復(fù)方芪苓顆?！耙粶y(cè)多藥”薄層鑒別方法研究

顏繼忠1，陳 憶1，應(yīng)旭輝，姜慧潔1，黃 薇1，張 慧1，劉 靂

(1.浙江工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 杭州 310014；2.正大青春寶藥業(yè)有限公司，浙江 杭州 310023)

復(fù)方芪苓顆粒(Fufang Qiling granules, FQG)是杭州中醫(yī)院臨床經(jīng)驗(yàn)方，由黃芪、丹參、土茯苓、秦艽、薏苡仁、桑寄生以及山慈菇組方而成，療效顯著，具有健脾益氣、化瘀泄?jié)岷颓鍩崂麧竦墓δ埽R床上可用于治療高尿酸血癥，具有降低患者的血尿酸和血脂的作用[1-3]。西醫(yī)治療高尿酸血癥主要使用別嘌醇、秋水仙堿和苯溴馬隆等[4-5]，上述藥物均存在損傷肝腎的不良反應(yīng)，臨床應(yīng)用受到諸多限制[6-7]。中醫(yī)藥治療高尿酸血癥具有明顯的優(yōu)勢(shì)，多種中藥具有明顯降低尿酸的功效[8-10]，且中藥復(fù)方制劑具有增效減毒的優(yōu)勢(shì)，不良反應(yīng)較少。復(fù)方制劑一般成分復(fù)雜，藥材的質(zhì)量?jī)?yōu)劣直接影響復(fù)方制劑的療效。如何快速鑒別復(fù)方制劑中藥材的質(zhì)量，對(duì)提升產(chǎn)品質(zhì)量至關(guān)重要。

目前，醫(yī)院制劑的開發(fā)是中藥發(fā)展的一個(gè)大方向，但是醫(yī)院制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中薄層鑒別方法往往比較單一，未依據(jù)“君臣佐使”指導(dǎo)原則對(duì)多味關(guān)鍵藥材進(jìn)行定性，僅針對(duì)單味藥進(jìn)行單獨(dú)鑒別，即每種藥材都要單獨(dú)優(yōu)化其供試品制備方法、薄層展開劑和展開條件等，費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、費(fèi)試劑，且檢測(cè)周期長(zhǎng)，給質(zhì)檢部門帶來(lái)極大的工作量。因此，尋找一種簡(jiǎn)便、快捷的中藥復(fù)方制劑檢測(cè)方法，以提高檢測(cè)效率并降低檢測(cè)成本，是中藥質(zhì)量控制必須突破的難關(guān)[11-12]。2020年5月試行的《中藥新藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究技術(shù)指導(dǎo)原則(試行)》建議盡可能多地定性、定量檢測(cè)處方中的藥味，包括建立中藥的含量測(cè)定方法[13-14]、中藥指紋圖譜方法[15-17]以及鼓勵(lì)建立同時(shí)鑒別多個(gè)藥味的薄層色譜方法。為了提高中成藥的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，更好地控制其質(zhì)量，遵循“君臣佐使”指導(dǎo)原則建立“一測(cè)多藥”的鑒別方法，即可在同一薄層色譜條件下鑒別處方中的丹參(君藥)、土茯苓(臣藥)和秦艽(臣藥)3味藥材。該方法操作簡(jiǎn)單快速、專屬性強(qiáng)以及耐用性好，進(jìn)一步完善了復(fù)方芪苓顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，為新藥開發(fā)并申請(qǐng)臨床前研究批件提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀 器

SQP型電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司，精度為十萬(wàn)分之一)，F(xiàn)A2204N型電子天平(上海菁海儀器有限公司，精度為萬(wàn)分之一)，KQ-250DB型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，R210+V700型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士Buchi公司)，WD-9403A型紫外光燈(北京六一生物科技有限公司)。

1.1.2 試 劑

丹酚酸B對(duì)照品(批號(hào)為PS000278)，落新婦苷對(duì)照品(批號(hào)為PS000649)，龍膽苦苷對(duì)照品(批號(hào)為PS010119)，黃芪甲苷對(duì)照品(批號(hào)為PS010427)，甘油三油酸酯對(duì)照品(批號(hào)為PS012239)，槲皮素對(duì)照品(批號(hào)為PS010462)均購(gòu)自成都普思生物科技有限公司；復(fù)方芪苓顆粒(批號(hào)為21001，21002，21003)。HSGF254型薄層色譜硅膠板(煙臺(tái)江友硅膠開發(fā)有限公司，批號(hào)為20190912)，HSGF254型薄層色譜硅膠預(yù)制板(德國(guó)默克集團(tuán)，批號(hào)為HX98648854)，HSGF254型薄層色譜硅膠板(青島海洋硅膠有限公司，批號(hào)為20190912)，HSG型薄層色譜硅膠板(煙臺(tái)江友硅膠開發(fā)有限公司，批號(hào)為20200515)，HSG型薄層色譜硅膠板(青島海洋硅膠有限公司，批號(hào)為20200901)，HSG型薄層色譜硅膠板(德國(guó)默克集團(tuán)，批號(hào)為HX90656126)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 供試品溶液的制備

