植物精油調控反芻動物瘤胃發(fā)酵和甲烷排放的研究進展

董春曉，郭曉飛，李義海，楊 晶，王 娟，張金龍*，張效生*

(1. 天津市農業(yè)科學院 畜牧獸醫(yī)研究所，天津 300381；2. 天津市畜禽健康養(yǎng)殖技術工程中心，天津 300381)

反芻動物瘤胃中的微生物可通過降解飼料養(yǎng)分產生揮發(fā)性脂肪酸，并合成微生物蛋白質，為動物機體活動提供能量和蛋白質，但同時也存在排放甲烷和氨的弊端。甲烷是地球大氣中主要的溫室氣體之一，其導致全球氣候變暖的潛勢是CO的21倍(20年水平)。而反芻動物腸道排放甲烷不僅污染環(huán)境，且會造成飼料能量損失(損失8%～12%)，降低動物生產性能。同時，瘤胃微生物降解飼料蛋白質產生的氮超過80%通過糞便和尿液排出，這嚴重降低了反芻動物對蛋白質的利用率。因此，迫切需要通過某些措施來減少反芻動物甲烷排放量和氮排泄量，以降低畜牧業(yè)生產對環(huán)境的影響，并提高該產業(yè)發(fā)展的可持續(xù)性。在飼料中添加抗生素可調控反芻動物瘤胃微生物區(qū)系，降低瘤胃中的甲烷產量和能量損失。但抗生素藥物殘留和耐藥菌株的出現，增加了其使用風險，使得植物提取物、益生菌和酵母等綠色添加劑成為研究熱點。

近年來，大量評估植物提取物(皂苷、植物精油和單寧)生物活性的研究發(fā)現，它們具備調控瘤胃微生物發(fā)酵、提高飼料利用率、減少甲烷排放和氮排泄的能力。其中，植物精油可有效改善瘤胃發(fā)酵的幾個重要方面，如減緩淀粉和蛋白質的降解、降低瘤胃內氮代謝和氮排放，同時抑制甲烷產生。有研究證實，植物精油可與微生物細胞膜相互作用，從而抑制某些革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的生長，改變瘤胃微生物區(qū)系，降低甲烷和氨氮排放，使瘤胃發(fā)酵模式向有利于動物生產的方向發(fā)展。 但植物精油對反芻動物瘤胃發(fā)酵和甲烷排放的影響并非完全一致，這與精油的化學組成、添加劑量以及試驗對象的選擇息息相關。本文綜述了植物精油對反芻動物瘤胃發(fā)酵和甲烷排放的影響，旨在為今后將植物精油合理應用于反芻動物生產提供理論依據。

1 植物精油的化學成分及生物學功能

1.1 植物精油的主要化學成分

植物精油是一類植物次生代謝產生的復雜混合物，主要由醇、醛、酮、酯和醚等碳氫化合物組成。植物精油可分為萜類化合物(來源于甲羥戊酸和脫氧木糖途徑)和苯丙素類化合物(來源于莽草酸途徑)兩大類。大多數植物精油屬于萜類化合物，并且最具代表性的是單萜，其含量可高達90%，如檸檬油精、百里香酚、香芹酚、芳樟醇、香芹酮和乙酸香葉酯。而苯丙素類化合物并不是植物精油中普遍存在的物質，其僅在肉桂、丁香和茴香中大量存在，在大多數植物精油中，苯丙素類化合物的含量都低于萜類化合物。在自然界中，植物產生精油主要是為了抵御捕食者、寄生蟲和疾病等環(huán)境壓力。一些植物精油還可保護植物免受種間競爭，并能吸引昆蟲參與它們的繁殖過程。

植物精油是親脂性化合物，一般密度比水低，通常在植物的根、莖、葉、花、果實或樹皮的特殊細胞或細胞群中產生。植物精油的化學成分可能受多種因素影響，如植物的種類和生長期，植物的生長環(huán)境(土壤的營養(yǎng)、溫度和水分)以及精油的提取方法。植物精油的常見提取方法有水蒸氣蒸餾法、微波輔助蒸餾法、有機浸提法、壓榨法、超臨界CO萃取法、超聲波萃取法和無溶劑微波萃取法等，其中，水蒸氣蒸餾法是植物精油工業(yè)生產中最常用的方法。

