基于硬組織切片染色的頸椎鉤椎關(guān)節(jié)的解剖研究

李梓瑜，劉宇航，史 君，曲星月，袁宏偉，李 琨，陳 杰，李筱賀，王海燕，和雨潔，李志軍，張少杰，王 星

(1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)研究生院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110；3.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110；4.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110；5.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)數(shù)字醫(yī)學(xué)中心，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110)

鉤椎關(guān)節(jié)作為頸椎特有解剖結(jié)構(gòu)，對(duì)維持人體頸椎正常生理活動(dòng)起重要作用，其結(jié)構(gòu)受損可造成各類頸部疾病。鉤椎關(guān)節(jié)位于C2～C6椎體后外側(cè)，由后部?jī)蓚?cè)的小唇狀椎體鉤和相應(yīng)的椎體下斜坡構(gòu)成[1-2]。鉤椎關(guān)節(jié)特殊的解剖位置使其在頸椎的運(yùn)動(dòng)及疾病中扮演著重要角色。在頸椎活動(dòng)范圍內(nèi)，其外側(cè)關(guān)節(jié)的相關(guān)運(yùn)動(dòng)是頸椎獨(dú)特的活動(dòng)特征[3-4]。鉤椎關(guān)節(jié)的主要作用在于維持頸椎運(yùn)動(dòng)單元的穩(wěn)定性和活動(dòng)性，承受應(yīng)力負(fù)荷，防止椎間盤向外側(cè)或后外側(cè)突出[5-6]；其壓縮作用表現(xiàn)為在椎間孔處壓迫神經(jīng)根，以及鉤椎關(guān)節(jié)的骨贅側(cè)唇壓迫椎動(dòng)脈[7]。故鉤椎關(guān)節(jié)受損所帶來(lái)的一系列不良影響在臨床上具有重要研究?jī)r(jià)值。

經(jīng)檢索文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，以往對(duì)鉤椎關(guān)節(jié)的研究多為探討其解剖結(jié)構(gòu)，從而得到應(yīng)用于臨床方面的結(jié)論。例如：仝苗苗[8]利用影像學(xué)技術(shù)測(cè)量頸椎鉤椎關(guān)節(jié)的主要組成結(jié)構(gòu)及其相鄰骨性結(jié)構(gòu)的形態(tài)學(xué)參數(shù)，分析青少年頸椎組成結(jié)構(gòu)的生長(zhǎng)變化特點(diǎn)；王曉剛等[9]利用超聲檢查方法與圖像特征對(duì)頸椎重要骨性標(biāo)志及毗鄰結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，提供了具有實(shí)用價(jià)值的超聲引導(dǎo)下頸部結(jié)構(gòu)影像資料；王星等[2]對(duì)3歲兒童尸體標(biāo)本頸椎進(jìn)行連續(xù)切片并用蘇木精—伊紅染色，觀察學(xué)齡前期兒童鉤椎關(guān)節(jié)組織的發(fā)育特點(diǎn)，得出學(xué)齡前期兒童的頸椎尚未形成鉤椎關(guān)節(jié)的結(jié)論。但是目前極少有學(xué)者對(duì)鉤椎關(guān)節(jié)進(jìn)行組織結(jié)構(gòu)的細(xì)致研究，因此無(wú)法確定鉤椎關(guān)節(jié)內(nèi)部組織成分，無(wú)法分析其在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中組織形態(tài)方面的變化，本研究即針對(duì)這一問(wèn)題展開(kāi)了觀察與分析。

目前采用蘇木精—伊紅染色結(jié)合甲苯胺藍(lán)染色、番紅—固綠染色及阿爾新藍(lán)過(guò)碘酸雪夫等染色法可以全面客觀地觀察到目標(biāo)結(jié)構(gòu)的組織形態(tài)特征[10]。故本研究利用蘇木精—伊紅染色和甲苯胺藍(lán)染色對(duì)成人鉤椎關(guān)節(jié)進(jìn)行觀察，并對(duì)鉤椎關(guān)節(jié)的解剖結(jié)構(gòu)進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象與主要試劑、儀器

選取1例成年男性全頸椎標(biāo)本，截取C2～C6鉤椎關(guān)節(jié)進(jìn)行脫水固定包埋。蘇木精—伊紅試劑盒，甲苯胺藍(lán)試劑盒，光固化機(jī)，德國(guó)EXAKT300CP硬組織切片機(jī)，德國(guó)EXAKT400S磨片機(jī)，福爾馬林液，梯度乙醇(70%～95%)，無(wú)水乙醇，Technovit 7200樹(shù)脂液，320目、800目、1 200目、4 000目砂紙。