取復(fù)方芪苓顆粒0.5 g，加入甲醇5 mL，超聲處理30 min，取上清液，作為供試品溶液。

1.2.2 陰性對(duì)照溶液的配制

取缺丹參、缺土茯苓和缺秦艽的陰性顆粒，按照供試品制備方法制成陰性對(duì)照溶液。

1.2.3 對(duì)照品溶液的配制

取丹酚酸B、龍膽苦苷和落新婦苷對(duì)照品，加甲醇分別制成每1 mL含1 mg丹酚酸B、1 mg龍膽苦苷和1.5 mg落新婦苷的混合溶液，作為對(duì)照品溶液。

1.2.4 “一測(cè)多藥”鑒別方法

吸取供試品溶液、對(duì)照品溶液以及陰性對(duì)照溶液各4 μL，點(diǎn)樣于同一塊硅膠GF254板上，以V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)∶V(甲醇)∶V(無(wú)水甲酸)=2∶7∶1∶0.5為展開體系進(jìn)行展開，取出并晾干，在254 nm紫外光燈下進(jìn)行檢視。

2 結(jié)果與分析

2.1 “一測(cè)多藥”展開體系的優(yōu)化

2.1.1 不同展開體系的考察

參考文獻(xiàn)[18-19]及2020版《中國(guó)藥典》中丹參(三氯甲烷-甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸)、土茯苓(甲苯-乙酸乙酯-甲酸)和秦艽(乙酸乙酯-甲醇-水)鑒別項(xiàng)下所使用的展開溶劑，對(duì)“一測(cè)多藥”的展開體系進(jìn)行優(yōu)化。取供試品溶液點(diǎn)樣于硅膠GF254薄層板上，選取3種展開劑體系進(jìn)行展開，分別為展開劑1(石油醚-乙酸乙酯-甲醇-無(wú)水甲酸)、展開劑2(石油醚-乙酸乙酯-甲苯-無(wú)水甲酸)和展開劑3(石油醚-乙酸乙酯-三氯甲烷-無(wú)水甲酸)。展開體系如圖1所示，石油醚-乙酸乙酯-甲醇-無(wú)水甲酸展開體系相較于其他2個(gè)展開體系，其斑點(diǎn)分離度與清晰度都較優(yōu)，且其中的溶劑相較于三氯甲烷、甲苯毒性小。所以選擇石油醚-乙酸乙酯-甲醇-無(wú)水甲酸展開體系繼續(xù)進(jìn)行溶劑比例考察。

圖1 展開體系的考察Fig.1 Expanded system investigation

2.1.2 展開體系比例的考察

對(duì)上述優(yōu)選的展開體系比例進(jìn)行考察，結(jié)果如圖2所示。取供試品溶液點(diǎn)樣于硅膠GF254薄層板上，選取3種不同體積比的石油醚-乙酸乙酯-甲醇-無(wú)水甲酸進(jìn)行展開，分別為比例1(體積比為2∶7∶1∶1)，比例2(體積比為2∶7∶1∶0.5)，比例3(體積比為2∶7∶1∶0.3)。如圖2所示，V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)∶V(甲醇)∶V(無(wú)水甲酸)=2∶7∶1∶0.5展開體系最優(yōu)，可以達(dá)到快速鑒別復(fù)方芪苓顆粒中3味藥的目的。

圖2 展開體系比例的考察Fig.2 Proportion of expanded system investigation

2.2 “一測(cè)多藥”方法學(xué)考察

2.2.1 專屬性考察

分別取1.2.2節(jié)所述陰性對(duì)照溶液，按照供試品點(diǎn)樣量點(diǎn)樣于同一硅膠GF254板上，色譜圖如圖3所示。結(jié)果表明：丹酚酸B、落新婦苷和龍膽苦苷所出現(xiàn)的位置在供試品色譜中均能與之相對(duì)應(yīng)，且陰性對(duì)照色譜中均未出現(xiàn)干擾的斑點(diǎn)，說(shuō)明該方法的專屬性較強(qiáng)。

