6種非洲豬瘟熒光PCR試劑盒對比試驗(yàn)

彭苗苗，杜麗飛，王 慧，楊 俊，邱美珍，劉伯承，周望平，危 婷

（1.湖南省畜牧獸醫(yī)研究所，湖南長沙410131；2.湖南鑫廣安農(nóng)牧股份有限公司,湖南長沙410131）

非洲豬瘟（African swine fever,ASF）是由非洲豬瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）引起的一類烈性動(dòng)物傳染病，主要感染動(dòng)物為家豬、疣豬和野豬[1]。發(fā)病特征主要是廣泛出血、高熱，按照病程長短可分為最急性、急性型、慢性型，最急性型和急性型的發(fā)病病程短，死亡率可達(dá)100%，我國將非洲豬瘟列為一類動(dòng)物傳染病，也是世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（World Organization for Animal Health，OIE）法定報(bào)告的動(dòng)物疫病[2]。非洲豬瘟自2018年8月傳入中國以來，流行面大而廣，給我國的生豬全產(chǎn)業(yè)鏈造成了前所未有的打擊和極大的經(jīng)濟(jì)損失[3]。我國乃至全世界均未研制出有效的非洲豬瘟商業(yè)化疫苗，也沒有可靠的治療藥物，目前對于我國的養(yǎng)豬企業(yè)和養(yǎng)殖戶來說防控非洲豬瘟的有效手段就是做好豬場的生物安全[4]。

養(yǎng)豬場生物安全的核心在于防止外來病原傳入豬場，這也是非洲豬瘟防控的核心所在，豬場需要建立嚴(yán)格的生物安全體系，通過對進(jìn)場的人員、物資、車輛等進(jìn)行一系列的洗消隔離措施，防止非洲豬瘟病毒被攜帶進(jìn)入豬場，同時(shí)養(yǎng)殖企業(yè)甚至養(yǎng)豬場需要建立可靠的熒光PCR實(shí)驗(yàn)室，對受威脅的豬群進(jìn)行全面嚴(yán)格的主動(dòng)監(jiān)測，作為豬場非洲豬瘟疫情預(yù)警的一種基本手段，才能做到及時(shí)發(fā)現(xiàn)疫情，以便采取隔離、撲殺、消毒燈嚴(yán)格的下一步處置措施，防止疫情的進(jìn)一步擴(kuò)大[5]；對日常進(jìn)場的人員、物資、車輛等可能攜帶非瘟病毒的載體進(jìn)行采樣檢測，為科學(xué)了解非瘟病毒傳入豬場的途徑提供依據(jù)，做到有的放矢，重點(diǎn)突出；目前市面上商品化的非洲豬瘟熒光PCR檢測試劑盒品類眾多，但檢測的靈敏度和準(zhǔn)確度卻不盡相同，給使用者帶來不小的困惑和麻煩。為了解不同廠家的非洲豬瘟熒光PCR檢測試劑盒檢測的靈敏度和穩(wěn)定性，使用已知濃度的核酸作為標(biāo)準(zhǔn)樣品，評估非洲豬瘟熒光PCR檢測試劑盒檢測的敏感性和一致性，選擇一種到兩種最優(yōu)的非洲豬瘟熒光PCR檢測試劑盒，以便有目的、有重點(diǎn)地開展相應(yīng)的豬群監(jiān)測，制定合理的采樣程序，同時(shí)也為試劑盒生產(chǎn)廠家改進(jìn)試劑盒提供參考，我們開展了不同廠家非洲豬瘟熒光PCR試劑盒檢測效果的對比試驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 非洲豬瘟核酸檢測試劑盒：使用5個(gè)不同廠家的6種非洲豬瘟核酸檢測試劑盒，分別標(biāo)注為A1、A2、B、C、D、E，具體如表1。

表1 五種不同廠家的非洲豬瘟核酸檢測試劑盒

1.1.2 核酸提取試劑盒：使用某品牌DNA核酸手動(dòng)提取試劑盒

1.1.3 標(biāo)準(zhǔn)陽性核酸樣本：本次試驗(yàn)使用已知陽性的核酸樣品作為待測樣品，經(jīng)熒光定量PCR試驗(yàn)測定的核酸濃度為3×105copies/mL。

