瘦素對(duì)豬原代脂肪細(xì)胞脂滴相關(guān)基因mRNA 表達(dá)的影響*

何永江，肖 慧，黃 英，楊明華，趙素梅，潘洪彬，劉 琛，彭澤琴

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南省動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650201；2.迪慶藏族自治州民族中等專業(yè)學(xué)校，云南 迪慶 674499；3.滇西科技師范學(xué)院 生物技術(shù)與工程學(xué)院，云南 臨滄 677000）

脂肪細(xì)胞承擔(dān)機(jī)體的能量存儲(chǔ)及供給，以甘油三酯（triglyceride，TAG）為主要形式儲(chǔ)存能量，TAG 脂解為游離脂肪酸（free fatty acids，F(xiàn)FAs）和甘油向外周細(xì)胞供給能量[1]；脂肪細(xì)胞作為內(nèi)分泌細(xì)胞分泌腫瘤因子和瘦素（leptin，LEP）等脂肪因子[2]。LEP 通過下丘腦途徑和外周途徑調(diào)節(jié)脂代謝，抑制外周脂肪合成并調(diào)節(jié)食欲，從而促進(jìn)機(jī)體質(zhì)量減小[3]。同時(shí)，LEP 在機(jī)體質(zhì)量減小后抑制利于機(jī)體質(zhì)量恢復(fù)的代謝、自主神經(jīng)、神經(jīng)內(nèi)分泌和行為適應(yīng)[4]。

脂滴（lipid droplets，LDs）作為第二細(xì)胞器，參與脂質(zhì)的儲(chǔ)存、脂解和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)[5]。LDs 在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形成，其表面由單層磷脂和各類蛋白質(zhì)包裹，形成過程中LDs 的轉(zhuǎn)運(yùn)和TAG 的分配通過誘導(dǎo)脂肪沉積跨膜蛋白（fatstorage-inducing transmembrane protein，F(xiàn)ITM）介導(dǎo)，從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)[6]。大多數(shù)真核生物中，F(xiàn)ITM1主要在肌肉組織表達(dá)，F(xiàn)ITM2 表達(dá)于全身各組織。脂滴包被蛋白1（perilipin 1，PLIN1）在脂肪細(xì)胞的脂解和脂質(zhì)儲(chǔ)存調(diào)節(jié)中起重要作用[7]，基礎(chǔ)狀態(tài)下PLIN1 作為L(zhǎng)Ds 屏障阻止脂肪酶介導(dǎo)的TAG 脂解[8]，脂解刺激下PLIN1 磷酸化[8-9]，促進(jìn)脂解過程。脂滴包被蛋白2（perilipin 2，PLIN2）是一類脂滴蛋白，利于抑制胰島素拮抗和TAG 沉積，促進(jìn)參與小鼠肝臟脂肪和膽固醇生物合成途徑相關(guān)的SREBP-1和SREBP-2靶基因表達(dá)[10]。成熟脂肪細(xì)胞中，基礎(chǔ)狀態(tài)下多數(shù)PLIN2 通過泛素—蛋白酶途徑降解，極少部分定位在LDs 表面[11]。在嵌合蛋白作用下，定位于LDs 表面的PLIN2 N 端與PLIN1 C 端發(fā)生融合，維持LDs 與脂肪酶激活因子α/β 水解酶結(jié)構(gòu)域蛋白5（comparative gene identification-58，CGI-58）的相互作用，抑制基底脂解[12]。研究表明：LEP在皮下前脂肪細(xì)胞中可調(diào)控脂類代謝相關(guān)基因的表達(dá)，調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞TAG 水解和游離脂肪酸的氧化[13-15]，但目前關(guān)于LEP 對(duì)細(xì)胞脂滴相關(guān)基因表達(dá)的研究較少。

本研究以豬原代脂肪細(xì)胞為材料，通過不同質(zhì)量濃度LEP 處理豬原代脂肪細(xì)胞，以TAG 含量以及PLIN1、PLIN2和FITM2mRNA 表達(dá)水平為分析指標(biāo)，探究LEP 對(duì)脂滴相關(guān)基因表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及處理

麻醉放血處死3 頭15 日齡健康狀況良好的三元雜交仔豬（Duroc×Landrace×Yorkshire，DLY），取背部皮下脂肪。試驗(yàn)動(dòng)物來(lái)自云南農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)豬場(chǎng)。