1.2 植物精油的主要生物學功能

研究表明，植物精油的親脂性質使其具有增加微生物細胞滲透性的能力，這種能力可能會干擾一些必需依賴蛋白質或者酶的反應，如：電子傳遞、蛋白轉運、磷酸化反應和ATP生成，甚至可能引起細胞質凝固和細胞裂解。有一些植物精油(醛類)還可通過與核酸和蛋白質反應，從而導致微生物失活。另有一些植物精油(酚類)，如香芹酚、丁香酚和百里香酚，可以與微生物細胞膜上的轉運蛋白及微生物酶作用，產生較強的抗微生物能力。作為一類混合物，植物精油包含的不同化學成分間可能具有累加、拮抗或協同作用。目前，有關植物精油的研究多圍繞百里香、牛至、丁香、肉桂、迷迭香、蒔蘿、桉樹、大蒜和茴香開展。百里香精油和牛至精油主要由百里香酚和香芹酚等單萜類化合物組成，其結構中的羥基和移位的電子可以通過氫橋為主要活性位點與水作用，從而使其具有較強的抗微生物活性。另有研究表明，百里香酚和香芹酚可通過裂解細胞膜、釋放脂多糖和增加細胞膜對ATP的滲透性，從而對革蘭氏陰性菌表現抗菌活性。丁香精油的主要化學成分是丁香酚，丁香酚可與蛋白質結合，抑制酶活力，并可促使細胞裂解，對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌均表現出廣泛的抗菌活性。肉桂精油中亦含有丁香酚(8%)，但其主要化學成分為肉桂醛(75%)，肉桂醛中羰基的存在可破壞細胞膜的完整性、結合蛋白質、抑制微生物酶活力并消耗細胞ATP。迷迭香、蒔蘿和桉樹等許多植物中均存在諸如1,8-桉樹腦、α-蒎烯、香芹酮、γ-萜品烯和檸檬烯的單萜類化合物，它們的生物活性主要歸因于烷基的存在。此類化合物可以影響微生物細胞的生長和能量代謝，但其抗菌性不及植物精油中的酚類和醛類化合物。大蒜精油中富含有機硫化合物，如大蒜素和二烯丙基一硫化物，這兩種化合物是大蒜精油對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌具有較強抗菌活性的關鍵，該類有機硫化合物可與特定的膜蛋白作用，以致破壞細胞膜的完整性。茴香精油幾乎完全由茴香腦組成，而有關茴香腦的作用機制知之甚少，其生物學活性可能與芳族環(huán)上的醚基密切相關。

