茉莉酸信號轉(zhuǎn)錄抑制關(guān)鍵組分JAZ與NINJA互作體系建立及復(fù)合體結(jié)晶條件篩選

曹曉蔓,張亞光,張峰

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院,江蘇 南京 210095)

茉莉酸(jasmonate,JA)是一種在高等植物中發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源性生長調(diào)節(jié)物質(zhì),在調(diào)節(jié)植物生長和脅迫相關(guān)反應(yīng)中發(fā)揮重要的作用[1]。茉莉酸甲酯(jasmonate methyl ester,MeJA)和茉莉酸-異亮氨酸共軛物(jasmonoyl-isoleucine,JA-Ile)是一類脂肪酸的衍生物,統(tǒng)稱為茉莉酸酯(JAs)[2]。在正常條件下,植物JA信號通路處于關(guān)閉狀態(tài),有2種由JASMONATE-ZIM DOMAIN蛋白(JAZ)介導(dǎo)的機(jī)制阻止信號轉(zhuǎn)錄。第1種是JAZ蛋白募集JAZ新型相互作用因子(novel interactor of JAZ,NINJA)和Groucho/Tupl-type共同受體TOPLESS(TPL)/TPL相關(guān)蛋白(TRP)通過直接的蛋白相互作用抑制下游轉(zhuǎn)錄因子;第2種是JAZ與MYC蛋白結(jié)合,導(dǎo)致MYC蛋白不能與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復(fù)合體(MEDIATOR25,MED25)結(jié)合,從而不能起始轉(zhuǎn)錄。當(dāng)植物受到脅迫或者侵害后,植物會積累具有生物活性的JA-Ile,促使F-box蛋白COI1和JAZ蛋白共受體的形成,導(dǎo)致JAZ蛋白泛素化以及降解,從而釋放MYC蛋白,激活下游基因的表達(dá)[3-10]。

JAZ蛋白有2個保守的結(jié)構(gòu)域,分別是位于羧基端的Jas結(jié)構(gòu)域和位于中間的ZIM結(jié)構(gòu)域。通過對Jas結(jié)構(gòu)域的解析得知,在植物沒有外界壓力的情況下,Jas結(jié)構(gòu)域是一段連續(xù)的螺旋并與MYC蛋白的JID和TAD區(qū)域有著廣泛的互作。JA-Ile調(diào)控JAZ與COI1的互作,并誘導(dǎo)Jas結(jié)構(gòu)域構(gòu)象的改變[11]。ZIM結(jié)構(gòu)域由包含TIFY基序在內(nèi)的28個氨基酸組成,對ZIM結(jié)構(gòu)域的研究主要集中在TIFY基序。TIFY基序功能是介導(dǎo)JAZ同源異源二聚體形成以及與NINJA互作,從而抑制JA信號通路[12-13]。NINJA過表達(dá)突變體減弱了JA對根系的抑制作用,表明NINJA蛋白在JA信號傳導(dǎo)途徑中起著負(fù)調(diào)控的作用[13]。然而,對于JAZ蛋白是如何通過與NINJA 蛋白的互作來介導(dǎo)茉莉酸信號抑制作用機(jī)制尚不明確。本文擬建立JAZ與NINJA蛋白的離體和活體互作體系,以及2個蛋白復(fù)合體晶體篩選的體系,為2個蛋白的復(fù)合體晶體結(jié)構(gòu)解析奠定重要的理論基礎(chǔ),也為植物體內(nèi)基于分子互作的轉(zhuǎn)錄抑制水平的精準(zhǔn)調(diào)控以及植物免疫調(diào)節(jié)劑的創(chuàng)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、基因、質(zhì)粒DH5α菌株、BL21(DE3)菌株、酵母AH109菌株、農(nóng)桿菌GV3101菌株、JAZ、NINJA、pGADT7質(zhì)粒、pGBKT7質(zhì)粒、pETDuet1質(zhì)粒、pCV-nYFP質(zhì)粒、pCV-cYFP質(zhì)粒,均保存于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院農(nóng)藥靶標(biāo)生物學(xué)實驗室。