1.2 豬原代脂肪細(xì)胞分離培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化

參照李永能等[15]對(duì)豬皮下脂肪細(xì)胞處理的方法并混合所得脂肪細(xì)胞，用基礎(chǔ)培養(yǎng)基進(jìn)行豬皮下脂肪細(xì)胞分離培養(yǎng)，向誘導(dǎo)分化培養(yǎng)液中添加不同質(zhì)量濃度LEP（0、50、100 和150 ng/mL）誘導(dǎo)分化豬原代脂肪細(xì)胞48 h。在細(xì)胞培養(yǎng)第1 和5 天采集細(xì)胞圖片，并對(duì)加入不同質(zhì)量濃度LEP 誘導(dǎo)分化48 h 后的細(xì)胞進(jìn)行油紅O 染色，觀察細(xì)胞分化結(jié)果。

1.3 TAG 含量測(cè)定

通過氧化酶法對(duì)不同質(zhì)量濃度LEP 處理的豬原代脂肪細(xì)胞進(jìn)行TAG 測(cè)定，操作步驟嚴(yán)格按照甘油三酯試劑盒-TG（酶法）（北京北化康泰臨床試劑有限公司，北京）說明書進(jìn)行。

1.4 總RNA 提取及測(cè)定

分別收集0、50、100 和150 ng/mL LEP 處理48 h 后的豬原代脂肪細(xì)胞，用總RNA 提取試劑盒（離心柱型）[ 天根生化科技（北京）有限公司，北京 ]提取總RNA，每個(gè)處理做3 次平行；采用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA 完整性，通過分光光度計(jì)NanoDrop 2000（Thermo Scientific，美國(guó)）測(cè)定總RNA 含量與純度。

1.5 qPCR 表達(dá)分析

根據(jù)測(cè)定的總RNA 含量，取2 μg 總RNA，用EasyScript First-Strand cDNA Synthesis Super-Mix（全式金生物技術(shù)有限公司，北京）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系20 μL：總RNA 2 μL，Anchored Oligo（dT）181 μL，2×TS Reaction Mix 10 μL，RNase-free water 補(bǔ)全體系；反應(yīng)條件為：37 ℃反轉(zhuǎn)錄60 min，95 ℃滅酶活5 min，其他操作參照說明書進(jìn)行。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物于-20 ℃冰箱保存。目的基因FITM2、PLIN1和PLIN2以及內(nèi)參基因18S rRNA 引物根據(jù)GenBank 豬的基因序列，采用Primer Primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)，由上海生物工程有限公司合成，引物登錄號(hào)及引物序列見表1。qPCR 反應(yīng)體系為20 μL：反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1.5 μL，SYBR?Premix ExTaqTM（寶生物工程有限公司，大連）10 μL，上、下游引物各0.4 μL，ddH2O 補(bǔ)全體系至20 μL。經(jīng)不同質(zhì)量濃度LEP 處理所得細(xì)胞各做6 次重復(fù)，同時(shí)用ddH2O 代替反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物和SYBR?Premix ExTaqTM中含有的熒光試劑，排除外源基因和基因組DNA 污染。反應(yīng)程序?yàn)椋侯A(yù)變性94 ℃ 30 s，94 ℃變性5 s，退火30 s，延伸72 ℃ 10 s，共35 個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。18S rRNA 基因退火溫度為55 ℃；PLIN1、PLIN2和FITM2基因退火溫度為60 ℃。

表1 內(nèi)參基因與目的基因的引物序列、產(chǎn)物長(zhǎng)度和登錄號(hào)Tab.1 Primer sequence,product length and entry number of reference gene and target gene

1.6 數(shù)據(jù)分析

各處理組基因相對(duì)表達(dá)水平以內(nèi)參基因18S rRNA 為參照，計(jì)算不同質(zhì)量濃度LEP 處理下PLIN1、PLIN2和FITM2的相對(duì)表達(dá)量。TAG 含量和qPCR 數(shù)據(jù)經(jīng)初步分析，選擇單因素方差分析模型進(jìn)行計(jì)算：

式中：TAGij為第i水平處理時(shí)細(xì)胞的TAG 含量，GENEij為第i水平處理時(shí)基因的表達(dá)水平；μ為基因表達(dá)水平的總體平均數(shù)；LEPi為L(zhǎng)EP 處理的第i個(gè)效應(yīng)；eij為試驗(yàn)誤差）。

采用SAS 9.2 軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析和描述統(tǒng)計(jì)分析，方差分析結(jié)果通過Duncan 法進(jìn)行多重比較，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 脂肪細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

誘導(dǎo)分化前，細(xì)胞呈成纖維狀（圖1）；豬原代脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化48 h，經(jīng)油紅O 染色，LDs 呈深紅色（圖2）。說明本試驗(yàn)分離細(xì)胞為脂肪細(xì)胞。

