of YciR and MlrA to Type P pili gene cluster;B. YciR及MlrA對I型菌毛基因簇(以fimB為代表)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用The transcriptional analysis of YciR and MlrA to Type I pili gene cluster;C. EMSA測定MlrA對pap啟動子區(qū)域的綁定作用The identification of MlrA binding to the pap promote region using the EMSA.

2.6 YcgF下游調(diào)節(jié)子YcgE對P菌毛基因簇表達(dá)的調(diào)控作用

以往的研究證實YcgE是YcgF下游一個重要的調(diào)節(jié)子[30],因此我們構(gòu)建了ΔycgFΔycgE雙缺失株及它的ycgE互補(bǔ)菌株。β-半乳糖苷酶活性測定結(jié)果顯示:在ΔycgF缺失株中,papB(P菌毛基因簇代表基因)表達(dá)量與野毒株相比降低至其1/10左右(圖6-A),但是fimB(I型菌毛基因簇代表基因)表達(dá)量幾乎沒有變化(圖6-B),這一結(jié)果與qPCR結(jié)果基本一致(圖4),提示YcgF僅調(diào)控pap基因簇的轉(zhuǎn)錄,而對fim基因簇沒有作用。將攜帶ycgF的互補(bǔ)質(zhì)粒導(dǎo)入ΔyciR后,papB的表達(dá)量恢復(fù)到與野毒組相似的水平。此外,在ΔycgF的基礎(chǔ)上失活下游抑制子YcgE可使papB表達(dá)量恢復(fù)到與野毒株相似的水平。在ΔycgFΔycgE雙缺失株中互補(bǔ)ycgE,可以使papB的表達(dá)量重新下調(diào)至野毒株的1/10左右。進(jìn)一步的EMSA試驗結(jié)果(圖6-C)顯示:YcgE融合蛋白可以和pap啟動子區(qū)域結(jié)合而不能和對照片段結(jié)合,證實YcgE可以直接調(diào)控pap基因簇的轉(zhuǎn)錄。上述結(jié)果表明YcgF通過下游抑制子YcgE直接調(diào)控pap基因簇的表達(dá),但對fim基因簇則沒有調(diào)控作用。

圖6 YcgF及下游抑制子YcgE對P菌毛(papB)及I型菌毛(fimB)基因簇的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用Fig.6 The transcriptional analysis of YcgE and the downstream repressor YcgF to Type P(papB) and Type I pili(fimB)gene clusters A. YcgE及YcgF對P菌毛基因簇(以papB為代表)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用The transcriptional analysis of YcgE and YcgF to Type P pili gene cluster;B. YcgE及YcgF對I型菌毛基因簇(以fimB為代表)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用The transcriptional analysis of YcgE and YcgF to Type I pili gene cluster;C. EMSA測定YcgE對pap啟動子區(qū)域的綁定作用The identification of YcgE binding to the pap promote region using the EMSA.

3 討論

在尿液中生長是許多引起UTI的細(xì)菌在感染初期都需要經(jīng)歷的階段。當(dāng)它們在尿液中生長時,不僅僅需要逃避宿主的免疫清除,還要調(diào)節(jié)自身的代謝以適應(yīng)尿液的營養(yǎng)供給,這是它們能夠成功定殖、感染并最終導(dǎo)致疾病發(fā)生必須具有的能力[3]。本研究首次鑒定精氨酸、蛋氨酸及異亮氨酸合成基因在UPEC尿液生長過程中發(fā)揮重要作用。事實上,尿液是一個營養(yǎng)物質(zhì)極度匱乏的環(huán)境,自然也缺乏各類氨基酸成分[31-33],細(xì)菌必須自己合成缺乏的氨基酸以實現(xiàn)最優(yōu)化生長。

本研究僅篩選到精氨酸、蛋氨酸及異亮氨酸的合成障礙造成UPEC的尿液生長缺陷,亮氨酸及脯氨酸的合成障礙只產(chǎn)生輕微影響,而為什么沒有篩選到其他15種氨基酸合成障礙引起生長缺陷呢?首先,尿液中各種氨基酸的含量差別很大[34];其次,尿液環(huán)境中細(xì)菌對各種氨基酸的需求量也有極大差異,比如對精氨酸的需求量就比蛋氨酸和異亮氨酸多1倍;再次,本研究涉及尿液生長缺陷的氨基酸均處于合成網(wǎng)絡(luò)的末端,其他處于合成網(wǎng)絡(luò)中間的氨基酸往往有多條合成途徑可以補(bǔ)救;最后,可能是由于精氨酸中磷元素及蛋氨酸中硫元素含量豐富,上述2種元素的匱乏導(dǎo)致其他氨基酸合成不足。