1.1.4 試驗(yàn)儀器：本次對比試驗(yàn)使用的主要儀器如表2。

表2 主要儀器

1.2 方法

1.2.1 核酸樣品梯度稀釋：將已知陽性的樣品，將其進(jìn)行10倍的梯度稀釋，每管吹打100次混勻，取100、10-1、10-2、10-3、10-45個(gè)濃度作為待測樣本,分別編號1～5，并設(shè)置3個(gè)平行重復(fù)。

核酸提?。喊凑赵噭┖姓f明書給出的方法對待測品進(jìn)行核酸提取。

1.2.2 熒光PCR反應(yīng)：選取已提取好的核酸樣本，每個(gè)待測核酸樣本設(shè)置3個(gè)平行重復(fù)，并設(shè)置空白對照，按照各試劑盒說明書給出的方法和步驟，進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，具體的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件如表3。

表3 不同試劑盒的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件

1.2.3 各對比因素得分計(jì)算：對每種對比因素進(jìn)行排名，并依據(jù)排名計(jì)算每個(gè)試劑盒的得分，最后按各試劑盒的總得分進(jìn)行最終進(jìn)行對比排名，以排名最低或最高得6分，隨排名升高或降低分別得分54321。（同樣排名時(shí)取同分，其中對比ct值均值時(shí)無ct值的得0分）

2 結(jié)果

2.1 試劑盒檢測原始結(jié)果

從表4和圖1可以看出，6種試劑盒均能檢測到陽性樣品，顯示出不同的ct值，且大部分擁有正常熒光曲線，但仍有部分樣品的檢測雖然有ct值的，沒有表現(xiàn)為正常的指數(shù)型曲線，依據(jù)各試劑盒說明書，判定結(jié)果為陰性。

表4 各試劑盒檢測ct值記錄表

圖1 不同試劑盒熒光PCR曲線

2.2 試劑盒檢測靈敏度

2.2.1 試劑盒檢測出ct值的樣品數(shù)量（正常熒光曲線）

從圖2可以看出，6種試劑盒能夠檢測出ct值且有正常熒光曲線的樣品數(shù)量不一，按檢出數(shù)量由高至低排列依次為試劑盒C（得6分）=試劑盒D（得6分）＞試劑盒A2（得4分）＞試劑盒E（得3分）＞試劑盒B（得1分）=試劑盒A1（得1分）。

圖2 各試劑盒檢測出ct值的樣品數(shù)量圖（正常熒光曲線）

2.2.2 各試劑盒檢出的核酸最低拷貝數(shù)

從表5可以看出，6種試劑盒能夠檢測出的最低核酸拷貝數(shù)不一，按檢出限度量由低至高排列依次為試劑盒C（得6分）=試劑盒D（得6分）＜試劑盒A2（得4分）＜試劑盒E（得1分）=試劑盒B（得1分）=試劑盒A1（得1分），其中試劑盒C和D在本次對比試驗(yàn)中的檢測極限為3×101copies/mL。

表5 各試劑盒檢出的核酸最低拷貝數(shù)對比

2.2.3 各試劑盒在不同稀釋度檢出的ct值平均值對比

從表6可以看出，6種試劑盒能夠檢測出的ct值均值大小不一，經(jīng)計(jì)算，各試劑盒在不同稀釋度檢出的ct值平均值項(xiàng)的得分分別為試劑盒D（5.6）＞試劑盒C（5.2）＞試劑盒A2（2.4）＞試劑盒E（1.4）＞試劑盒B（0.8）＞試劑盒A1（0.4）。

表6 各試劑盒在不同稀釋度檢出的ct值平均值對比

綜合檢出ct值的樣品數(shù)量、檢出的核酸最低拷貝數(shù)和不同稀釋度檢出的ct值平均值三種因素來分析各試劑盒檢測非瘟病毒核酸的靈敏度，并計(jì)算得分的平均值，可以得出靈敏度得分由高至低的排名為試劑盒D＞試劑盒C＞試劑盒A2＞試劑盒E＞試劑盒B＞試劑盒A1，試劑盒D靈敏度最高，試劑盒C次之，試劑盒A2、E處于居中水平，試劑盒B和試劑盒A1靈敏度最低。2.3試劑盒檢測數(shù)據(jù)一致性