1.2 方法

標(biāo)本經(jīng)福爾馬林液固定48 h后流水沖洗24 h，行梯度乙醇(70%～95%)上行脫水(每步24 h)，入無(wú)水乙醇+Technovit 7200樹(shù)脂液(配制比3∶7)浸液浸泡2 d，入無(wú)水乙醇+Technovit 7200樹(shù)脂液(配制比1∶1)浸液浸泡2 d，入Technovit 7200樹(shù)脂液浸泡7 d后，再入Technovit 7200樹(shù)脂液浸泡3 d，于光固化機(jī)中包埋聚合。將標(biāo)本組織塊取出，使用德國(guó)EXAKT300CP硬組織切片機(jī)對(duì)組織塊進(jìn)行不脫鈣聯(lián)合切片，切片厚度為200 μm，以德國(guó)EXAKT400S磨片機(jī)依次使用320目、800目、1 200目砂紙將切片磨至厚度為25 μm，最后以4 000目砂紙對(duì)打磨好的切片進(jìn)行拋光。

蘇木精—伊紅染色：骨組織切片經(jīng)梯度乙醇復(fù)水，浸入蘇木精染色3～8 min，流水沖洗，浸入1%鹽酸酒精30 s進(jìn)行分化，水洗，蒸餾水過(guò)洗，0.6%氨水反藍(lán)，流水沖洗，切片入伊紅染液中染色1～3 min，蒸餾水稍洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，將切片從二甲苯中取出稍晾干，中性樹(shù)膠封片。

甲苯胺藍(lán)染色：骨組織切片經(jīng)梯度乙醇復(fù)水，甲苯胺藍(lán)染色約30 min，自來(lái)水沖洗，冰醋酸分化至細(xì)胞核清晰，自來(lái)水沖洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。

1.3 觀察指標(biāo)

觀察鉤椎關(guān)節(jié)中椎體、椎間盤、骨髓核、骨小梁、骨組織及骨髓組織的形態(tài)及結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。

2 結(jié)果

2.1 蘇木精—伊紅染色結(jié)果

蘇木精—伊紅染色的鉤椎關(guān)節(jié)側(cè)縱切面上可見(jiàn)上下椎體及中間的椎間盤。周圍結(jié)締組織與椎體相通處可見(jiàn)不著色的鈣鹽沉積，中間可見(jiàn)骨髓核(軟骨樣基質(zhì))，上下椎體切面可見(jiàn)粉染骨小梁，骨小梁之間可見(jiàn)紫色骨髓組織(圖1)。

2.2 甲苯胺藍(lán)染色結(jié)果

甲苯胺藍(lán)染色的鉤椎關(guān)節(jié)中可以觀察到成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的各種骨組織形態(tài)。切片中可見(jiàn)椎體切面藍(lán)染骨小梁，骨小梁體積、寬度及分布均正常(圖1)。

a:骨小梁；b:骨髓組織；c:鈣鹽沉積；d:骨髓核；e:鉤突(方框)

3 討論

鉤椎關(guān)節(jié)是成人頸椎的結(jié)構(gòu)，具有獨(dú)特性，其類似于“雙蓮橋關(guān)節(jié)”，最早由德國(guó)解剖學(xué)家Luschka在對(duì)成人頸椎的局部解剖過(guò)程中發(fā)現(xiàn)[11]。鉤椎關(guān)節(jié)作為頸椎特有的結(jié)構(gòu)，對(duì)頭顱及寰樞椎生長(zhǎng)發(fā)育、生物力學(xué)穩(wěn)定、三維支撐與多向運(yùn)動(dòng)、頸髓保護(hù)和脊柱多維運(yùn)動(dòng)起著至關(guān)重要的限制和保護(hù)作用[12]。詳細(xì)觀察鉤椎關(guān)節(jié)形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)有助于了解生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中鉤椎關(guān)節(jié)基本組織變化及內(nèi)部組織形成情況。