糖類等碳水化合物作為能量物質(zhì),在尿液中是不存在的。此外,尿液中也不存在蛋白質(zhì),自然各類氨基酸也極度匱乏。那么,UPEC是如何攝取足夠的碳元素及氮元素來維持自己的生長及定殖的呢?UPEC在尿液中生長時可誘導(dǎo)多種二肽及寡肽綁定蛋白的表達(dá)顯著上調(diào),上述這2類蛋白均被證實是UPEC在膀胱及腎臟有效定殖所必需的[15],提示UPEC通過攝取尿液中微量游離的小肽促進(jìn)自身生長。但是,腎臟中的營養(yǎng)成分與膀胱尿液中顯著不同,但是很奇怪為何精氨酸、蛋氨酸及異亮氨酸的合成障礙卻導(dǎo)致致病菌在上述2個臟器中的生長均受到明顯限制。有文獻(xiàn)報道,腎臟腎小球濾液的吸收過程被認(rèn)為可以為UPEC提供多種利于吸收的碳源,但是UPEC引起的腎小球腎炎可以導(dǎo)致局部缺血而改變營養(yǎng)的可獲得來源[35]。

除了本研究篩選到的精氨酸、蛋氨酸及異亮氨酸合成障礙菌株外,有研究證實小肽轉(zhuǎn)運障礙菌株在膀胱及尿道的定殖受到明顯抑制,表明細(xì)菌需要大量攝取尿液中的氨基酸或小肽,提示氨基酸或小肽是大腸桿菌尿道感染過程中最初的碳源[15]。當(dāng)UPEC使用氨基酸作為碳源時,由葡萄糖異生作用合成的氨基酸,比如D-/L-絲氨酸,能夠被分解為草酰乙酸鹽或丙酮酸鹽進(jìn)入三羧酸循環(huán),從而為葡萄糖異生作用提供基質(zhì)。與尿道感染過程中細(xì)菌將氨基酸及小肽作為重要碳源一致的是,有研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)UPEC在小肽轉(zhuǎn)運、葡萄糖異生或三羧酸循環(huán)存在缺陷時往往顯示在宿主尿道定殖的顯著障礙[15,36-37]。

致病菌的感染過程是與宿主細(xì)胞不斷發(fā)生相互作用的復(fù)雜過程。在不同的感染階段,如早期需要黏附,中期需要發(fā)揮毒力促進(jìn)生長、繁殖,而且需要對抗免疫系統(tǒng)的傷害與清除,后期可能需要休眠,造成重復(fù)感染[38]。因此,能夠正確感受環(huán)境的變化,并作出恰當(dāng)?shù)姆磻?yīng),對于致病菌來說至關(guān)重要。感染早期需要黏附時,細(xì)菌是通過什么方式感應(yīng)自身所處的環(huán)境,從而調(diào)控菌毛及黏附素等發(fā)揮作用。本研究發(fā)現(xiàn)UPEC的尿液生長狀態(tài)對精氨酸、蛋氨酸及異亮氨酸合成極度敏感,提示維持上述3種處于饑餓邊緣氨基酸的供應(yīng)可能是細(xì)菌感應(yīng)生存狀態(tài)的重要媒介。氨基酸饑餓(AAS)已經(jīng)被報道可以被第二信使c-di-GMP所感應(yīng)[39],其不同于全局調(diào)控信號分子ppGpp僅由RelA及SpoT 2個蛋白控制,c-di-GMP由大量的合成酶DGC及降解酶PDE構(gòu)成,并在菌體內(nèi)局部形成穩(wěn)態(tài)。外界刺激可以導(dǎo)致局部c-di-GMP穩(wěn)態(tài)破壞,從而迅速引起個別DGC或PDE表達(dá)量的變化,促進(jìn)細(xì)菌瞬息作出反應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)精氨酸、蛋氨酸及異亮氨酸代謝障礙可打破局部c-di-GMP穩(wěn)態(tài),導(dǎo)致yciR及ycgE轉(zhuǎn)錄水平顯著下調(diào),從而造成下游配對調(diào)節(jié)子MlrA及YcgE的抑制作用增強(qiáng),進(jìn)一步抑制菌毛及各類黏附素的合成。我們可以理解為,處于尿液中游離生存狀態(tài)的UPEC不需要大量合成菌毛等黏附因子,而當(dāng)UPEC接觸到宿主細(xì)胞后可奪取對方的營養(yǎng)物質(zhì)從而改變氨基酸饑餓狀態(tài),迅速進(jìn)入促進(jìn)菌毛等黏附因子合成的狀態(tài),實現(xiàn)黏附定殖。

總之,本研究鑒定了氨基酸代謝在UPEC引起UTI過程中的重要作用,從而更好地理解UPEC感染時氨基酸代謝與細(xì)菌定殖的關(guān)系。上述研究結(jié)果表明保障精氨酸、蛋氨酸及異亮氨酸的合成,可有效促進(jìn)UPEC適應(yīng)宿主尿道的營養(yǎng)供給,實現(xiàn)在體內(nèi)的最優(yōu)化定殖。該結(jié)論可用于指導(dǎo)制定代謝阻斷策略,抑制細(xì)菌感染的擴(kuò)散(封閉細(xì)菌代謝通路上的關(guān)鍵蛋白和螯合感染組織中的代謝原料等),為UPEC及其相關(guān)疾病的綜合防控提供依據(jù)。