1.1.2 主要試劑與儀器ToloPrep柱式DNA膠回收試劑盒(36201-01)、2×Tolo Fast Pfu Premix、T4DNA連接酶均購于吐露港生物科技有限公司;限制性內(nèi)切酶購于TaKaRa;聚乙二醇3350(PEG3350)、鮭魚精DNA(SSDNA)、二硫蘇糖醇(DTT)、醋酸鋰(LiAC)均購于北京索萊寶科技有限公司;腺嘌呤、脫脂奶粉、甲醇、甘氨酸(Glycine)均購于上海生工生物工程有限公司;氨基酸缺失培養(yǎng)基購于北京酷來博科技有限公司;PVDF膜購于百賽利德;HA抗體購于賽默飛世爾科技有限公司;嗎啉乙磺酸(MES)、乙酰丁香酮(AS)購于麥克林試劑公司;煙草蝕紋病毒(tobacco etch virus,TEV)半胱氨酸蛋白酶來源于本實驗室;蛋白結(jié)晶試劑盒(美國Hampton Research公司)。

Eppendorf centrifuge 5424高速離心機(jī)、BECKMAN COULTER Avanti J-26S XP高速離心機(jī)、SPXAPV1000高壓均質(zhì)機(jī)、Cytiva AKTA pure 25蛋白純化儀、萊卡激光共聚焦顯微鏡。

1.2 方法

1.2.1 酵母雙雜交試驗活化酵母菌AH109,使用One-Step Buffer(1 mol·L-1醋酸鋰、60%PEG3350、1 mol·L-1DTT、10 mg·mL-1SSDNA)制備酵母菌感受態(tài),通過42 ℃金屬浴恒溫器將質(zhì)粒導(dǎo)入酵母菌感受態(tài),涂布于二缺(-Leu/-Trp)固體培養(yǎng)基,置于28 ℃培養(yǎng)箱生長;取酵母單菌落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)后,使用ddH2O調(diào)節(jié)酵母菌液A600值至1.0,取適量酵母菌接種于二缺固體培養(yǎng)基和四缺(-Leu/-Trp/-His/-Ade)固體培養(yǎng)基,置于28 ℃培養(yǎng)箱,觀察其生長情況。

1.2.2 蛋白質(zhì)印跡法收集酵母菌體,并用0.1 mol·L-1NaOH提取蛋白,樣品在120 V電壓下進(jìn)行SDS-PAGE,在200 mA電流下轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,將PVDF膜進(jìn)行封閉和抗體孵育后置于化學(xué)發(fā)光液中,于多功能成像儀上觀察。

1.2.3 雙分子熒光互補(bǔ)試驗活化農(nóng)桿菌GV3101,將質(zhì)粒通過電轉(zhuǎn)化儀轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌后涂布含卡那霉素和利福平抗性LB平板培養(yǎng)基,置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng);取農(nóng)桿菌單菌落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)后,使用農(nóng)桿菌懸浮液(100 mmol·L-1氯化鎂、10 mmol·L-12-嗎啉乙磺酸、150 μmol·L-1乙酰丁香酮,pH 5.6)調(diào)節(jié)A600值至0.5后,注射本氏煙草葉片,25 ℃溫室繼續(xù)培養(yǎng)36～60 h,使用激光共聚焦顯微鏡觀察熒光。

1.2.4 Alpha Screen檢測在避光條件下,完成反應(yīng)體系(5 mg·mL-1鎳螯合物受體株、5 mg·mL-1鏈霉親和素供體株、His6標(biāo)記蛋白、生物素多肽、10×Alpha Screen緩沖液)的配制并孵育;綠光條件下將樣品轉(zhuǎn)移至384孔板,每個試驗組重復(fù)3次;避光條件下轉(zhuǎn)移至多標(biāo)記檢測系統(tǒng),在520～620 nm檢測熒光信號并讀數(shù);使用GrapHpad prim軟件處理數(shù)據(jù)。

1.2.5 氫氘交換質(zhì)譜將純化后的蛋白加入用D2O制成的50 mmol·L-1Tris緩沖液中,于4 ℃分別孵育0、10、30、60、300、900和3 600 s后,加入提前預(yù)冷的酸淬滅液(3 mol·L-1尿素,1%三氟乙酸)終止氫氘交換反應(yīng);使用固定化胃蛋白酶酶解氘代蛋白,將酶解混合物送至賽默飛生物科技有限公司進(jìn)行質(zhì)譜檢測。

1.2.6 蛋白誘導(dǎo)表達(dá)將測序正確的質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)后制備種子液,按1∶100(體積比)將種子液加入LB液體培養(yǎng)基中,振蕩培養(yǎng)至A600值為1.0,加入終濃度為100 μmol·L-1IPTG,16 ℃振蕩誘導(dǎo)表達(dá)20 h后,離心,棄上清液,收集菌體。