2 植物精油對反芻動物瘤胃發(fā)酵和甲烷產量的影響

2.1 植物精油對瘤胃微生物的影響

瘤胃微生物在飼料發(fā)酵、甲烷產生和氮利用過程中起著關鍵性作用，其活性直接影響反芻動物的生產性能和健康狀況。研究表明，植物精油對多種瘤胃微生物表現出抗菌活性，可以改變瘤胃微生物結構。Kim等研究發(fā)現，添加2 g·L混合植物精油，可顯著提高瘤胃液中原蟲、真菌、溶纖維丁酸弧菌和黃色瘤胃球菌的數量，但對普雷沃氏菌和產琥珀酸絲狀桿菌無顯著影響。而Patra和Yu測得，丁香精油、牛至精油和薄荷精油(1 g·L)均可顯著降低瘤胃液中嗜淀粉瘤胃桿菌和棲瘤胃普雷沃氏菌的數量，并能顯著降低瘤胃原蟲的數量。Cobelis等同樣發(fā)現，添加1.125 mL·L牛至精油顯著降低了瘤胃液中古細菌、普雷沃氏菌及總菌數量。此外，植物精油可有效降低瘤胃液中產甲烷菌(古細菌)的數量，但同時也影響了白色瘤胃球菌、黃色瘤胃球菌和產琥珀酸絲狀桿菌等纖維分解菌的豐度，且抑制了原蟲的生長(表1)。這意味著植物精油可在降低反芻動物腸道甲烷產量方面發(fā)揮有利作用，且可能對飼糧纖維的消化利用產生不良影響。然而，事實證明，甲烷產量并不總是伴隨古細菌豐度的降低而減少，因為影響產甲烷過程的因素是多方面的，且與產甲烷途徑相關的基因在不同的產甲烷菌種中有不同的表達。比如，Agarwal等研究發(fā)現，添加0.33 μL·mL薄荷精油增加了瘤胃液中產甲烷菌的數量，但甲烷產量降低20%，揮發(fā)性脂肪酸(volatile fatty acid, VFA)產量未受影響。因此，深入了解產甲烷菌和其他瘤胃微生物種群(細菌、原蟲和真菌)之間的關系將有助于改善瘤胃功能。另有一些研究指出，瘤胃內的高效產氨菌對植物精油表現出一定的敏感性。如Patra和Yu報道，棲瘤胃普雷沃氏菌、布氏普雷沃氏菌、嗜胺梭菌、斯氏梭菌和溶纖維丁酸弧菌均明顯受植物精油的影響。Patra和Yu還通過微陣列分析發(fā)現，植物精油對瘤胃微生物群落組成的影響取決于所選精油的化學性質。具有酚類結構的化合物(如牛至精油)，相比其他植物精油，在減少厚壁菌門、梭菌綱和丁弧菌屬的豐度方面表現出更強的抗菌活性。由此可見，植物精油在一定程度上可調控瘤胃微生物區(qū)系，但這種影響可能因植物精油的來源、化學組成和劑量的不同而存在較大差異。

表1 植物精油對瘤胃微生物的影響Table 1 Effects of essential oils on rumen microorganisms

2.2 植物精油濃度及瘤胃微生物適應性對揮發(fā)性脂肪酸產量的影響

研究表明，補充植物精油可提高反芻動物瘤胃內總揮發(fā)性脂肪酸(total volatile fatty acid, TVFA)的濃度。例如，在一項體內試驗中，飼喂綿羊400 mg·kg混合植物精油可顯著提高瘤胃內TVFA濃度，且未改變飼料中各養(yǎng)分的消化率。而另一項體內研究表明，飼喂綿羊混合植物精油(0.8 mL·d或1.6 mL·d)不影響瘤胃內TVFA濃度和VFA比例。這可能是由于反芻動物的飼糧組成不同，導致了混合植物精油對瘤胃內TVFA濃度的影響差異。如Benchaar等報道，當飼喂泌乳奶?；旌现参锞?750 mg·d)時，苜蓿青貯飼糧組奶牛瘤胃中TVFA的濃度趨于提高；而玉米青貯飼糧組奶牛瘤胃中TVFA的濃度趨于降低。大多數研究中，補充植物精油或其化學成分，將導致瘤胃液中TVFA濃度降低或者不變(表2)。且植物精油對VFA濃度的影響還可能與其添加劑量相關。比如，Blanch等通過體外發(fā)酵試驗測得，低劑量(200 mg·L或300 mg·L)混合植物精油不影響瘤胃液中TVFA的濃度，而當精油添加劑量為400 mg·L時，則顯著降低了瘤胃液中TVFA的濃度及乙酸比例，且顯著提高了丙酸和丁酸的比例。Joch等也報道了類似的結果，只有混合植物精油添加量高達600 mg·L后方能顯著降低瘤胃液中TVFA的濃度，同時顯著提高丁酸比例。Wu等通過體外研究同樣發(fā)現，柚皮精油添加量為0.8 mL/L時，不影響瘤胃液中TVFA的濃度；而當添加量增至1.6 mL/L時，瘤胃液中TVFA的濃度顯著降低。此外，一些研究結果還表明，植物精油的抗菌活性可能會隨著時間的推移而改變，從而影響了瘤胃內VFA的產量。如Soltan等報道，飼喂綿羊植物精油(400 mg·kg)的前兩天顯著提高了瘤胃內丁酸的含量，但顯著降低了丙酸的含量；而從第三天開始，丁酸含量下降，丙酸含量則得以顯著提高，由此可見，參與丙酸生成的微生物似乎比產生丁酸的微生物對植物精油有更高的耐受性。Poudel等的研究也證實了，參與丙酸生成的棲瘤胃普雷沃氏菌能夠在植物精油濃度逐漸升高的環(huán)境中生長。綜上所述，低劑量植物精油似乎未能改變瘤胃中VFA的產量，而若增加植物精油劑量，瘤胃微生物亦能隨著時間的推移適應植物精油的存在，因此認為植物精油只能在短期內影響VFA產量。