圖1 原代脂肪細(xì)胞觀察結(jié)果 (100×)Fig.1 Observation results of primary adipocytes

圖2 油紅O 染色結(jié)果 (400×)Fig.2 Results of oil red O staining

2.2 不同質(zhì)量濃度LEP 對(duì)豬原代脂肪細(xì)胞TAG含量的影響

由圖3 可知：與0 ng/mL LEP 組相比，50和100 ng/mL LEP 可顯著增加豬原代脂肪細(xì)胞TAG 含量（P＜0.05）；與50 和100 ng/mL LEP 組相比，150 ng/mL LEP 可顯著降低豬原代脂肪細(xì)胞TAG 含量（P＜0.05）。

圖3 不同質(zhì)量濃度LEP 下原代脂肪細(xì)胞TAG 含量Fig.3 TAG content of primary adipocytes at different LEP mass concentrations

2.3 不同質(zhì)量濃度LEP 對(duì)PLIN1、PLIN2 和FITM2 基因mRNA 表達(dá)的影響

由圖4 可知：與0 和150 ng/mL LEP 組相比，50 和100 ng/mL LEP 可顯著抑制PLIN1基因mRNA 相對(duì)表達(dá)（P＜0.05）；與0 和50 ng/mL LEP 組相比，100 和150 ng/mL LEP 可顯著促進(jìn)PLIN2基因mRNA 相對(duì)表達(dá)（P＜0.05），LEP 呈質(zhì)量濃度依賴性上調(diào)PLIN2基因mRNA 表達(dá)的趨勢(shì)；與0 ng/mL LEP 組相比，50 和100 ng/mL LEP可顯著促進(jìn)FITM2基因mRNA表達(dá)（P＜0.05），同時(shí)100 ng/mL 為L(zhǎng)EP 促進(jìn)FITM2基因表達(dá)的最佳質(zhì)量濃度。

圖4 不同質(zhì)量濃度LEP 下PLIN1、PLIN2 和FITM2基因相對(duì)表達(dá)水平Fig.4 Relative expression levels of PLIN1,PLIN2 and FITM2 genes at different LEP mass concentration

3 討論

3.1 不同質(zhì)量濃度LEP 對(duì)豬原代脂肪細(xì)胞TAG含量的影響

LEP 由白色脂肪組織分泌，調(diào)節(jié)脂代謝平衡，脂代謝紊亂時(shí)，機(jī)體脂肪合成增加以及分泌功能改變[2]。LEP 通過間接抑制葡萄糖氧化和脂肪生成，減少對(duì)胰島素介導(dǎo)的脂肪刺激，抑制脂肪酸酯化的同時(shí)刺激脂肪酸氧化[16]。相關(guān)研究[13-15]表明：LEP 促進(jìn)豬皮下脂肪細(xì)胞TAG 水解，降低豬皮下脂肪細(xì)胞中的TAG 含量。此外，TOKG?Z 等[17]調(diào)查發(fā)現(xiàn)：肥胖青少年血液LEP 水平與肥胖具有正相關(guān)性；相關(guān)研究[18]通過LEP 治療精神病患者肥胖，患者血清LEP 水平升高，患者皮下脂肪沉積減少。上述研究表明：不同質(zhì)量濃度LEP 對(duì)脂代謝調(diào)節(jié)作用存在差異。

本研究發(fā)現(xiàn)：LEP 對(duì)豬原代脂肪細(xì)胞脂代謝的調(diào)節(jié)作用存在質(zhì)量濃度差異。50 和100 ng/mL LEP 促進(jìn)豬原代脂肪細(xì)胞中TAG 沉積；當(dāng)LEP達(dá)150 ng/mL 時(shí)，LEP 可促進(jìn)豬原代脂肪細(xì)胞中TAG 脂解（與50 和100 ng/mL LEP 組比較）或?qū)ωi原代脂肪細(xì)胞TAG 含量無(wú)顯著影響（與0 ng/mL LEP 組比較）。本試驗(yàn)通過不同質(zhì)量濃度LEP 處理豬原代脂肪細(xì)胞得到不同的結(jié)果，原因可能為150 ng/mL LEP 觸發(fā)了脂肪細(xì)胞的LEP 拮抗[19]，使豬原代脂肪細(xì)胞對(duì)LEP 敏感性降低，導(dǎo)致豬原代脂肪細(xì)胞中TAG 含量無(wú)明顯變化。

3.2 不同質(zhì)量濃度LEP 對(duì)脂滴相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響

機(jī)體內(nèi)脂類物質(zhì)由循環(huán)系統(tǒng)運(yùn)輸至各組織細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)以LDs 的形式沉積。FITM2 負(fù)責(zé)LDs 生產(chǎn)過程中TAG 的分配以及LDs 成熟后由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)[5-6,20]。CHOUDHARY 等[5]測(cè)定哺乳動(dòng)物中FITM2表達(dá)時(shí)發(fā)現(xiàn)：FITM2參與TAG 分配，但與TAG 合成無(wú)關(guān)；過表達(dá)FITM2基因，細(xì)胞中中性脂質(zhì)含量急劇增加。本研究表明：50 和100 ng/mL LEP 在增加豬原代脂肪細(xì)胞TAG 含量的同時(shí)顯著上調(diào)FITM2基因表達(dá)水平，而150 ng/mL LEP 對(duì)豬原代脂肪細(xì)胞TAG 含量以及FITM2基因表達(dá)無(wú)顯著影響。以50 和100 ng/mL LEP 組為參照，結(jié)合上述研究結(jié)果，表明FITM2基因表達(dá)水平的上升與原代脂肪細(xì)胞TAG 沉積相關(guān)。