1.2.7 親和層析純化使用高壓均質(zhì)機(jī)進(jìn)行菌體破碎,離心收集蛋白上清液,將蛋白上清液上樣于經(jīng)過蛋白緩沖液(20 mmol·L-1Tris、200 mmol·L-1NaCl、10%甘油,pH7.5)處理的MBP(Maltose-binding protein)親和層析柱,用蛋白洗脫緩沖液(20 mmol·L-1Tris、200 mmol·L-1NaCl、10%甘油、10 mmol·L-1麥芽糖,pH7.5)洗脫,收集洗脫液。

1.2.8 蛋白酶酶切按照500∶1(體積比)的比例向蛋白液中加入TEV半胱氨酸蛋白酶,混勻,將混合液置于4 ℃過夜酶切。

1.2.9 凝膠過濾層析純化將HILoadTM16/600 SuperdexTM200 pg與AKTA pure 25蛋白純化儀連接,使用峰收集方式,根據(jù)UV280吸收峰收集蛋白樣品,通過SDS-PAGE檢測目的蛋白。

1.2.10 晶體生長條件篩選將目的蛋白NINJA與JAZ多肽按照1∶1.5(物質(zhì)的量比)進(jìn)行混合后置于冰上孵育,將晶體生長緩沖液與蛋白混合液按照1∶1(體積比)進(jìn)行混合,加入晶體板中,將晶體板置于 25 ℃培養(yǎng),每天觀察晶體生長情況并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母雙雜交驗證JAZ蛋白同源、異源及與NINJA互作區(qū)域

從圖1可見:通過酵母雙雜交發(fā)現(xiàn)JAZ3可與JAZ3、JAZ4和NINJA發(fā)生互作,而JAZ3 TIFY基序敲除體(JAZ3ΔTIFY)和JAZ3羧基端(CT)敲除體(JAZ3ΔCT)與JAZ3、JAZ4和NINJA不能發(fā)生互作;蛋白質(zhì)免疫印跡試驗結(jié)果排除了JAZ3ΔTIFY和JAZ3ΔCT不表達(dá)從而導(dǎo)致蛋白不能互作的可能性。綜上所述,ZIM結(jié)構(gòu)域是JAZ3與JAZ3、JAZ4和NINJA互作所必需的。

圖1 JAZ蛋白ZIM結(jié)構(gòu)域的酵母雙雜交結(jié)果Fig.1 Yeast two-hybrid results of the ZIM domain of JAZ A. JAZ3與JAZ3、JAZ3與JAZ4、JAZ3與NINJA的酵母雙雜交。Interaction JAZ3-JAZ3,JZA3-JZA4 and JAZ3-NINJA detected by yeast two-hybrid. -2、-4代表二缺和四缺培養(yǎng)基。-2,-4 indicate -Leu/-Trp and -Leu/-Trp/-His/-Ade medium. B. 敲除體JAZ3酵母雙雜交的免疫印跡檢測。Western blot for knockout protein mutants(M:Protein marker;1-3:JAZ3ΔCT;4-6:JAZ3ΔTIFY).

2.2 雙分子熒光互補(bǔ)驗證JAZ蛋白同源、異源及與NINJA互作區(qū)域

通過雙分子熒光互補(bǔ)發(fā)現(xiàn)JAZ3CT與JAZ3ZIM、JAZ4ZIM和NINJA(322～425)互作,進(jìn)一步證明ZIM結(jié)構(gòu)域CT是JAZ3與JAZ3、JAZ4和NINJA互作所必需的(圖2)。

圖2 雙分子熒光檢測JAZ3CT與JAZ3ZIM、JAZ4ZIM和NINJA(322～425)的互作Fig.2 Detect interactions between JAZ3CT and JAZ3ZIM,JAZ4ZIM,NINJA(322-425) by bimolecular fluorescent complimentary

2.3 氫氘交換質(zhì)譜檢測NINJA(233～425)蛋白在溶液中穩(wěn)定性

氫氘交換質(zhì)譜結(jié)果表明,從藍(lán)色到紅色表示肽段上氫原子與重水中氘原子交換速率依次增高,交換速率高代表肽段穩(wěn)定性低,交換速率低代表肽段穩(wěn)定性高。上述結(jié)果表明,NINJA(233～425)蛋白在溶液中以不穩(wěn)定狀態(tài)存在(圖3)。