表2 植物精油對瘤胃發(fā)酵參數的影響Table 2 Effects of essential oils on rumen fermentation parameters

2.3 植物精油對瘤胃氮代謝的影響

在瘤胃中，絕大多數的飼糧粗蛋白質被微生物降解為氨，這是瘤胃微生物的主要氮源，有時甚至是唯一的氮源。而氨在瘤胃的產生速度遠超于微生物的利用速度，因此，過量的瘤胃蛋白質水解和脫氨作用會導致反芻動物吸收過多的氨，這些氨被轉化為尿素，隨后主要通過尿液排出，從而造成環(huán)境污染增加。在生產中，可以通過添加影響瘤胃氮代謝的飼料添加劑，來減少反芻家畜的氮排泄。許多研究表明，添加植物精油能夠抑制瘤胃中的蛋白質水解，且其對瘤胃中的高產氨菌、嗜淀粉瘤胃桿菌和普雷沃氏菌具有選擇性抑制作用，這種抑菌能力可導致瘤胃氨產量顯著下降。已有許多研究顯示了植物精油緩解氨排放的能力(表2)。Cobellis等也發(fā)現，在體外發(fā)酵液中添加不同劑量牛至精油或迷迭香精油(1.0、1.5和2.0 g·L)，均可顯著降低氨的產量(59%～78%)。此外，Hani和Adibe指出，在體外發(fā)酵液中添加90 μg·g廣藿香精油，顯著降低了發(fā)酵液中NH-N濃度。Wu等通過向瘺管湖羊瘤胃中添加0.8mL·L柑橘精油也發(fā)現，湖羊瘤胃液中NH-N濃度顯著降低。李艷玲等的研究結果表明，在體外發(fā)酵液中添加低劑量茴香腦或百里香酚(50、100和200 mg·L)，對體外發(fā)酵液中NH-N濃度無顯著影響；但當精油添加量為400 mg·L時，均可顯著降低體外發(fā)酵液中NH-N濃度。而Soltan等研究發(fā)現，無論飼喂綿羊低劑量(200 mg·kg)商業(yè)混合植物精油，還是飼喂高劑量(400 mg·kg)均不影響瘤胃液中NH-N濃度。在另一些體內研究中也發(fā)現，瘤胃蛋白質代謝很少或者并未受到植物精油的干預，這可能是由于瘤胃微生物對植物精油的良好適應所致。此外，一些研究表明，植物精油對氮代謝的影響隨其化學成分的不同而存在差異，通常含有酚化合物的精油具有更高的抗菌活性。由此可見，不同研究結果因植物精油的化學成分、劑量和試驗方法的差別而異。因此，有必要進一步探討植物精油在體內試驗中對瘤胃氮代謝和微生物影響的系統知識，為合理運用植物精油調控瘤胃氮代謝，提高反芻動物的氮利用率提供理論依據。

