芍藥苷對PFOS 致小鼠肝臟氧化損傷的保護(hù)研究

李贊 嚴(yán)定逸 姜冉 陸康 曹亞利 陳蘭華 羅敏 黃春霞

目前，環(huán)境污染問題越來越受到重視，其中全氟磺酸類化合物，主要是全氟辛烷磺酸基化合物（PFOS），會對肝臟造成強(qiáng)烈的氧化損傷；因?yàn)槿镣榛撬犷愇镔|(zhì)的使用范圍非常大，所以在人和動物體內(nèi)都發(fā)現(xiàn)了一定濃度的PFOS，嚴(yán)重危害人類和其他生物的健康。然而，芍藥苷作為藥物的主要活性物質(zhì)之一，具有抗氧化損傷和無副作用的特點(diǎn)，通過探索其對PFOS 致肝氧化損傷小鼠模型的保護(hù)作用，不僅為其他類型的藥物所導(dǎo)致的肝臟損傷治療提供了借鑒方法，而且為新藥物的研制開辟了道路。

材料與方法

一、材 料

生理鹽水、蒸餾水、HE 染液、全氟辛烷酸鉀（純度98% 100 g）、芍藥苷（純度98%，HPLC 500 mg）由上海吉至生物科技有限公司生產(chǎn)。益肝靈片（有效成分水飛薊，規(guī)格：38.5 mg/片）由陜西利君現(xiàn)代中藥有限公司生產(chǎn)。檢測血清ALT、AST、ALP 水平和肝臟丙二醛、超氧化物歧化酶（SOD）水平的試劑盒由湖南圣湘生物科技有限公司生產(chǎn)。

選擇健康雄性昆明小鼠（25～30 g）40 只，小鼠由長沙天勤生物技術(shù)有限公司提供。按照實(shí)驗(yàn)動物管理委員會制定的環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)給小鼠自由喂食、飲水，每日定時(shí)稱重。規(guī)律性飼養(yǎng)1 周，隨后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

二、實(shí)驗(yàn)方法與流程

給小鼠灌服全氟辛烷酸鉀（10 mg/kg，連續(xù)灌胃18 d）建立小鼠肝臟氧化損傷模型。40 只小鼠采用隨機(jī)數(shù)表的方式分為模型對照組、陽性對照組、低劑量芍藥苷組（低劑量組）、中劑量芍藥苷組（中劑量組）及高劑量芍藥苷組（高劑量組），分別給予生理鹽水、益肝靈片溶液、10 mg/（kg·d）、50 mg/（kg·d）、100 mg/（kg·d）的芍藥苷溶液連續(xù)灌胃3 周，每次給藥0.1～0.2 mL，分別記錄各組小鼠的體質(zhì)量變化，同時(shí)注意各組小鼠的精神行為學(xué)有無差異。本實(shí)驗(yàn)符合動物實(shí)驗(yàn)相關(guān)倫理規(guī)范。

最后1 次給藥后隔24 h，小鼠稱重，從小鼠眼球中抽取2 mL 血液，以3000 r/min 的速度進(jìn)行離心處理，10 min 后提取上清液，檢測血清ALT、AST 及ALP 的水平，按試劑說明書和生化分析儀的使用方法進(jìn)行測定。后立即頸椎脫臼處死小鼠，取出肝臟用于制備組織勻漿模型，測定丙二醛、SOD 以及肝臟HE 染色。操作方法為用電子秤稱取肝臟組織50 mg 裝入無菌試管中，加入預(yù)冷的生理鹽水，采用冰浴的方法進(jìn)行勻漿處理，使肝臟中的勻漿液水平達(dá)到10%，然后以3000 r/min 的速度進(jìn)行離心處理，10 min 后提取上清液，按試劑盒要求檢測小鼠肝組織勻漿丙二醛及SOD 的活性，其他剩余肝臟組織用甲醛固定后用于病理學(xué)檢測。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié)果

一、芍藥苷對PFOS 導(dǎo)致的肝臟氧化損傷起保護(hù)作用

陽性對照組和低劑量組丙二醛水平與模型對照組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 均＞ 0.05）；相反，高劑量組和中劑量組與模型對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 均＜ 0.05）。陽性對照組、低、中劑量組SOD 水平與模型對照組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 均＞ 0.05），高劑量組SOD 水平與模型對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05），見表1。