圖3 NINJA(233～425)氫氘交換質(zhì)譜結(jié)果Fig.3 The result of NINJA(233-425)hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry

2.4 NINJA+JAZ復(fù)合體結(jié)合區(qū)域

向NINJA(233～425)蛋白加入JAZ蛋白,分別對2個蛋白進(jìn)行氫氘交換質(zhì)譜檢測,發(fā)現(xiàn)NINJA(330～350)與JAZ蛋白ZIM結(jié)構(gòu)域變?yōu)樗{(lán)色,表明這2個區(qū)域氨基酸處于更穩(wěn)定狀態(tài),是JAZ與NINJA互作所必需的(圖4)。

圖4 NINJA(233～425)與JAZ的氫氘交換質(zhì)譜Fig.4 Hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry for NINJA(233-425)and JAZ A. NINJA(233～425)與JAZ混合液中NINJA(233～425)氫氘交換結(jié)果Hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry for NINJA(233-425)appended with JAZ;B. NINJA(233～425)與JAZ混合液中JAZ氫氘交換結(jié)果 Hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry for JAZ appended with NINJA(233-425).

2.5 Alpha Screen篩選NINJA與JAZ互作的最小區(qū)域

使用Alpha Screen離體互作手段篩選NINJA蛋白與JAZ蛋白互作最小區(qū)域,分別選取H6-NINJA(233～425)、H6-NINJA(342～425)、H6-NINJA(359～425)、H6-NINJA(342～406)截短蛋白與H6-NINJA蛋白全長形成對照,發(fā)現(xiàn)NINJA(342～406)與JAZ的ZIM結(jié)構(gòu)域是2個蛋白互作最小區(qū)域(圖5)。

圖5 NINJA與JAZ互作的Alpha Screen結(jié)果Fig.5 Alpha Screen assay for JAZ and NINJA interaction*P<0.05.

2.6 NINJA截短蛋白的外源表達(dá)

構(gòu)建pETDuet1-MBP-TEV-NINJA(342～406)質(zhì)粒,并利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行融合蛋白的表達(dá),通過MBP親和層析柱純化和TEV蛋白酶酶切,獲得NINJA(342～406)、TEV蛋白酶和MBP標(biāo)簽的混合液。其中,NINJA(342～406)蛋白相對分子質(zhì)量約為6.8×103,MBP標(biāo)簽相對分子質(zhì)量約為42×103,TEV蛋白酶相對分子質(zhì)量約為28×103(圖6)。

圖6 pETDuet1-MBP-TEV-NINJA(342～406) 表達(dá)純化及酶切結(jié)果Fig.6 pETDuet1-MBP-TEV-NINJA(342-406)expression, purification and restriction digestion results M.蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)Protein marker;1. 誘導(dǎo)前Uninduce;2. 誘導(dǎo)后Induce;3. 上清液Supernatant;4. 沉淀Pellet;5. 流穿Flow through;6. 緩沖液沖洗液Wash;7. 洗脫Elution;8. 酶切Digestion;MBP:麥芽糖結(jié)合蛋白Maltose-binding protein;TEV:TEV蛋白酶TEV protease.

2.7 凝膠過濾層析檢測NINJA截短蛋白在溶液中狀態(tài)

通過凝膠過濾層析將目的蛋白NINJA(342～406)從3種蛋白混合液中進(jìn)行分離。根據(jù)分子質(zhì)量大的蛋白先出峰,分子質(zhì)量小的蛋白后出峰的原理,收集57～61號收集管內(nèi)蛋白溶液進(jìn)行SDS-PAGE驗證,使用紫外分光光度計檢測蛋白濃度,最終獲得6.8 mg·mL-1目的蛋白NINJA(342～406)(圖7)。由于NINJA(342～406)蛋白相對分子質(zhì)量約為6.8×103,使用15%SDS-PAGE進(jìn)行驗證,NINJA(342～406)以單體形式存在,在目的蛋白的頂峰位置存在少許雜蛋白,但目的蛋白純度已達(dá)到蛋白質(zhì)結(jié)晶的要求。

圖7 NINJA(342～406)分子排阻色譜純化(A)及收集液的SDS-PAGE電泳(B)Fig.7 Size exclusion chromatograms of NINJA(342-406)(A)and SDS-PAGE for collections(B)