2.4 植物精油對瘤胃甲烷產量的影響

甲烷是一種主要的溫室氣體，它在大氣中的排放與畜牧業(yè)，尤其是反芻動物的生產直接相關。研究表明，植物精油具有較強的抗菌活性，可抑制大多數微生物，特別是細菌的生長和存活。一些植物精油可直接抑制產甲烷古細菌的生長，進而抑制甲烷產生，還可通過抑制某些有助于產甲烷的微生物代謝過程而間接減少甲烷的產量。此外，植物精油也可能通過減少與古細菌共生的某些原生動物的豐度，進而減少甲烷排放?；谶@種對特定瘤胃微生物群落的選擇性抑制作用，各類植物精油已被用于減少反芻動物腸道甲烷排放。大量的體外研究表明，植物精油具有抑制甲烷排放和調控瘤胃發(fā)酵的功效(表2)。周瑞等通過體外研究同樣發(fā)現，瘤胃液發(fā)酵12、24和36 h時的甲烷產量，均隨牛至精油添加量的增加(100、400、700和1 000 mg·L)而線性下降。金恩望等也指出，在體外發(fā)酵液中添加茶樹油、肉桂油和丁香油均可降低甲烷體積分數，且當各精油添加量超過300 mg·L時，甲烷體積分數降低效果更顯著。Macheboeuf等報道，當植物精油添加量同為5 mM時，肉桂精油和牛至精油可減少98%的甲烷產量，而茴香精油只能抑制12%的甲烷產量。Patra和Yu測試了五種不同植物精油(丁香、桉樹、大蒜、牛至和薄荷)，得出添加量為1 g·L各處理甲烷產量均明顯減少，其中牛至精油和大蒜精油處理甲烷減少量最高。但是，也有部分結果表明，植物精油的抗產甲烷活性是非特異性的，其抑制甲烷排放的過程伴隨著飼料消化率的降低。這些不良影響的程度取決于所使用植物精油的成分和劑量以及所使用的發(fā)酵底物。目前，關于植物精油在反芻動物體內作用的研究較少。并且，大多數情況下，由于植物精油化學成分、動物日糧結構和飼喂方式的不同，體內研究往往顯示出矛盾的結果，這也為確定瘤胃中達到有效植物精油濃度所需添加的劑量增加難度。Soltan等和Klop等報道，給綿羊和奶牛飼喂混合植物精油(400 mg·kg；0.17 g·kg)，可顯著降低其甲烷產量。而Alemu等和Olijhoek等指出，給肉牛和奶牛補飼植物精油，并不能抑制甲烷排放。綜上所述，在體外研究中，植物精油可有效抑制甲烷排放。未來需通過進一步研究來系統評價植物精油在反芻動物體內的應用，以確定植物精油可在生產中使用的有效作用濃度。

3 小 結

大多數植物精油或其活性成分在高劑量測試中抑制了瘤胃微生物的發(fā)酵，這證實了植物精油具有一定的抗菌活性。在多數情況下，當體外發(fā)酵試驗中植物精油活性成分的濃度增加到500 mg·L以上時，其對微生物發(fā)酵的影響是有害的；在中等劑量下(50～500 mg·L)，一些精油能夠通過改變VFA的產生和蛋白質代謝來改變瘤胃發(fā)酵。通常，由于補充了植物精油或其活性成分，可觀察到乙酸丙酸比降低和丁酸濃度增加，以及甲烷產量的降低。而在蛋白質代謝方面，植物精油的作用機制可能與抑制脫氨作用有關。誠然，植物精油具有開發(fā)為瘤胃微生物發(fā)酵改良劑的潛力。但是，要將植物精油廣泛用于生產實踐中，仍存在許多困難。首先，植物精油的組成取決于許多因素，包括植物的種類、生長環(huán)境和生長階段、用于精油的植物部位以及提取方法；而目前，任何植物精油產品都沒有關于成分、結構和純度的標準，從而妨礙了對不同試驗中植物精油效果的了解，并阻礙了對所需植物精油的類型和劑量的確定。因此，今后的研究應詳細報道植物精油的來源、提取方法、化學成分、純度和使用劑量。其次，植物精油的化學穩(wěn)定性較低，暴露于光、氧氣和高溫環(huán)境中會加速轉化和降解，從而導致植物精油的質量、性能和抗菌活性損失或改變，因此，植物精油需妥善保存，以避免影響影響其功效。最后，迫切需要進行體內研究，以確定植物精油的最佳劑量，并確定瘤胃微生物對植物精油的適應性，以及評估動物產品中的植物精油殘留問題，為安全有效的利用植物精油提供理論基礎。