從表7可以看出，6種試劑盒能夠檢測出的ct值離散度不一，經(jīng)計(jì)算，各試劑盒在不同稀釋度檢出ct值離散度得分分別為試劑盒D（5）＞試劑盒C（4.8）＞試劑盒A2（3.2）＞試劑盒E（1.2）＞試劑盒B（0.8）=試劑盒A1（0.8）。

表7 各試劑盒同稀釋度檢測ct值的離散度對比

3 最終對比結(jié)果

表8 各試劑盒在不同因素對比時(shí)的得分

通過比較6種試劑盒對已知核酸含量標(biāo)準(zhǔn)樣品的不同稀釋度樣品的檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，試劑盒D和C的檢測靈敏性最高，試劑盒A2次之，試劑盒E處于居中水平，試劑盒B和A1靈敏性最低；從檢出的ct值離散度來判斷各試劑盒檢測的一致性，試劑盒D和C的檢測一性最好，試劑盒A2次之，試劑盒E處于居中水平，試劑盒B和A1一致性最差。

根據(jù)檢出ct值的樣品數(shù)量、檢出核酸最低拷貝濃度、檢出ct值的平均值和檢出ct值的離散度四個(gè)維度的得分來綜合判斷試劑盒，得出的最終結(jié)果試劑盒D的靈敏度和一致性最好，試劑盒C得分稍低，但與試劑盒D差距很小，幾乎在同一水平，試劑盒A2靈敏度和一致性次之，其余三種試劑盒E＞試劑盒B＞試劑盒A1。

4 討論

目前我國在市面上流通的商品化非洲豬瘟熒光PCR試劑盒的廠家眾多，雖然農(nóng)業(yè)部已經(jīng)對部分廠家的非瘟熒光試劑盒進(jìn)行了檢測能力評估，但沒有提供具體的對比數(shù)據(jù)，對于養(yǎng)豬企業(yè)和散養(yǎng)戶來說，他們的檢測實(shí)驗(yàn)室需要設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)化的科學(xué)實(shí)驗(yàn)，從琳瑯滿目、良莠不齊的眾多商品化試劑盒中選擇一款或兩款檢測能力優(yōu)秀的試劑盒來為實(shí)際的防非場景提供依據(jù)，由于實(shí)際的各種限制，這種評估試驗(yàn)在部分企業(yè)尤其是小型養(yǎng)殖場中并不能完成，大多只是在使用時(shí)通過主觀感受或者簡單的數(shù)據(jù)對比來評估試劑盒的檢測效果，本試驗(yàn)從檢出ct值的樣品數(shù)量、檢出核酸最低拷貝濃度、檢出ct值的平均值和檢出ct值的離散度四個(gè)維度來評估對6種試劑盒的敏感性和一致性進(jìn)行數(shù)據(jù)對比，綜合對比6種試劑盒的檢測效果。

從最終對比結(jié)果可以看出，采用50μL體系的試劑盒C、D、A2相較30μL、25μL體系的試劑盒B、A1和E在靈敏度和一致性具有明顯優(yōu)勢，這可能與不同體系加入的樣品量及體系中模板含量有關(guān)，這與王金良[6]等的研究結(jié)論一致；同時(shí)可以看出所有試劑盒對高濃度的核酸進(jìn)行檢測時(shí)都有較好的一致性，6種試劑盒檢測原濃度的核酸（3×105copies/mL）得到的三組ct值的離散度均小于2%，而隨著稀釋倍數(shù)的增加，各試劑盒檢出的ct值逐漸升高，并于不同的濃度將ct值提升為可疑區(qū)間，所有試劑盒在可疑區(qū)間的檢測一致性都相對較差，說明對達(dá)到試劑盒檢測極限前的低濃度核酸進(jìn)行檢測時(shí)，所有試劑盒的檢測結(jié)果都不太穩(wěn)定，需要更換試劑盒進(jìn)行一次或多次復(fù)檢才能得到一個(gè)相對可靠的判斷結(jié)果；在養(yǎng)殖一線的檢測中應(yīng)根據(jù)檢測目的來選擇不同的試劑盒，比如進(jìn)行普遍的豬群篩查時(shí)應(yīng)優(yōu)先使用靈敏度較好的試劑盒進(jìn)行監(jiān)測，對于可疑結(jié)果的復(fù)檢一般應(yīng)優(yōu)先選擇一致性好、特異性強(qiáng)的試劑盒。 □