2.8 溶液狀態(tài)下檢測NINJA(342～406)與JAZ蛋白ZIM多肽(JAZZIM)的互作

NINJA(342～406)蛋白相對分子質(zhì)量為6.8×103,NINJA(342～406)+JAZ2ZIM相對分子質(zhì)量為10.2×103。從圖8所知:NINJA與JAZ2ZIM多肽在溶液狀態(tài)下形成較強(qiáng)的相互作用,復(fù)合體的出峰位置較NINJA單體出峰位置前移。其中藍(lán)色曲線為NINJA(342～406)蛋白溶液層析圖,紅色曲線為NINJA(342～406)蛋白與JAZ2ZIM多肽混合溶液層析圖(圖8)。

圖8 NINJA(342～406)與NINJA(342～406)+JAZ2ZIM復(fù)合體分子排阻色譜結(jié)果的擬合Fig.8 Overlay of size exclusion chromatograms for NINJA and NINJA(342-406)+JAZ2ZIM

2.9 NINJA(342～406)與JAZ蛋白ZIM多肽復(fù)合體結(jié)晶條件的篩選

使用Hampton research晶體高通量篩選試劑盒對NINJA(342～406)+JAZ2ZIM復(fù)合體結(jié)晶條件進(jìn)行篩選。4 d后,分別在0.2 mol·L-1CaCl2·2H2O、0.1 mol·L-1BIS-Tris(pH6.5)、45% 2-甲基-2,4-戊二醇和 0.2 mol·L-1醋酸銨、0.1 mol·L-1Tris(pH8.5)、45% 2-甲基-2,4-戊二醇條件下,均得到NINJA(342～406)+JAZ2ZIM復(fù)合體晶體,10 d后復(fù)合體晶體停止生長(圖9)。對上述晶體進(jìn)行X-ray衍射,確定是蛋白質(zhì)晶體,但是分辨率大于4 ?,故沒有收集衍射數(shù)據(jù)。

圖9 不同條件下的NINJA(342～406)+JAZ2ZIM復(fù)合體晶體形態(tài)Fig.9 Complex crystals of NINJA(342-406)+JAZ2ZIM in the different conditions A. 生長條件為0.2 mol·L-1 CaCl2·2H2O、0.1 mol·L-1 BIS-Tris(pH6.5)、45% 2-甲基-2,4-戊二醇;B. 生長條件為0.2 mol·L-1醋酸銨、0.1 mol·L-1 Tris(pH8.5)、45% 2-甲基-2,4-戊二醇。A. The growth conditions are 0.2 mol·L-1 CaCl2·2H2O, 0.1 mol·L-1 BIS-Tris(pH6.5),45% 2-methyl-2,4-pentanediol;B. The growth conditions are 0.2 mol·L-1 ammonium acetate,0.1 mol·L-1 Tris(pH8.5),45% 2-methyl-2,4-pentanediol.

3 討論

蛋白質(zhì)是生命活動的體現(xiàn)者,大部分生物學(xué)過程需要蛋白質(zhì)之間的相互作用來調(diào)控,比如信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞周期等[14-18]。本文使用酵母雙雜交系統(tǒng)證實JAZ3蛋白ZIM結(jié)構(gòu)域的TIFY基序及羧基端的氨基酸序列是JAZ同源和異源互作及與NINJA互作所必需的。在此結(jié)果基礎(chǔ)上,通過雙分子熒光互補(bǔ)系統(tǒng)進(jìn)一步證實JAZ蛋白ZIM結(jié)構(gòu)域羧基端的氨基酸序列可直接與JAZ及NINJA蛋白互作,進(jìn)一步證實了酵母雙雜交的結(jié)果。在本試驗中,NINJA蛋白在水溶液狀態(tài)下結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定,其羧基端的蛋白序列氫氘交換速率較高,意味著穩(wěn)定性較低,不宜利用蛋白質(zhì)結(jié)晶技術(shù)進(jìn)行結(jié)晶。在NINJA蛋白溶液中加入JAZ蛋白,發(fā)現(xiàn)NINJA蛋白330～350的氨基酸序列及JAZ蛋白的ZIM結(jié)構(gòu)域氫氘交換速率大幅降低,意味著JAZ與NINJA結(jié)合后復(fù)合體的結(jié)構(gòu)狀態(tài)趨于穩(wěn)定,說明可以嘗試?yán)玫鞍踪|(zhì)結(jié)晶技術(shù)對JAZ與NINJA的復(fù)合體進(jìn)行結(jié)晶篩選及結(jié)構(gòu)解析。本文中NINJA和JAZ分別偶聯(lián)組氨酸及生物素標(biāo)簽,分別結(jié)合鎳螯合物受體株及鏈霉親和素供體株,如果NINJA及JAZ之間產(chǎn)生互作,則有信號產(chǎn)生。結(jié)果表明,NINJA蛋白的342～406氨基酸序列及JAZ蛋白的ZIM結(jié)構(gòu)域是NINJA與JAZ互作的最小區(qū)域?；谠摻Y(jié)果進(jìn)行了NINJA及JAZ蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建及蛋白的純化。