PLIN1 作為脂滴表面蛋白，對(duì)脂代謝具有雙向調(diào)節(jié)作用。一方面，PLIN1 作為L(zhǎng)Ds 屏障，通過黏附在LDs 表面阻止脂肪酶直接接觸LDs中的TAG，起到保護(hù)LDs 免受脂解的作用[9,21]；同時(shí)，PLIN1 的脂解活性受PLIN1基因甲基化[22]和PLIN1 蛋白磷酸化[11]的影響，抑制或促進(jìn)脂解反應(yīng)發(fā)生。研究證明：PLIN1基因表達(dá)有利于機(jī)體沉積TAG；PLIN1基因缺乏則表現(xiàn)出更多且更小的LDs，導(dǎo)致LDs 與酶的接觸面積增加，促進(jìn)脂解[21]。本研究發(fā)現(xiàn)：當(dāng)LEP質(zhì)量濃度升高至50 和100 ng/mL 時(shí)，豬原代脂肪細(xì)胞TAG 含量顯著增加，降低PLIN1基因的表達(dá)水平；當(dāng)LEP質(zhì)量濃度繼續(xù)升高至150 ng/mL 時(shí)，豬原代脂肪細(xì)胞中TAG 含量顯著低于50 和100 ng/mL 組，而細(xì)胞PLIN1基因表達(dá)水平隨著LEP 質(zhì)量濃度的逐漸升高表現(xiàn)出遞增的趨勢(shì)，與0 ng/mL 組PLIN1基因表達(dá)持平。負(fù)調(diào)控細(xì)胞中PLIN1基因表達(dá)能夠抑制或促進(jìn)細(xì)胞TAG 沉積[8,21]，但PLIN1基因?qū)?xì)胞TAG 代謝可能存在物種差異性。本研究所得結(jié)果與利用小鼠[21]和人[22]脂肪細(xì)胞作為研究材料所得的結(jié)果存在差異，不同的研究方法可能是本研究中PLIN1基因表達(dá)水平與細(xì)胞TAG 含量結(jié)果出現(xiàn)差異的原因。

高能量飲食飼喂條件下，PLIN2基因缺失小鼠避免了高脂飲食導(dǎo)致的肥胖[10]。此外，TAKAHASHI 等[11]誘導(dǎo)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞分化為脂肪細(xì)胞，用慢病毒介導(dǎo)脂肪細(xì)胞PLIN2基因敲除，發(fā)現(xiàn)缺失PLIN2基因的小鼠分化細(xì)胞脂解過程時(shí)間依賴性減弱。本研究表明：LEP 誘導(dǎo)豬原代脂肪細(xì)胞TAG 生成過程中，PLIN2基因表達(dá)呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，并且隨LEP 質(zhì)量濃度的升高，PLIN2基因表達(dá)隨之上升?？梢姡琍LIN2對(duì)細(xì)胞脂解過程的調(diào)控具有雙向性。結(jié)合本研究結(jié)果，表明豬原代脂肪細(xì)胞PLIN2基因的表達(dá)在一定程度上與LEP 質(zhì)量濃度正相關(guān)，且LEP 質(zhì)量濃度為0～100 ng/mL 時(shí)，PLIN2基因表達(dá)表現(xiàn)為促進(jìn)原代脂肪細(xì)胞沉積TAG，而LEP 質(zhì)量濃度達(dá)到150 ng/mL 時(shí)，PLIN2基因表達(dá)表現(xiàn)為促進(jìn)細(xì)胞水解TAG。

4 結(jié)論

LEP 調(diào)節(jié)豬原代脂肪細(xì)胞脂滴相關(guān)基因表達(dá)具有質(zhì)量濃度差異性。50 和100 ng/mL LEP 促進(jìn)豬原代脂肪細(xì)胞中TAG 的沉積，而150 ng/mL LEP 促進(jìn)其降解；LEP 促進(jìn)TAG 沉積過程中，LEP促進(jìn)FITM2和PLIN2基因表達(dá)，降低PLIN1基因表達(dá)；LEP 促進(jìn)脂解過程中，LEP 促進(jìn)PLIN2基因表達(dá)，并有上調(diào)PLIN1基因表達(dá)的趨勢(shì)。