基于體外抗氧化DPPH法優(yōu)化生地抗氧化活性工藝*

任海云，張朔生

(山西中醫(yī)藥大學(xué)中藥與食品工程學(xué)院，山西 太原 030619)

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 儀器與材料

1.1.1 儀 器

Thermo Fisher Scientific U3000高效液相色譜儀，美國賽默飛世爾Thermo公司；UV-610S紫外-可見分光光度計(jì)，上海元析儀器責(zé)任有限公司；Milli-Q 超純水凈化系統(tǒng)，默克化工技術(shù)(上海)有限公司；AX224ZH/E十萬分之一電子天平，美國奧豪斯儀器(上海)有限公司；HH-6 數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州市金壇友聯(lián)儀器研究所。

1.1.2 材 料

所用藥材生地黃購自太原市北京同仁堂大藥房，由山西中醫(yī)藥大學(xué)中藥與食品工程學(xué)院張朔生教授鑒定為地黃(Rehmannia glutinosa L.) 根。1-二苯基-2-苦苯肼自由基：上海思域化工科技有限公司；對照品地黃苷D(批號ST1190120NG)、梓醇(批號 MUST-17032005)、毛蕊花糖苷(批號111530-201713)均為上海源葉生物科技有限公司；乙腈、甲醇、磷酸為為色譜純，水為超純水。其他試劑均為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

色譜柱：Ultimate LP-C18(250 mm×4.6 mm， 5 μm)；流動相：乙腈-水-1%磷酸混合水溶液；流速為1 mL/min；柱溫為25 ℃；進(jìn)樣量：10 mL；檢測波長：梓醇、地黃苷D以及毛蕊花糖苷分別為215 nm、203 nm與330 nm。在上述條件下, 供試品溶液中各組分色譜峰與其他峰分離良好, 峰形對稱,分離度均大于 1.5,組分梓醇、地黃苷D與毛蕊花糖苷保留時間分別約為15.5、5.9、38.4 min。理論板數(shù)按各組分峰計(jì)均不低于 3000。

1.2.2 對照品溶液的制備

走入兵團(tuán)、愛在兵團(tuán)，了解兵團(tuán)、融入兵團(tuán)，是劉宇星來新疆工作一年后的真實(shí)情感，尤其是在紅色革命基地參觀了當(dāng)年兵團(tuán)戰(zhàn)士生活、工作、學(xué)習(xí)的場景，看到兵團(tuán)戰(zhàn)士和北大荒拓荒者一樣，在條件極其惡劣的情況下，與大自然展開了殊死較量。條件雖然艱苦，可是大家仍飽含著樂觀主義精神和無私奉獻(xiàn)的高尚情操，使他對兵團(tuán)發(fā)展的歷史有了更清晰的認(rèn)識，對老一輩兵團(tuán)戰(zhàn)士的無私奉獻(xiàn)精神肅然起敬，援疆讓他收獲了知識、開拓了視野，也感覺到身上的擔(dān)子更重了，立誓要讓自已在援疆本職崗位，用心、用情、用智、用黨的好政策援疆，敢于擔(dān)當(dāng)，做一名無愧于黨的援疆好干部。

精密稱取干燥至恒定的梓醇、地黃苷D、毛蕊花糖苷對照品適量，加甲醇定容，分別制成含梓醇3.64 mg/mL、地黃苷D1.99 mg/mL、毛蕊花糖苷56 μg/mL的混合對照品溶液。

1.2.3 供試品溶液的制備

分別精密吸取生地水提液樣品10 mL稀釋定容至20 mL，微孔濾膜濾過，供試品溶液即制備完成。

1.2.4 DPPH溶液的制備

精密稱取DPPH 0.0500 g，用甲醇定容至50 mL容量瓶,制成 0.002 mg/mL的混合溶液，即得。

1.2.5 線性關(guān)系考察

將對照品地黃苷D配成質(zhì)量濃度為1.990、0.995、0.4975、0.24875、0.1243 mg/mL的溶液;梓醇質(zhì)量濃度為3.640、1.820、0.910、0.455、0.2275 mg/mL的溶液;毛蕊花糖苷質(zhì)量濃度為56.000、28.000、14.000、7.000、3.500 μg/mL的溶液。按“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件各進(jìn)樣10 μL, 測定峰面積。將所得峰面積與各對照品的質(zhì)量濃度進(jìn)行線性回歸, 得回歸方程、相關(guān)系數(shù) (r) 及線性范圍，見表1。

表1 回歸方程和線性范圍Table 1 The regression equation and linear range

1.2.6 生地抗氧化活性單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

以生地為原料，DPPH清除率為指標(biāo)，同時監(jiān)測提取液中梓醇、地黃苷D、毛蕊花糖苷組分含量，固定煎煮次數(shù)2次、煎煮時間40 min，考察浸泡時間1.5、3、6、9、13、24 h對生地抗氧化活性的影響；固定浸泡時間1.5 h、煎煮時間40 min，考察煎煮次數(shù)2、3、4、5、6次對生地抗氧化活性的影響；固定浸泡時間1.5 h、煎煮次數(shù)2次，考察煎煮時間20 min、 30 min、40 min、50 min、60 min對生地抗氧化活性的影響。

