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    普氏原羚致病性大腸桿菌的分離及生物學(xué)鑒定

    2022-01-24 06:54:20李秀萍王世辰簡瑩娜林偉山王光華胡勇羅濤何玉邦趙殿智梁欽李成林馬利青
    青海畜牧獸醫(yī)雜志 2021年6期
    關(guān)鍵詞:普氏肉湯青海湖

    李秀萍,王世辰,簡瑩娜,林偉山,王光華,胡勇,羅濤,何玉邦,趙殿智,梁欽,李成林,馬利青

    (1.青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院,西寧810016;2.青海湖國家級自然保護(hù)區(qū)管理局,西寧810001;3.青海省剛察縣林草站,剛察812399)

    普氏原羚(Procapra przewalski)是一種極度瀕危的羚羊,也是中國特有的物種,被IUCN紅色名錄列為瀕危(EN)等級,是國家一級保護(hù)動物。1875年,俄羅斯探險(xiǎn)家普熱瓦爾斯基首次在內(nèi)蒙古鄂爾多斯采得本種的模式標(biāo)本,普氏原羚也因此得名。歷史上,普氏原羚曾分布于內(nèi)蒙古、甘肅、寧夏和青海的廣大地區(qū)。

    20世紀(jì)60年代,普氏原羚曾是青海湖地區(qū)一種常見動物,而1994年在青海湖周邊地區(qū)僅發(fā)現(xiàn)約300只左右[1]。1999年被列入《中國瀕危動物紅皮書》,在2017年的IUCN紅皮書中被列為瀕危(EN)物種(IUCN/SSC,2017)。青海省林業(yè)局和中科院西北高原生物研究所對普氏原羚調(diào)查表明,普氏原羚現(xiàn)存7個(gè)相互隔離的種群,分別是元者、湖東、海晏剛察、塔勒旋果、鳥島、生格和切吉灘[2]。

    據(jù)青海湖巡湖員講述,每年在巡湖過程中都會發(fā)現(xiàn)一些死亡的普氏原羚尸體。為確診本次普氏原羚幼齡羊死亡的原因,進(jìn)行了相關(guān)病原診斷及病原菌生物學(xué)特性分析試驗(yàn),具體試驗(yàn)如下。

    1 發(fā)病情況

    2021年9月18日,剛察縣哈爾蓋鎮(zhèn)某牧民發(fā)現(xiàn)1只普氏原羚幼齡公羊不合群,精神沉郁,隨后臥地不起,最后死亡,遂反映給保護(hù)站,由保護(hù)站送檢至青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院獸醫(yī)生物技術(shù)研究室進(jìn)行病原診斷。

    2 剖檢變化

    心臟腫大,心包積液;肝臟有2個(gè)豌豆大小的鈣化結(jié)節(jié)灶;脾臟正常;肺臟氣腫,左側(cè)肺小葉尖部背側(cè)有4×4mm大小的淤血斑塊;腎臟未見異常;腸淋腫大;小腸鼓氣,腸壁變薄,內(nèi)充滿黃色稀便;結(jié)腸腸壁增厚,有出血點(diǎn);回盲口有潰瘍。

    3 分離培養(yǎng)

    無菌采集病死普氏原羚的心、肝、脾、肺、腎、腸淋、胃腸內(nèi)容物等接種至普通肉湯、鮮血平板和VF培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng)24h。脾臟培養(yǎng)物中,普通營養(yǎng)肉湯變渾濁,表面有菌膜;鮮血平板上有灰色、中等大小、具有β溶血的圓形菌落。將可疑菌落接種于麥康凱和伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基中,經(jīng)37℃培養(yǎng)24h后,在麥康凱培養(yǎng)基上可見玫紅色菌落,在伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上為黑色帶金屬光澤菌落。

    4 小鼠致死性試驗(yàn)

    經(jīng)鮮血平板純化的分離菌株接種至普通肉湯,分別取18h普通肉湯培養(yǎng)物0.2 mL和0.5 mL,經(jīng)腹腔注射昆明系實(shí)驗(yàn)小鼠各3只,對照組2只注射相應(yīng)劑量的營養(yǎng)肉湯,結(jié)果0.5 mL劑量組的3只小鼠在注射后12h內(nèi)死亡;0.2 mL劑量組的2只小鼠在24h內(nèi)死亡;對照組未出現(xiàn)異常。將致死小鼠的脾臟再次培養(yǎng)后,分離到相同形態(tài)的細(xì)菌。