1，2，3—芪苓顆粒供試品溶液(批號(hào)分別為21001，21002，21003)；4—混合對(duì)照品溶液；5—缺丹參陰性對(duì)照溶液；6—缺土茯苓陰性對(duì)照溶液；7—缺秦艽陰性對(duì)照溶液。圖3 薄層專屬性色譜圖Fig.3 TLC chromatogram of specificity

2.2.2 點(diǎn)樣方式與點(diǎn)樣量考察

考察不同點(diǎn)樣方式(點(diǎn)狀點(diǎn)樣、條狀點(diǎn)樣)與點(diǎn)樣量(2，4，8，10 μL)對(duì)薄層色譜行為的影響，色譜圖如圖4所示。上述因素對(duì)復(fù)方芪苓顆粒的薄層色譜行為影響較小。結(jié)果表明：兩種點(diǎn)樣方式與不同點(diǎn)樣量均有較好的分離效果，點(diǎn)狀點(diǎn)樣與條狀點(diǎn)樣均可用于復(fù)方芪苓顆粒的薄層鑒別，供試品點(diǎn)樣量可以控制在2～10 μL。

1，2，3—點(diǎn)樣量為2 μL；4，5，6—點(diǎn)樣量為4 μL；7，8，9—點(diǎn)樣量為8 μL；10，11，12—點(diǎn)樣量為10 μL(芪苓顆粒供試品批號(hào)依次為21001，21002，21003)；13—混合對(duì)照品溶液；14—缺丹參陰性對(duì)照溶液；15—缺土茯苓陰性對(duì)照溶液；16—缺秦艽陰性對(duì)照溶液。圖4 不同點(diǎn)樣方式及點(diǎn)樣量的薄層色譜圖Fig.4 TLC chromatogram of different spotting methods and volumes

2.2.3 耐用性考察

考察不同廠家的高效硅膠板(Merck板，青島海洋板，煙臺(tái)江友板)、不同展開溫度((10±5)，(40±5) ℃)和不同相對(duì)濕度((20±2)%，(80±2)%)對(duì)薄層色譜行為的影響，色譜圖如圖5，6所示。結(jié)果表明：上述因素對(duì)復(fù)方芪苓顆粒的薄層色譜行為影響較?。徊煌瑥S家的薄層板均具有較好的分離效果，表明該鑒別對(duì)薄層板并沒(méi)有特殊選擇；環(huán)境溫度及濕度的變化對(duì)分離效果也無(wú)較大影響，溫度為10～40 ℃，濕度為20%～80%均可，無(wú)需進(jìn)行嚴(yán)格控制。

1，2，3—芪苓顆粒供試品溶液(批號(hào)依次為21001，21002，21003)；4—混合對(duì)照品溶液；5—缺丹參陰性對(duì)照溶液；6—缺土茯苓陰性對(duì)照溶液；7—缺秦艽陰性對(duì)照溶液。圖5 不同廠家薄層板的耐用性薄層色譜圖Fig.5 TLC chromatogramof durability from different manufacturers

1，2，3—芪苓顆粒供試品溶液(批號(hào)依次為21001，21002，21003)；4—混合對(duì)照品溶液；5—缺丹參陰性對(duì)照溶液；6—缺土茯苓陰性對(duì)照溶液；7—缺秦艽陰性對(duì)照溶液。圖6 不同溫濕度耐用性薄層色譜圖Fig.6 TLC chromatogram of durability at different temperatures and humidities

3 結(jié) 論

以“君臣佐使”理論為指導(dǎo)，提出了“一測(cè)多藥”的薄層鑒別思路，即通過(guò)一次薄層實(shí)驗(yàn)，對(duì)中藥復(fù)方制劑中的多味藥材進(jìn)行同步鑒別。以復(fù)方芪苓顆粒為例，“一測(cè)多藥”法可對(duì)顆粒中丹參(君藥)、土茯苓(臣藥)和秦艽(臣藥)3 味藥材進(jìn)行同步鑒別，且陰性顆粒對(duì)照無(wú)干擾。此外，相較于《中國(guó)藥典》中丹參(三氯甲烷-甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸)、土茯苓(甲苯-乙酸乙酯-甲酸)鑒別方法中使用的三氯甲烷、甲苯，該方法中所使用的石油醚、乙酸乙酯、甲醇和無(wú)水甲酸均為毒性較小的溶劑。綜上所述，復(fù)方芪苓顆粒的“一測(cè)多藥”的薄層鑒別方法僅需1種供試品制備方法和1種展開體系即可快速鑒別復(fù)方制劑中的多味藥，有效節(jié)約溶劑及人工成本，可為中藥復(fù)方制劑的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。

本文得到了浙江工業(yè)大學(xué)研究生實(shí)踐基地建設(shè)項(xiàng)目(GZ19621160006)的資助。