結(jié)構(gòu)生物學(xué)是以生物大分子及其復(fù)合物的三維原子結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ),全面闡述重要生命過程的分子機(jī)制。在結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究中,能夠獲得穩(wěn)定表達(dá)且有活性的蛋白是研究的基礎(chǔ)。通過基因重組技術(shù),使用不同的蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng),利用不同的純化標(biāo)簽進(jìn)行蛋白質(zhì)分離純化,最后通過蛋白酶將標(biāo)簽和目的蛋白分離,獲得目的蛋白。本文將NINJA(342～406)與MBP標(biāo)簽進(jìn)行融合,利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行蛋白表達(dá),經(jīng)親和層析純化得到融合蛋白后利用TEV蛋白酶將MBP切除,得到純度較高的目的蛋白。因為JAZ蛋白的ZIM 結(jié)構(gòu)域片段較小,通過蛋白質(zhì)合成的方法合成了ZIM多肽。將NINJA(342～406)與ZIM多肽以一定比例孵育后進(jìn)行結(jié)晶條件的篩選,最終在一定條件下得到了晶體,并通過X-ray衍射證實是蛋白質(zhì)晶體。NINJA和JAZ均沒有同源結(jié)構(gòu),下一步將對NINJA蛋白進(jìn)行硒代蛋白的純化及結(jié)晶,并對結(jié)晶條件進(jìn)行優(yōu)化,以期解析NINJA與JAZ蛋白的復(fù)合體晶體結(jié)構(gòu)并揭示兩者的分子互作機(jī)制。

TIFY基序的功能是介導(dǎo)JAZ同源異源互作以及與NINJA互作,對擬南芥中12個JAZ蛋白ZIM結(jié)構(gòu)域進(jìn)行同源性比對發(fā)現(xiàn),ZIM結(jié)構(gòu)域羧基端氨基酸很保守,但是這些氨基酸的功能仍然不清楚[12]。根據(jù)Chung等[12]的研究,JAZ3蛋白既形成同源異源二聚體又與NINJA蛋白互作,為保證試驗結(jié)果的全面性,選擇JAZ3蛋白為研究對象。通過酵母雙雜交和雙分子熒光互補(bǔ)手段驗證活體條件下ZIM結(jié)構(gòu)域羧基端是JAZ與JAZ、NINJA互作所必需的。離體條件下,通過氫氘交換質(zhì)譜手段初步篩選JAZ與NINJA互作區(qū)域并確定二者復(fù)合體更容易結(jié)晶。采用Alpha Screen體系確定NINJA(342～406)與JAZ2ZIM互作,構(gòu)建pETDuet1-MBP-TEV-NINJA(342～406)重組質(zhì)粒,使用原核表達(dá)系統(tǒng)獲得復(fù)合體晶體,對于復(fù)合體晶體進(jìn)行X-ray衍射,確定是蛋白質(zhì)晶體,因為分辨率大于4 ?,故沒有收集衍射數(shù)據(jù)。事實上在對晶體進(jìn)行衍射之前均進(jìn)行了蛋白晶體的確認(rèn),比如染色或者電泳的方法。有些時候因為蛋白晶體較小、較少或較為珍貴,為了得到晶體的初步數(shù)據(jù),會直接進(jìn)行X-ray衍射,也能夠得到晶體是否為蛋白質(zhì)晶體的確切結(jié)論。本文蛋白質(zhì)晶體的獲得為2個復(fù)合體結(jié)構(gòu)解析奠定重要的理論基礎(chǔ),其結(jié)果還為植物體內(nèi)基于分子互作的轉(zhuǎn)錄抑制水平的精準(zhǔn)調(diào)控以及植物免疫調(diào)節(jié)劑的創(chuàng)制奠定基礎(chǔ)。