表1 各組小鼠肝臟丙二醛和SOD 水平的比較

與模型對照組相比，陽性對照組、中、高劑量組均能降低小鼠血清ALT、AST 及ALP 的水平（P 均＜ 0.05），與陽性對照組比較，低、中劑量組不能降低血清ALT、AST、ALP 水平，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 均＞ 0.05），高劑量組可以降低血清ALT、AST 水平，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 均＜0.05），見表2。

表2 各組小鼠ALT、AST 及ALP 水平的比較 單位：U/L

二、芍藥苷改善了PFOS 導(dǎo)致的肝臟病理學(xué)變化

由于PFOS 的存在，導(dǎo)致小鼠的肝臟病理學(xué)發(fā)生了顯著改變，在病理學(xué)上表現(xiàn)為肝組織淤血、肝臟局部組織紊亂、細(xì)胞及組織水腫、炎癥細(xì)胞浸潤、局部組織壞死，見圖1A。在經(jīng)給予藥物益肝靈片以及芍藥苷后，肝臟組織損傷得到緩解，肝臟病理學(xué)改變明顯減輕。隨著芍藥苷濃度的增加，肝臟修復(fù)情況呈現(xiàn)階梯型變化，圖1C、D、E與圖1B 對比發(fā)現(xiàn)，芍藥苷同益肝靈片均能對肝臟損傷起到一定的治療作用。

圖1 芍藥苷改善了PFOS 導(dǎo)致的肝臟病理學(xué)變化（HE 染色,×400）

三、芍藥苷能有效緩解PFOS 對小鼠體質(zhì)量抑制作用

模型對照組體質(zhì)量為（35.54±1.82）kg，陽性對照組為（37.96±1.38）kg，低、中、高劑量組分別為（36.19±2.61）（37.55±1.16）（37.86± 1.75）kg，模型對照組相比其他4 組體質(zhì)量低，以模型對照組為基準(zhǔn)，發(fā)現(xiàn)除低劑量組外其他3 組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 均＜ 0.05），表明PFOS 可能對小鼠的體質(zhì)量增長具有一定的抑制作用，而芍藥苷可能在一定程度上能緩解PFOS 對小鼠體質(zhì)量增長的抑制作用。

討 論

PFOS 廣泛應(yīng)用于各行各業(yè)，PFOS 在廣泛運(yùn)用之時(shí)造成了一系列污染問題。PFOS 在生態(tài)系統(tǒng)中存活性極強(qiáng)，很難被降解，這是因?yàn)槠涠栊院突瘜W(xué)穩(wěn)定性較強(qiáng)，同時(shí)又難以揮發(fā)。如 今，已在世界各地的水、土壤、大氣、人類和動物的肝臟與血清中檢測到它，使其成為威脅環(huán)境和人類健康的重要污染物之一。由于通過食物鏈可以進(jìn)行研究生物放大和累積影響作用，使位于食物鏈高層的高級生物體內(nèi)有高濃度的PFOS 富積。有大量動物毒理學(xué)研究表明，PFOS 類有機(jī)污染物會對動物健康產(chǎn)生極大危害，其危害表現(xiàn)在諸多方面：首先基因表達(dá)不穩(wěn)定，其次會導(dǎo)致動物發(fā)生癌變，還會產(chǎn)生神經(jīng)、發(fā)育、繁殖、免疫、肝的毒性，最后還會引起甲狀腺和內(nèi)分泌異常。其中對肝臟的損害最為嚴(yán)重，其可增加肝細(xì)胞內(nèi)活性氧濃度、肝臟脂褐質(zhì)含量、導(dǎo)致體內(nèi)有關(guān)抗氧化酶的活性下降、破壞體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)并造成肝臟氧化損傷。