    5 生化試驗(yàn)

    從細(xì)菌微量生化鑒定管中選取用于鑒定腸桿菌科的生化鑒定管(葡萄糖、乳糖、甘露醇、MR-VP、靛基質(zhì)均購自杭州微生物試劑有限公司),將分離菌分別接種至生化鑒定管中,置37℃溫箱培養(yǎng)24h,分離菌株能發(fā)酵葡萄糖、乳糖;甘露醇產(chǎn)酸產(chǎn)氣;MR試驗(yàn)陽性;VP試驗(yàn)和靛基質(zhì)試驗(yàn)陰性,符合大腸桿菌的特性(表1)。

    表1 普氏原羚肺臟分離菌株生化試驗(yàn)結(jié)果

    6 分子生物學(xué)檢測

    對該菌進(jìn)行分離、純化培養(yǎng)后,利用細(xì)菌16S rRNA特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增(見圖1),擴(kuò)增產(chǎn)物送樣測序,經(jīng)序列比對分析表明,分離菌株為大腸桿菌。

    圖1 分離菌16S rRNA基因擴(kuò)增結(jié)果

    7 藥物敏感性試驗(yàn)

    藥物敏感性試驗(yàn)表明,該菌株對磺胺甲惡唑(SXT25)、諾氟沙星(NOR10)、氯霉素(C30)和環(huán)丙沙星(CIP5)高度敏感;對強(qiáng)力霉素(DO30)、四環(huán)素(TE30)、卡那霉素(K30)中等敏感;對呋喃妥因(P10)、桿菌肽(B10)和多黏霉素(CT10)耐藥(詳見表2)。

    表2 分離菌株藥物敏感性試驗(yàn)

    8 小結(jié)

    經(jīng)臨床癥狀,剖檢變化,病原菌的分離培養(yǎng),生化發(fā)酵試驗(yàn),致病性試驗(yàn),PCR及測序分子鑒定,藥物敏感試驗(yàn),表明該普氏原羚幼齡羊是感染了致病性大腸桿菌死亡,且該菌株具有一定耐藥性。

    9 討論

    近年來,隨著普氏原羚種群保護(hù)力度的加大,其種群數(shù)量有所增加,但仍然沒有達(dá)到人們期望的理想數(shù)量。普氏原羚的死亡原因較多,狼是原羚的主要天敵,能造成15%~20%的死亡,網(wǎng)圍欄掛傷死亡比例占5%,報(bào)道稱原羚采食垃圾后導(dǎo)致消化不良而死亡現(xiàn)象較多[3]。也有學(xué)者認(rèn)為體內(nèi)外寄生蟲病也是死亡的原因之一[4-6]。霍賓等[7](2020)認(rèn)為原羚的死亡與機(jī)體嚴(yán)重缺硒有一定的關(guān)聯(lián)。李忠秋[8](2016)認(rèn)為與普氏原羚的性別、群體類型、群體大小、捕食風(fēng)險(xiǎn)、人類干擾等有關(guān)。董逵才[9](2016)認(rèn)為環(huán)湖地區(qū)的草場圍欄和硬化渠道等人工設(shè)施是影響普氏原羚生存和發(fā)展的主要因素。本次試驗(yàn)結(jié)果表明,牛、羊跟普氏原羚共享一個(gè)草場,使得家養(yǎng)動物跟野生動物之間可能存在動物疫病的相互傳播。

    本次實(shí)驗(yàn)室檢測雖分離得到了致病性大腸桿菌,但并沒有進(jìn)行病原菌的動物溯源調(diào)查,從藥物敏感性試驗(yàn)的結(jié)果來看,分離菌株已經(jīng)產(chǎn)生一定耐藥性,間接說明分離菌株有可能感染自放牧家畜或棲息環(huán)境中,因?yàn)檎G闆r下野生動物是不會接觸到相關(guān)抗菌素的。

    同時(shí),本研究室在另外的研究中進(jìn)行過致病性大腸桿菌的動物溯源調(diào)查[10],隨著野生動物病原分離培養(yǎng)的積累,在今后的研究中將會開展類似的動物病原溯源調(diào)查,以此來為控制野生動物和家養(yǎng)動物感染大腸桿菌相關(guān)疾病提供技術(shù)依據(jù)。

    致謝在樣品采集過程中得到青海湖國家級自然保護(hù)區(qū)管理局和剛察縣林草站的大力支持,在此一并致謝。

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