1.2.7 生地抗氧化活性正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以DPPH清除率為指標(biāo)，浸泡時間、煎煮時間以及煎煮次數(shù)為因素，進(jìn)行 L9(34)正交試驗(yàn)， 優(yōu)化獲得最優(yōu)條件。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表 2。

表2 因素水平表Table 2 The factor and level table

1.2.8 DPPH自由基清除率的計(jì)算方法

根據(jù)參考文獻(xiàn)方法，精確量取供試品溶液1 mL分別與1 mL DPPH溶液以及1 mL 70%的甲醇混合均勻，避光孵育一小時，測其517 nm處的吸光度值，并通過下式計(jì)算DPPH的清除率：

DPPH清除率(%)=[1-(A1-A2)/A3]×100%

式中：A1為517 nm波長下，1 mL供試品溶液與1 mL的DPPH溶液混合室溫避光孵育1 h后的吸光度值，A3為517 nm波長下，1 mL 70%甲醇與1 mL的DPPH溶液孵育后的吸光度值，A2為517 nm波長下，1 mL供試品溶液與1 mL甲醇孵育后的吸光度值。

2 結(jié)果與討論

2.1 生地抗氧化活性單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 浸泡時間對生地抗氧化活性的影響

如圖1所示，隨著浸泡時間增加，生地DPPH自由基清除率隨之升高，13 h之后，DPPH自由基清除率增長減緩。從供試品組分含量變化可知浸泡3 h時生地提取液梓醇、地黃苷D以及毛蕊花糖苷等組分含量增加迅速，隨后這些組分含量隨浸泡時間延長增加緩慢，從9 h到13 h以較快速度增加，浸泡時間再延長則各組分含量增加放慢，與供試品DPPH自由基清除率變化規(guī)律相一致，因此選擇浸泡時間3 h、5 h、13 h做正交實(shí)驗(yàn)水平測定。

圖1 浸泡時間對生地抗氧化活性的影響Fig.1 The effect of soaking time on antioxidant activity of driedrehmannia root

2.1.2 煎煮次數(shù)對生地抗氧化活性的影響

從圖2中可以看出，煎煮4次后得到的供試品DPPH自由基清除率達(dá)到最高，然后再增加煎煮次數(shù)則導(dǎo)致其DPPH自由基清除率下降。供試品DPPH自由基清除率變化規(guī)律從梓醇、地黃苷D以及毛蕊花糖苷等組分含量相似變化趨勢得到驗(yàn)證。由此選擇煎煮次數(shù)2、3、4做正交試驗(yàn)水平測定。

圖2 煎煮次數(shù)對生地抗氧化活性的影響Fig.2 The effect of decoction times on antioxidant activity of driedrehmannia root

2.1.3 煎煮時間對生地抗氧化活性的影響

由圖 3可知，從20到60 min隨著煎煮時間增加，供試品對DPPH自由基清除率呈現(xiàn)明顯上升的趨勢，在40 min時達(dá)到最高值，之后其DPPH自由基清除率呈現(xiàn)緩慢下降的趨勢。梓醇、地黃苷D以及毛蕊花糖苷等組分含量隨煎煮時間變化規(guī)律與供試品DPPH自由基清除趨勢率吻合。因此，選擇煎煮時間20～40 min做正交實(shí)驗(yàn)水平測定。

圖3 煎煮時間對生地抗氧化活性的影響Fig.3 The effect of decoction time on antioxidant activity of driedrehmannia root

2.2 生地抗氧化活性正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

從表3可以直觀地看出RC值最大，很顯然因素C(煎煮時間)對生地抗氧化活性影響最大，為關(guān)鍵影響因素。這一點(diǎn)在表4方差分析中FC=4.58大于F0.05(2, 8)(4.46)可以得到驗(yàn)證。綜合生產(chǎn)成本等因素最終確定提高生地抗氧化活性的最優(yōu)工藝條件為A3B2C2，即浸泡時間13 h、煎煮次數(shù)3次、煎煮時間 30 min。按最佳工藝條件重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，其供試品DPPH自由基清除率為98.05%±0.0058%，說明該工藝流程設(shè)計(jì)穩(wěn)定可行，具有較好的改進(jìn)生地抗氧化活性的效果。

表3 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 The orthogonal experimental design and results

表4 方差分析結(jié)果 Table 4 The results of variance analysis

3 結(jié) 論

本研究以DPPH自由基清除率為指標(biāo)，同時監(jiān)測其抗氧化主要成分梓醇、地黃苷D、毛蕊花糖苷含量變化，設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)對生地抗氧化活性進(jìn)行研究，考察影響生地抗氧化活性的關(guān)鍵因素，最終確定了提高生地抗氧化活性的最佳工藝，同時發(fā)現(xiàn)生地抗氧化活性大小與其抗氧化成分含量正向相關(guān)，為建立合理的綜合評價(jià)方法評價(jià)其抗氧化能力提供重要參考。