芍藥苷的藥理作用包括抗過敏、抗驚厥、抗炎、抗凝血和抗氧化。通過大量研究可以看出，芍藥苷能夠治療諸多與肝臟相關(guān)的疾病，比如肝臟纖維化、化學(xué)性及膽汁性肝臟損傷、脂肪肝甚至肝癌等。芍藥苷具有極強(qiáng)的抗氧化特性，能夠降低機(jī)體內(nèi)活性氧含量，降低血清及肝組織的ALT、AST 水平，有效增強(qiáng)位于肝組織的SOD、GSH、GSH-PX 的酶生物活性，降低丙二醛、TNF-α、IL-1β、IL-6 及IL-12 等炎癥因子的水平。研究顯示核因子-κB（NF-κB）調(diào)控PNPLA3 表達(dá)參與肝臟脂肪變性的進(jìn)展，而芍藥苷可同時(shí)抑制IRAK 和NF-κB 相關(guān)信號通路的激活，加快凋亡因子Caspase3 的表達(dá)；通過PI3K/AKT 信號通路促進(jìn)Nrf2 的表達(dá)，最終從抗氧化、抗炎、抗凋亡多個機(jī)制過程保護(hù)肝臟。此外芍藥苷不僅能夠通過刺激小鼠釋放血漿纖連蛋白來提高血藥水平進(jìn)而起到保護(hù)肝臟的效果，還能夠提升網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)功能來保護(hù)肝臟。

通過實(shí)驗(yàn)表明PFOS 對肝臟的毒性尤為突出，PFOS 暴露后肝臟中3 種抗氧化酶和丙二醛的活力下降、同時(shí)造成肝臟中SOD 的水平增高；致使氧自由基不能被及時(shí)清除，而過多的氧自由基可不斷攻擊細(xì)胞膜上的不飽和脂肪酸而發(fā)生氧化作用，使細(xì)胞膜完整性遭到破壞，也對小鼠機(jī)體的生物大分子以及在細(xì)胞水平上造成氧化損傷。在病理上表現(xiàn)為肝臟組織淤血、肝臟局部組織壞死紊亂、肝細(xì)胞及組織水腫、炎癥細(xì)胞浸潤等。由于實(shí)驗(yàn)動物對PFOS 的腸道吸收率較高，攝入后優(yōu)先黏附在肝臟中負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運(yùn)脂肪酸的蛋白質(zhì)上。此時(shí)因內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的應(yīng)激調(diào)控以及過多的自由基能使線粒體內(nèi)一些重要的酶類如脫氫酶、三磷酸腺苷酶、琥珀酸脫氫酶失去活性，肝細(xì)胞溶酶體膜滲漏加上細(xì)胞蛋白水解阻礙了能量和物質(zhì)的代謝，更容易引起肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的脂滴堆積增加，造成肝臟的脂質(zhì)代謝紊亂。此外，PFOS 誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激通過抑制AKT/mTOR 信號通路，上調(diào)肝臟凋亡相關(guān)蛋白抑制 Nrf2 通路相關(guān)的蛋白表達(dá)水平，引起細(xì)胞自噬和凋亡，進(jìn)一步加重細(xì)胞損傷。

PFOS 可增加肝細(xì)胞內(nèi)活性氧濃度，降低體內(nèi)抗氧化酶活性，破壞抗氧化防御系統(tǒng)，并增加肝臟脂褐質(zhì)含量；介導(dǎo)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)降低機(jī)體抗氧化防御能力，誘發(fā)肝細(xì)胞 DNA 損傷。而芍藥苷通過PI3K/AKT 信號通路促進(jìn)Nrf2 的激活，發(fā)揮抗氧化和抗炎能力的功能，Nrf2 通過上調(diào)可抑制氧化應(yīng)激及肝星狀細(xì)胞的生成；同時(shí)激活還原型輔酶Ⅱ使一氧化氮、氧自由基的生成減少；提高肝組織SOD、過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶活力，從根源上對PFOS 的毒性機(jī)理進(jìn)行抑制，完成對PFOS 造成的化學(xué)性肝損傷的保護(hù)作用。

綜上所述，在給予藥物以及芍藥苷治療之后，小鼠血清ALT、AST、ALP 水平以及肝臟組織丙二醛水平隨之降低；SOD 水平增高；且肝臟的病理學(xué)改變在一定程度上得到恢復(fù)，并存在一定的劑量反應(yīng)關(guān)系；其中高劑量組與陽性對照組相比，高劑量組的效果更佳。由此可知，藥物芍藥苷與藥物益肝靈片同樣可起到保護(hù)肝臟的作用，在一定程度上芍藥苷的效果更佳。