為研究鉤椎關(guān)節(jié)組織形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)，本實(shí)驗(yàn)將蘇木精—伊紅染色和甲苯胺藍(lán)染色作為基本染色法，結(jié)合硬組織切片技術(shù)對(duì)鉤椎關(guān)節(jié)形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行探討。硬組織切片技術(shù)能夠完整地保留骨組織原本的結(jié)構(gòu)及成分，因此已成為目前最常用的觀察骨組織的方式。其對(duì)于不脫鈣的骨組織切片具有極佳的適配性，對(duì)研究骨組織成分以及骨形成有重要作用[13]，對(duì)于了解生長(zhǎng)發(fā)育及組織構(gòu)成具有極大意義。既往文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，蘇木精—伊紅染色可避免因?yàn)殁}的存在而受影響的骨組織切片[14-16]。蘇木精—伊紅染色作為標(biāo)準(zhǔn)的染色方法，可將胞質(zhì)內(nèi)的核糖體及細(xì)胞核內(nèi)的染色質(zhì)染成紫藍(lán)色，將細(xì)胞質(zhì)染成紅色[17-18]，該染色法通過(guò)陰陽(yáng)離子互相結(jié)合，可起到加強(qiáng)固定效果[19]。在識(shí)別各種潛在的惡性病變中，甲苯胺藍(lán)是一種實(shí)用且有效的輔助診斷工具[20-21]，其吩噻嗪類堿性染料的特征可將細(xì)胞核染成藍(lán)色[22-23]。本研究在對(duì)鉤椎關(guān)節(jié)的觀察中采用蘇木精—伊紅染色和甲苯胺藍(lán)染色，在保留骨組織結(jié)構(gòu)的情況下簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)步驟，又避免了脫鈣失敗對(duì)鉤椎關(guān)節(jié)切片和染色的影響，兩種染色方法相結(jié)合，可見(jiàn)鉤椎關(guān)節(jié)骨小梁體積、寬度及分布均勻正常，骨髓組織分布于骨小梁之間，鈣鹽沉積在周圍結(jié)締組織與椎體相通處，上下椎體和椎間盤間隔鮮明。

在人體解剖結(jié)構(gòu)中，鉤椎關(guān)節(jié)及其毗鄰結(jié)構(gòu)對(duì)頸椎疾病的發(fā)生有著重要影響。Clausen等[24]對(duì)鉤椎關(guān)節(jié)生物力學(xué)進(jìn)行了有限元分析發(fā)現(xiàn)，鉤椎關(guān)節(jié)的形成對(duì)下頸椎耦合運(yùn)動(dòng)起著重要作用，其可增加頸椎的活動(dòng)度，而鉤椎關(guān)節(jié)中鉤突的形成卻對(duì)頸椎活動(dòng)有著限制力學(xué)載荷的影響。鉤突的病變或增生可壓迫和刺激周圍的血管與神經(jīng)，從而產(chǎn)生不同類型頸椎病的相關(guān)癥狀[25-26]；鉤突也是骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生的常見(jiàn)部位，關(guān)節(jié)表面因摩擦受損形成點(diǎn)蝕和磨痕，鉤突變形成為骨贅刺，從而導(dǎo)致椎間孔狹窄[27-28]。鉤突骨贅也可引起頸椎刺激或頸椎節(jié)段性不穩(wěn)定[29-30]，骨贅的形成會(huì)壓迫椎動(dòng)脈及交感神經(jīng)，對(duì)頸椎型心絞痛的發(fā)病機(jī)制產(chǎn)生一定的影響[31]。

鉤椎關(guān)節(jié)作為最早退變的關(guān)節(jié)之一，不僅會(huì)導(dǎo)致成人疾病，在兒童生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中也起著重要作用。隨著現(xiàn)代影像技術(shù)和相關(guān)研究手段的不斷深入，普遍認(rèn)為鉤椎關(guān)節(jié)是根據(jù)頸椎發(fā)育的生物力學(xué)及隨著年齡的增長(zhǎng)、負(fù)重增加，頸椎鉤突區(qū)域發(fā)生變化而形成的，即為反應(yīng)性骨形成和退行性變的結(jié)果[32-33]。而兒童頸椎活動(dòng)度有限，且頸椎負(fù)重較小，所以在兒童時(shí)期未形成鉤椎關(guān)節(jié)[2]。故對(duì)鉤椎關(guān)節(jié)的形成及影響等臨床研究還有待深入。

綜上，硬組織切片技術(shù)可以較完整地保留鉤椎關(guān)節(jié)的固有組織形態(tài)，通過(guò)蘇木精—伊紅染色及甲苯胺藍(lán)染色可清晰地觀察成人鉤椎關(guān)節(jié)的組織形態(tài)及各層結(jié)構(gòu)。